Name: 一种酶和无血清神经干细胞培养模型EMT研究适合药物发现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解神经干细胞体外模型用于上皮间质转化研究的方法，该模型可定量定性评估细胞迁移及基因蛋白表达，适用于药物发现和高通量筛选。

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本研究由巴塞尔大学科学基金会和瑞士国家科学基金会（资助编号：SNF IZLIZ3_157230，授予 MHS 和 AG）提供支持。感谢：Tania Rinaldi Burkat 博士慷慨提供基础设施；Bettler 研究组全体成员在讨论和审阅中提供的意见。感谢 Gerhard Dorne（Leica Microsystems，瑞士）对 Full HD MC170 视频相机（Leica Microsystems，瑞士）进行的专业且熟练的安装。

所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物，第8th版，2011年），并经巴塞尔动物福利委员会（瑞士实验动物护理与使用指南）批准。根据这些指南，该动物实验方案被归类为&#34;最低动物伤害等级&#34;。
1. 扩增培养基的制备
注意：应在无菌条件下操作，这是组织培养的标准要求。
<ol>
	<li>取两个15 ml离心管，从500 ml培养基瓶中分别向这两个15 ml离心管中各加入5 ml无L-谷氨酰胺的DMEM/F12（1:1）培养基。向第一个15 ml离心管中加入50 mg人无转铁蛋白（apo-transferrin）、50 μl 1 M亚精胺储备液（终浓度0.1 mM）和30 μl 500 µM硒酸钠储备液（终浓度30 nM）。
	<ol>
		<li>使用0.2 µm针头滤器过滤，收集至原始的DMEM/F12培养基瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向第二个15 ml离心管中加入12.5 mg胰岛素。加入6–9滴1 M NaOH。涡旋振荡使胰岛素完全溶解。使用0.2 µm针头滤器过滤，收集至原始的DMEM/F12培养基瓶中。 
	注意：NaOH具有毒性和腐蚀性。操作时需佩戴防护手套、防护服和安全护目镜。</li>
	<li>向DMEM/F12培养基瓶中加入5 ml青霉素（10,000单位/ml）/链霉素（10,000 µg/ml）/两性霉素B（25 µg/ml）混合液。</li>
	<li>向DMEM/F12培养基瓶中加入5 ml新鲜解冻的200 mM L-谷氨酰胺储备液，或含谷氨酰胺的寡肽（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）。</li>
	<li>充分摇匀。分装成每份50 ml。 
	注意：扩增培养基可在4 °C下保存至少2周。分装后的管装培养基相比保存在500 ml瓶中的培养基，pH变化更小。</li>
</ol>
2. 传代培养基的制备
<ol>
	<li>向 1 L 无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 培养基中加入 990.85 mg 葡萄糖（终浓度为 5 mM）和 840.10 mg NaHCO3（终浓度为 10 mM）。用 HCl（1 M 储液）调节 pH 至 7.3。使用 0.2 µm 滤器过滤除菌，并分装为每份 50 ml。 
	注意：传代培养基可在 4 °C 下保存至少 4 周。</li>
</ol>
3. 生长因子的制备
<ol>
	<li>制备无菌的含1% BSA的1× PBS（PBS-BSA），或含4 mM盐酸（HCl）的PBS-BSA（PBS-BSA-HCl）。 
	注意：HCl具有腐蚀性和毒性，需采取特殊安全措施（穿实验服、戴护目镜、手套、在通风橱中操作）。</li>
	<li>将10 µg/ml重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）溶于PBS-BSA中（终浓度为10 ng/ml），将10 µg/ml重组人骨形态发生蛋白4（rhBMP4）溶于PBS-BSA中（终浓度为10 ng/ml），将20 µg/ml重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）溶于PBS-BSA-HCl中（终浓度为40 ng/ml）。
	<ol>
		<li>不要进行过滤除菌。分装保存。 
		备注：生长因子分装样品可在-20 °C保存至少2年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞培养皿的包被
<ol>
	<li>将1,875 mg多聚-L-鸟氨酸（PLO）溶于500 ml蒸馏H2O中，配制250倍PLO储备液。使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌，并分装为2 ml每份。 
	注意：这些分装液可在-20 °C保存至少2年。</li>
	<li>将1 mg牛纤维连接蛋白溶于1 ml无菌蒸馏H2O中，配制1,000倍纤维连接蛋白储备液。切勿涡旋，以免导致黏性蛋白凝结。手动轻轻摇晃10分钟。
	<ol>
		<li>室温孵育1小时，期间偶尔摇动。检查是否完全溶解。若需完全溶解纤维连接蛋白，可将溶液加热至低于37 °C。切勿过滤除菌。 
		注意：该溶液可在4 °C保存最多6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用经等离子预处理的塑料细胞培养皿（100 mm或其他实验所需尺寸）。如需评估细胞迁移，使用带有500 µm网格的35 mm培养皿。在5% CO2细胞培养箱中，于37 °C条件下，用2 ml 1倍PLO孵育培养皿过夜（12小时）。随后用2 ml 1倍PBS洗涤两次。</li>
	<li>加入2 ml 1倍纤维连接蛋白（终浓度为1 μg/ml），在5% CO2培养箱中37 °C孵育至少12小时。在接种细胞前去除纤维连接蛋白溶液。 
	注意：包被纤维连接蛋白的培养皿可在37 °C保存至少2周。</li>
</ol>
5. 大脑皮层下室带（SVZ）的标准解剖与制备
<ol>
	<li>通过定时交配获取大鼠胚胎第14.5天（E14.5，Sprague-Dawley）和小鼠胚胎第13.5天（E13.5，C57BL/6）的胚胎。将动物在18:00至次日08:00期间进行交配。交配当天中午定为E0.5。</li>
	<li>使用5%异氟烷和0.8 L/min的氧气流对怀孕动物进行麻醉。用锐利的解剖镊子压迫足掌以检查反应。随后将动物断头处死。避免使用CO2窒息法，因为CO2会影响干细胞的回收。</li>
	<li>通过剖宫产取出胚胎。
	<ol>
		<li>将动物置于仰卧位，并用70%乙醇对毛发进行消毒。使用手术镊和剪刀在子宫上方的下腹部做约8 cm的V形皮肤切口。仅切开带毛的皮肤，保持肌层完整。</li>
		<li>使用新的镊子和剪刀切开肌肉及腹壁肌肉层，进入腹膜腔。</li>
		<li>在下后部腹膜中识别子宫，并通过锐性分离将其从周围组织中完整取出。</li>
		<li>用无菌1×PBS清洗带有胚胎的子宫，并将其置于冰上预冷的1×PBS中。</li>
		<li>在解剖显微镜下（3倍放大，图1B），使用尖头剪刀逐个打开子宫壁以释放胚胎。用一对镊子去除胚胎外壳（图1B）。将胚胎保持在冰上的扩增培养基中。</li>
		<li>通过《发育中大鼠神经系统图谱》5确认正确的发育阶段。正确大小的胚胎如图1B所示。</li>
		<li>进一步通过大鼠前肢（FL）开始出现指状结构来确认胚胎年龄，如图1A所示。 
		注：后肢（HL）尚未出现趾的分离（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行解剖时，将胚胎转移至盛有冰上预冷1×PBS的未包被培养皿中。在体视解剖显微镜下（3至20倍放大）使用经高压灭菌的精细镊子进行操作。 
	注：使用培养皿可防止组织附着于器皿表面，而血浆包被的细胞培养皿则可能发生此类附着。在某些解剖步骤中，使用磨尖的钨丝针或其他类似工具也有帮助。</li>
	<li>从端脑（TEL）与间脑（DI）交界处开始（图1B），用两把镊子同时向头侧和尾侧牵拉，去除头部皮肤和颅骨，以暴露发育中的神经管（图1C）。</li>
	<li>识别中脑-后脑边界（MHB，图1B-D中的黑箭头），该边界将中脑（MES）与菱脑分隔开来。在MHB处或稍下方切断菱脑（图1D，三角箭头）。 
	&#8203;注：MHB处额外的皮下空间有助于在不损伤神经管的情况下去除皮肤。</li>
	<li>在颅底处切断端脑/间脑与面部骨骼之间的连接（图1E），从而获得包含端脑、间脑和中脑（TEL-DI-MES）的组织块（图1F-H）。</li>
	<li>将TEL-DI-MES组织块转移至冰上的扩增培养基中，确保其完全浸没在未包被的培养皿中的扩增培养基内。用一对镊子夹住中脑部分，避免触碰含有神经干细胞（NSCs）的端脑室下区（SVZ）。</li>
	<li>对所有胚胎重复步骤5.5至5.8（图1F-H）。</li>
	<li>将一个TEL-DI-MES组织块转移至新鲜的冰上预冷1×PBS中。沿前部中脑的虚线（图1F-H）切割，将中脑与间脑分离，如图1I所示。</li>
	<li>沿图1F中的虚线切割，将DI与TEL分离。分离后的端脑见图1J。</li>
	<li>沿图1J中的虚线将两个端脑半球分开，得到如图1K所示的两个独立半球。 
	注：左半球在图1L中被放大显示。</li>
	<li>通过未来的室间孔可观察到内侧神经节隆起（MGE，图2A；*）和外侧神经节隆起（LGE，图2A；+）。
	<ol>
		<li>使用镊子或针具，沿MGE与LGE和前皮层（ant-ctx，图2B）交界处做直线切开，穿过皮层、海马（hip）和脉络丛（CP），从而将包括嗅球（ob）在内的前皮层与神经节隆起（GE，图2B、C）分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在尾侧神经节隆起（CGE，图2C、D）与后皮层（图2C）交界处做第二条直线切口，同样穿过皮层、海马和脉络丛。</li>
	<li>将端脑展平，完全去除后极和嗅球（图2D）。识别包含海马和脉络丛的皮层半区（图2C），其定义如前文所述6,7。 
	&#8203;注：海马的神经上皮比皮层更薄。脉络丛含有红色血管。
	<ol>
		<li>将皮层半区从皮层上分离，使剩余皮层的大小与神经节隆起的大小一致（图2D），最终得到一块皮层组织（目标组织）和神经节隆起（GE，图2D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将皮层-GE组织块翻转，使脑室面（内侧）朝下贴附于培养皿表面。 
	注：半球的外表面将面向操作者（图2E），其上附有含血管的脑膜（图2E）。
	<ol>
		<li>用左手将GE固定在培养皿表面，右手（优势手）持镊子剥离脑膜（图2F）。 
		注：这是技术上最具挑战性的步骤，因为脑膜与皮层粘连紧密。在步骤5.13.1和5.14中保持完全平直（非锯齿状）的切口有助于脑膜与皮层的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对另一侧半球及所有胚胎重复步骤5.12至5.16。沿LGE边缘，在距离LGE主直径一半的位置进行切割（图2G, 2H）。分离后的皮层面积约为1.2 mm × 2.4 mm（图2H），包含具有神经干细胞（NSCs）的室下区/生发层。</li>
</ol>
6. 外植体培养物的制备
<ol>
	<li>将皮层切成直径小于 400 µm 的组织块（图 2I）。将 400 µm 网格（补充图 1）置于解剖用培养皿下方作为参考（图 2H 和 图 2I）。将所有组织块转移至盛有冰冻扩增培养基的新培养皿中。</li>
	<li>从组织培养皿中去除纤连蛋白（步骤 4.4）。使其自然干燥。向直径为 35 mm、网格尺寸为 10 mm × 10 mm 的培养皿中央加入 1 ml 冷扩增培养基（图 3）。让培养基形成球形液滴（图 3）。</li>
	<li>将最多 8 个组织块插入液滴中心。为便于迁移分析（见第 8 节），组织块应理想地位于网格上，且彼此之间至少相距 3 mm。</li>
	<li>将培养皿置于细胞培养箱中孵育约 1 小时（37 °C，21% O2，5% CO2），以使组织块贴附。让组织块自然沉降并贴附于纤连蛋白包被的表面。切勿振荡培养皿，以免组织块脱落并偏离最佳网格中心位置。</li>
	<li>孵育 1 小时后（37 °C，21% O2，5% CO2），向培养皿中补充培养基至总体积为 2 ml 扩增培养基，并加入待测试的生长因子或目标物质，继续孵育。 
	注意：组织块制备过程中无需酶消化、血清处理或离心步骤。此方法有利于维持细胞完整性。</li>
</ol>
7. 神经干细胞单细胞培养的制备
<ol>
	<li>将扩增和传代培养基在 37 °C 预热。</li>
	<li>将解剖得到的皮质组织块（来自步骤5.17）转移至含有冷的扩增培养基的15 ml离心管中（管A）。在1,200 × g条件下离心5分钟。吸除上清液。加入200 µl预热的扩增培养基重悬皮质组织块。</li>
	<li>向含有组织沉淀的15 ml离心管（管A）中加入700 µl预热的传代培养基，使用P1,000移液器吸头。轻柔重悬沉淀。将吸头置于15 ml离心管底部，用P1,000吸头缓慢、轻柔地吸取三次，以解离组织块。 
	注意：传代培养基可促进细胞分离，避免使用酶。</li>
	<li>让离心管静置30至60秒，使较大（较重）的未解离组织块沉降到管底。单个解离的细胞将保留在上清液中。将约700 µl上清液转移至新的15 ml离心管（管B）中。</li>
	<li>重复步骤 7.3 和 7.4 以解离较大的组织块。</li>
	<li>重复步骤 7.3 和 7.4 一次，以进一步解离较大的组织块。将所有上清液转移至新的 15 ml 管中（管 B）。</li>
	<li>加入扩增培养基至终体积5 ml。使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过台盼蓝染色评估死细胞。 
	注意：小型神经干细胞（NSCs）比大型细胞更能耐受步骤 7.2 至 7.6。预计每 10 个胚胎可获得约 4 × 106 含10%死细胞的细胞</li>
	<li>为扩增NSCs，接种1.5 × 106 每10 cm纤维连接蛋白包被的组织培养皿中加入8 ml扩增培养基，接种相应数量的细胞。常规扩增时，添加8 µl 1,000倍浓缩的重组人FGF2（rhFGF2）原液。每天添加8 µl rhFGF2，每隔一天更换培养基。 
	注意：在此发育阶段，皮层主要含有神经干细胞（NSCs），仅含有少量分化细胞。这些少量的分化细胞对重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）处理无反应，并在扩增培养过程中死亡。</li>
	<li>60% 汇合度下扩增的神经干细胞
	<ol>
		<li>传代NSCs时，移除扩增培养基，用5 ml传代培养基快速洗涤细胞3次，静置2–4分钟，无需Ca2+ 和 Mg2+ 细胞会缓慢地从表面脱离并变圆。在相差显微镜下确认细胞是否已脱离。如有需要，继续等待数分钟，直至观察到细胞完全从表面脱离。 
		注意：单个细胞将完全脱落，但大多数细胞仍会附着在培养皿表面。细胞脱落所需时间取决于纤连蛋白包被的持续时间。较短时间的纤连蛋白包被（12小时或更短）会导致细胞更快脱落。对于较长时间的实验（&#62; 建议使用超过24小时的纤连蛋白包被（1周）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用10 ml移液管轻轻将细胞从表面脱离。收集含有细胞的5 ml传代培养基，并转移至新的15 ml离心管中。再用额外的5 ml传代培养基重复此步骤。</li>
	<li>用移液器将15 ml离心管中的细胞轻轻吹打3次以解离细胞，移液时将10 ml移液器置于管底。在室温下以1,200 x g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于2 ml扩增培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数，并用台盼蓝染色评估死细胞比例。 
	&#8203;注意：扩增至 60% 融合度后，预计可获得 4 - 5 x 106 细胞死亡率约为10%。</li>
	<li>接种 8 × 105 每10 cm培养皿接种细胞，用于后续传代。</li>
</ol>
8. 迁移能力评估
<ol>
	<li>进行迁移评估时，按照第5节所述方法分离外植体。将外植体接种至35 mm带网格的培养皿中。接种后1小时，加入FGF2（rhFGF2）。将培养皿置于37 °C培养箱中培养2天。 
	&#8203;注意：为确保外植体最佳贴壁效果，请避免移动培养皿。</li>
	<li>使用1,000 µl枪头吸除培养基。从内圈开始，用1,000 µl枪头分次加入共2 ml扩增培养基（图3），以降低外植体表面张力。</li>
	<li>根据实验需求单独或联合添加生长因子。以FGF2/BMP4/TGFβ1作为阳性对照。注意：本实验中，每个35 mm培养皿分别单独或联合添加2 µl FGF2、2 µl BMP4和4 µl TGFβ1（图5）。
	<ol>
		<li>添加其他因子和/或待测物质。再次将培养皿静置，在37 °C下继续培养2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在倒置显微镜下拍摄外植体图像。 
	注意：活体外植体的相差成像效果优于固定后的细胞，但两者均可使用。</li>
	<li>进行迁移评估时，使用支持像素测量的图像分析软件（例如，Fiji8）。</li>
	<li>测量培养皿中500 µm网格间距对应的像素值，并将其作为内部参照标准。</li>
	<li>以外植体中心定义为迁移起始点，测量外植体中心与最外侧10个细胞组成的细胞群之间的距离。 
	注意：所有细胞均从外植体向外呈离心方向迁移。在本实验条件下，细胞在周边自发形成片状结构（图5）。</li>
</ol>
9. 侵袭能力评估
<ol>
	<li>根据第4节方案制备纤维连接蛋白包被的组织培养24孔板。</li>
	<li>向细胞侵袭小室的上室中加入300 µl预热的扩增培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。</li>
	<li>移除上室中的扩增培养基，并将Boyden小室放入已包被的24孔板中。</li>
	<li>在下室中加入500 µl预热的扩增培养基，并加入0.5 µl rhFGF2和0.5 µl rhBMP4。</li>
	<li>按第7节所述方法传代神经干细胞（NSCs）并进行计数。第1至第4代细胞适用于本实验。</li>
	<li>在Boyden小室的上室中，加入300 µl预热的扩增培养基，其中含有5 × 105个细胞、0.3 µl rhFGF2和0.3 µl rhBMP4。</li>
	<li>将接种的NSCs培养24小时。</li>
	<li>向小室中添加额外因子和/或待测物质，继续培养细胞48小时。 
	注意：若细胞具有侵袭性，它们将从上室穿过基底膜层迁移至下室，并附着在Boyden小室底部。</li>
	<li>按照试剂盒制造商提供的方案操作。使用侵袭实验试剂盒中包含的棉签，清洗上室两次，以去除未发生侵袭的细胞。</li>
	<li>移除孔内培养基，每孔加入500 µl扩增培养基，其中含有活细胞质膜染料及核染料DAPI。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。 
	注意：染料将分别整合至侵袭性细胞的质膜和细胞核中，以实现最佳可视化效果8。可选：若计划进行多色免疫细胞化学染色，可省略质膜染料。</li>
	<li>移除含染料的培养基，用扩增培养基洗涤两次。使用倒置荧光显微镜观察并计数侵袭细胞，方法如前所述8。 
	注意：部分侵袭细胞可能已从室底脱落并沉降至下方孔板表面，附着于包被表面。为获得完整分析结果，应将孔板表面的细胞一并计入。</li>
	<li>移除培养基，用预冷的新鲜4% PFA固定细胞10分钟，用1× PBS洗涤3次。对侵袭细胞进行免疫细胞化学染色，步骤如前所述8-10。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究描述了一种利用神经干细胞（NSCs）进行上皮-间质转化（EMT）分析的标准化体系（总结见补充图3）。该标准化体系确保了实验的可重复性（表1和表2）。这些神经干细胞来源于发育中的大脑皮层，而该组织在正常情况下不会发生EMT，因此有利于研究EMT的早期阶段。相比之下，肿瘤细胞因累积了多种遗传改变，可能已具备EMT特征，难以用于研究EMT的初始步骤。此外，大多数恶性肿瘤具有异质性，包含侵袭性和非侵袭性细胞，因此原发性肿瘤样本也不适合用于EMT机制的研究。本方案为EMT研究者提供了一种研究EMT诱导早期事件的新模型。本文结果显示，Zeb和Twist家族的关键EMT诱导因子是依次被激活的：在第一阶段，Zeb1和Zeb2表达上调；在第二阶段，Twist2表达上调（图6）。此前我们已证明，Snail1在BMP4处理数小时后即被上调8。我们还发现，在BMP4作用下，中枢皮层来源的神经上皮干细胞可分化为表达平滑肌肌动蛋白（SMA）和钙调蛋白（calponin）的间充质细胞9。上述结果进一步完善了先前的研究...

在胚胎发育的多个阶段，上皮细胞会失去彼此之间的强黏附性（例如，紧密连接），并获得迁移表型，这一过程称为上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）1。EMT 对于生成多种新细胞类型至关重要，例如间充质来源的神经嵴细胞，这类细胞从神经上皮中分离出来2。EMT 不仅在胚胎发育过程中必不可少，也在成体生命后期维持机体生理过程（如伤口愈合3以及脱髓鞘病变中中枢神经系统（CNS）的再生4）中发挥重要作用。
上皮性肿瘤已知会重新激活上皮-间质转化（EMT），作为迁移、侵袭和转移的起始步骤，最终导致癌症进展1,3。事实上，EMT 与强烈的迁移能力密切相关1,3。然而，细胞在准备、启动、经历和维持 EMT 过程中的具体步骤尚未完全阐明，仍需进一步研究。
此处，一种标准化的 体外 基于神经干细胞（NSCs）的EMT模型系统，采用明确的生长因子和培养基（无血清、无需酶）构建。该模型系统对从事EMT研究的科研人员具有重要意义。Snail、Zeb和Twist蛋白家族已被证实无论在发育过程还是疾病状态下均对EMT起关键作用1蜗牛（Snail）、Zeb 和 Twist 家族也参与了该系统。该系统基于前脑的一个特定区域，该区域通常不发生上皮-间质转化（EMT），从而为研究 EMT 诱导初期事件提供了独特优势。
该模型系统有可能被用于研究中枢神经系统以外上皮组织中的上皮-间质转化（EMT），因为关键的EMT诱导因子（如Snail、Zeb和Twist蛋白）在中枢神经系统外组织系统的EMT过程中同样存在。该模型系统可实现从发育中的大脑皮层中标准化地分离神经干细胞（NSCs），从而用于研究干细胞的一般特性以及上皮-间质转化的具体机制。利用该系统，我们分离了神经干细胞，诱导其发生上皮-间质转化，并研究了在FGF2和BMP4作用下细胞的后续迁移行为。我们观察到，FGF信号通路和BMP信号通路与TGFβ信号通路相互作用，促进细胞迁移，从而验证了该模型系统的有效性。

<table><tbody><tr><td>BMP4, rhBMP4</td><td>RnD Systems&amp;nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Boyden 小室，CytoSelect 细胞侵袭检测</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110</td><td>24 孔板系统</td></tr><tr><td>带网格的细胞培养皿</td><td>Ibidi 500 mm 培养皿，35 mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>细胞膜染料，使用浓度为 1:1,000。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>储存浓度为 5 mg/mL，使用浓度为 1:10,000。具有致癌性，需采取适当防护措施（手套、实验服、护目镜）。</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 培养基瓶装</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD Systems</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白，牛源</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 添加剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>具备像素测量功能的图像处理软件</td><td>Fiji</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>版本 2.0.0-rc-30/1.49s</td></tr><tr><td>HBSS 培养基</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>人脱铁转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>可能引起肺部刺激，避免吸入，需采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nestin，小鼠抗 Nestin 抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>使用浓度为 1:100，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>Olig2，兔抗 Olig2 抗体</td><td>由 Hirohide Takebayash 提供</td><td>个人库存</td><td>使用浓度为 1:2,000，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/制霉菌素</td><td>Gibco Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanin，小鼠抗 Podoplanin 抗体</td><td>Acris</td><td>DM3614P</td><td>使用浓度为 1:250，4% 多聚甲醛固定，避免使用 Triton X100</td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P5780</td><td>对皮肤和眼睛有刺激性，需采取适当防护措施。</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10，兔抗 Sox10 抗体</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td><td>使用浓度为 1:200，4% 多聚甲醛固定，Triton X100 浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>TGFb1, rhTGFb1</td><td>RnD Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>未包被的培养皿</td><td>Falcon Corning</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于emt研究

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞转分化为间质细胞的过程。EMT 是胚胎发育过程中的基本事件，也常见于胶质母细胞瘤——最常见的一种恶性脑肿瘤。此外，EMT 还见于多种颅外癌瘤，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌。EMT 通过促进细胞迁移、侵袭及转移形成，在恶性肿瘤的发生发展中起核心作用。然而，EMT 诱导机制尚未完全阐明。本文描述了一种 体外 标准化分离皮层神经干细胞（NSCs）及后续EMT诱导的系统。该系统具有灵活性，可选择使用单细胞或组织块培养。在此系统中，大鼠或小鼠胚胎前脑NSCs在无血清、无酶的限定培养基中培养。NSCs表达Olig2和Sox10，这两种转录因子在少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中可见。利用该系统，可研究FGF、BMP与TGFβ信号通路之间的相互作用 Zeb1, Zeb2，以及 Twist2 在TGFβ激活显著增强细胞迁移的区域观察到上述现象，提示BMP与TGFβ之间存在协同相互作用。结果表明，FGF、BMP和TGFβ信号通路网络参与了EMT的诱导与维持。该模型系统适用于研究EMT 体外成本低廉且具有高度可重复性。该模型还允许对不同化合物的迁移反应进行比较（定量距离测量），以及对抑制或增强EMT的化合物进行高通量筛选（定性测量）。因此，该模型非常适合用于药物库中影响EMT物质的检测。

该EMT模型系统基于从发育中的神经管特定区域——中央皮质——以单细胞或组织块形式标准化分离神经干细胞（NSCs）（图1和图2）。为进行定量评估，将组织块直接接种于500 µm网格培养皿的中心位置（图3）。来自中央皮质的组织块首先在FGF2中培养两天，随后在不同组合的生长因子中继续培养两天（表1）。我们选择中央皮质作为起始区域，因其体积大于发育中神经管的其他区域。我们观察到，只有在BMP4中培养的组织块表现出迁移反应（表1和补充图2）。
接下来在特定条件下分析了podoplanin（PDPN）的表达。PDPN是一种跨膜唾液酸黏蛋白样蛋白，已被发现与多种癌症的侵袭性相关11,12 ，也在神经干细胞（NSCs）中具有类似作用8...

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外 一种无血清且不含酶的模型被描述。该标准化系统可用于细胞迁移、基因和蛋白表达的定性与定量评估。该模型适用于药物发现。

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）描述了上皮组织转分化为间充质组织的过程。EMT 是发育过程中的一种基本过程，在……

本实验的总体目标是诱导通常不具迁移能力的细胞产生迁移，以鉴定能够激活或抑制细胞迁移的特定化合物。该方法有助于解答细胞迁移与侵袭领域的关键科学问题，尤其对从事神经干细胞研究的科研人员具有重要意义。该技术的主要优势在于，能够在非迁移性和非侵袭性细胞向迁移性和侵袭性状态转变的过程中对其进行动态分析。该技术的应用前景包括鉴定能够阻断上皮-间质转化（EMT）的新型化合物，这种转化过程发生在被认为起源于神经干细胞的人类高级别胶质瘤中。尽管该方法可为研究EMT和神经干细胞提供见解，但也可用于研究其他上皮性癌症，如乳腺癌、肺癌或结肠癌。在胚胎发育第14.5天，通过观察大鼠前肢开始形成指状结构来确认大鼠胚胎的正确发育时期。接下来，将胚胎转移至装有冰冷 PBS 的未包被的单个培养皿中，并置于体视显微镜下。使用一对尖头镊子去除胚胎外壳。将胚胎保存在冰上的扩增培养基中。使用两把经过高压灭菌的精细镊子，从正在发育的端脑与间脑交界处开始，同时向头侧和尾侧牵拉，以去除头部的皮肤和颅骨。随后，辨认分隔中脑与菱脑的中脑-菱脑边界，并在该边界处或略下方切断菱脑。用一对镊子夹住中脑组织块，在颅底处剪断端脑、间脑与面部骨骼之间的连接，将包含端脑、间脑和中脑的组织块浸入置于冰上的未包被培养皿中的扩增培养基中。当所有神经组织块均以相同方式获取后，在显微镜下将一个端脑、间脑和中脑组织块转移至新鲜的冰冷 PBS 中。为分离中脑与间脑，首先切断间脑与端脑之间的组织，随后分开两个端脑半球，并通过未来室间孔所在位置辨认可见的内侧和外侧神经节隆起。沿内侧和外侧神经节隆起与前部皮层交界处作一直线切开，随后通过皮层、海马和脉络丛作另一直线切开。在尾侧神经节隆起与后部皮层交界处，通过皮层、海马和脉络丛作第二条直线切开。然后展平端脑，辨认包含海马和脉络丛的皮层镰结构。将皮层半球从皮层中分离，使皮层的大小与神经节隆起的大小保持一致。将皮层-神经节隆起组织块翻转，使脑室面接触培养皿表面，软脑膜朝上。用一只手将神经节隆起固定在培养皿表面，另一只手用镊子剥离软脑膜。然后，沿外侧神经节隆起切开每个皮层组织，切口长度约为外侧神经节隆起直径的一半。为制备外植体培养物，将皮层组织切成直径小于400 µm的外植体，必要时可参考解剖皿下方放置的400 µm网格作为尺寸参照。随后，将所有外植体转移至含有冰冻扩增培养基的新培养皿中。接下来，从预先包被的35毫米组织培养皿中去除多余的纤连蛋白，并让培养皿干燥。然后，将包被有纤连蛋白的培养皿置于10×10毫米的网格上方，在培养皿中央加入1毫升冷的扩增培养基，使培养基形成一个球形液滴。将最多八个组织外植块放置于液滴中心，每块组织之间至少保留3毫米的间距。然后，小心地将培养皿放入细胞培养箱中，避免振荡，以使外植块附着在纤维连接蛋白包被的表面。一小时后，向培养皿中加入培养基至终体积为2毫升，其中包含扩增培

an-enzyme-serum-free-neural-stem-cell-culture-model-for-emt

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发育生物学

一种酶和无血清神经干细胞培养模型EMT研究适合药物发现

本视频介绍了从胚胎小鼠发育中的大脑皮层分离神经前体细胞的方法。展示了从子宫中取出胚胎、解剖皮层组织以及消化分离出的大脑皮层的操作过程。...

小鼠神经干细胞前体的培养

本视频方案演示了如何利用神经球实验从胚胎第14天小鼠脑的神经节隆起中分离并扩增神经干细胞。...

利用神经球实验建立小鼠胚胎神经干细胞培养

本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。...

从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

从成年大脑中分离获取的神经干细胞正越来越多地应用于神经系统发育的基础研究，以及再生医学中潜在临床应用的探索。因此，严格控制这些细胞的分离和培养条件，对于获得可靠的实验结果至关重要。...

从成年啮齿类动物脑内常规和非常规区域培养神经干细胞

本方案描述了两种 体外 基于人类胚胎干细胞和转录组研究的发育毒性测试系统（UKK 和...

基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

本文描述了一种定制方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为特定的高纯度神经元群体，这些神经元具有功能性的突触并表现出网络活动特征。电生理学分析表明，在暴露于A至G型肉毒神经毒素及破伤风神经毒素后，突触传递功能丧失。...

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

本文报道了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立三维（3-D）培养体系的方案，称为无血清拟胚体（SFEB）。该三维模型可类似于器官型脑片培养，用于模拟人类大脑皮层发育过程，并对发育中的神经环路进行生理学研究。...

开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

了解神经干细胞体外模型用于上皮间质转化研究的方法，该模型可定量定性评估细胞迁移及基因蛋白表达，适用于药物发现和高通量筛选。

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