Name: 实时多细胞动力学延长时间推移活体成像在肿瘤微环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习使用活体双光子显微镜技术对肿瘤微环境进行实时、高分辨率延时成像，观察血管通透性及多细胞相互作用动态过程。该方法可精确测量肿瘤生物学事件的动力学特征。

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本研究由美国国防部乳腺癌研究计划（资助号：A.S.H, W81XWH-13-1-0010）、美国国立卫生研究院（NIH）CA100324、&#160;PPG CA100324&#160;以及综合影像项目资助。

所述所有操作必须遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并须事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 生成荧光标记的肿瘤和肿瘤相关巨噬细胞
<ol>
	<li>通过将小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列驱动多瘤病毒中T抗原表达的自发性、同源性、基因工程小鼠乳腺癌模型（MMTV-PyMT）与携带荧光报告基因的转基因小鼠杂交，获得荧光标记的肿瘤细胞即， 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、增强型青色荧光蛋白（ECFP）或 Dendra28,9.</li>
	<li>通过将遗传工程小鼠模型与髓系和巨噬细胞特异性荧光报告系统杂交，在PyMT动物中用荧光标记的肿瘤细胞对巨噬细胞进行荧光标记即， MacGreen15 或 MacBlue 小鼠 Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP16] .</li>
	<li>或者，通过原位移植荧光标记的PyMT肿瘤细胞（同源移植）、人乳腺癌细胞系或来源于患者的原发性人肿瘤组织（异种移植）来生成荧光标记的肿瘤11,17.
	<ol>
		<li>将荧光标记的PyMT肿瘤细胞植入带有荧光蛋白标记髓系细胞的同系小鼠体内，以构建肿瘤细胞和髓系细胞均带有荧光标记的动物模型13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在活体成像开始前2小时，通过静脉尾静脉注射将100 µl浓度为10 mg/kg的荧光标记70 kDa葡聚糖注入携带人细胞系异种移植瘤或患者来源原发性肿瘤的重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内，以荧光标记巨噬细胞。</li>
</ol>
2. 显微镜设置与成像准备
注意：本步骤描述了在多光子显微镜上进行活体成像的设置过程8。
<ol>
	<li>开启所有显微镜和激光组件，包括双光子激光器和探测器。</li>
	<li>将加热箱设定为 30 °C，以预热载物台。此步骤对于维持动物的生理温度至关重要。</li>
	<li>若在倒置显微镜上使用，请将定制的载物台插件放置在显微镜载物台上。该定制插件是一片厚度为 1/8&#34; 的铝制板材，经精密加工以适配载物台插槽，并在其中心设有直径为 1&#34; 的通孔，用于成像。
	<ol>
		<li>用 70% 乙醇擦拭显微镜载物台和载物台插件，然后自然晾干。</li>
		<li>在 20X、1.05&#160;NA 显微镜物镜上滴加一大滴水，以保持与盖玻片的光学接触。</li>
		<li>将盖玻片（#1.5 厚度）覆盖在载物台插件的成像孔上，并用实验室胶带固定。</li>
		<li>使用打孔器在一块柔性橡胶垫上打出一个 2 cm × 2 cm 的孔，然后将橡胶垫放置在显微镜载物台上，确保橡胶垫上的孔与定制载物台插件上的孔对齐。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像过程中尾静脉导管及注射试剂的准备
<ol>
	<li>截取一段30 cm长的聚乙烯（PE）导管。</li>
	<li>使用镊子将31 G针头的金属针在塑料接头上前后移动，直至其断裂脱落。</li>
	<li>使用镊子将脱落的针头钝端插入PE导管中。</li>
	<li>将一根31 G针头插入PE导管的另一端。</li>
	<li>用1 cc注射器吸取无菌磷酸盐缓冲液（PBS），将其连接到31 G针头上，并用PBS冲洗导管和针头中的所有空气。PBS用于维持水合作用和血液渗透压9,18，但也可使用等渗盐水。</li>
	<li>用1 cc注射器吸取200 µl浓度为3 mg/kg的155 kDa右旋糖酐-四甲基罗丹明（TMR）或用于血管标记的量子点。</li>
	<li>准备其他可注射蛋白，例如将血管内皮生长因子A的165个氨基酸亚型（VEGFA165）用1 cc注射器配制后置于冰上。以0.05 mg/ml的浓度注射0.2 mg/kg的VEGFA16519。</li>
</ol>
4. 植入留置尾静脉导管
<ol>
	<li>使用5%异氟烷（以O2为载气）的诱导麻醉舱对动物进行麻醉。</li>
	<li>当小鼠完全麻醉且对脚趾夹捏无反应时，将其转移至手术平台。</li>
	<li>打开通往手术平台的异氟烷麻醉管路，关闭通往诱导麻醉舱的管路，将鼻罩置于动物鼻部，并将异氟烷浓度从5%降低至2.5%。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。</li>
	<li>在加热灯下对动物额外加热2分钟，以促进尾部血液循环，因为深度麻醉会减缓血液循环。</li>
	<li>用70%乙醇对小鼠尾静脉进行消毒。</li>
	<li>将第3节中制备的导管所连接的31 G针头尖端插入动物的侧尾静脉，并推进针头2-3 mm。</li>
	<li>回抽注射器以观察回血，确认导管已正确置入尾静脉。</li>
	<li>使用一段1 cm长的实验室胶带覆盖针头，将针头固定在与静脉平行的位置，沿尾部长度方向固定。</li>
</ol>
5. 暴露乳腺肿瘤的皮瓣手术操作
<ol>
	<li>将动物置于手术台上后，用70%乙醇擦拭肿瘤及腹侧表面。&#160;注意：如前所述，本操作并非完全无菌进行。&#160; 对于长时间成像实验，若感染可能成为干扰因素，建议采用规范的无菌操作技术。</li>
	<li>使用无菌镊子提起腹侧皮肤，并用无菌剪刀沿腹中线做一长约1 cm的皮下切口。切口时避免穿破腹膜。</li>
	<li>轻轻剪开将乳腺组织及肿瘤与腹膜相连的结缔组织，以暴露乳腺肿瘤。</li>
	<li>使用剪刀和镊子，轻柔地去除并剪除肿瘤暴露表面的筋膜和脂肪组织，同时保持肿瘤血管系统的完整性，并尽量减少出血。此步骤对于维持肿瘤结构及其血液供应至关重要。</li>
</ol>
6. 显微镜检查的动物准备
<ol>
	<li>将动物转移至预热的成像载物台上，使暴露的肿瘤置于载物台插入件的盖玻片上，并位于显微镜物镜上方以进行成像。转移动物时需小心操作尾静脉导管，避免针头移位。</li>
	<li>将麻醉鼻罩罩住动物的口鼻部位，维持3%异氟烷的麻醉状态。</li>
	<li>调整动物位置，使肿瘤位于橡胶垫的孔洞中，并与玻璃盖玻片接触。</li>
	<li>使用两块橡胶垫轻轻固定肿瘤，并用实验室胶带将其固定在显微镜载物台上，以减少图像采集过程中的移动。</li>
	<li>通过橡胶垫上的腔室加入PBS，以保持组织湿润并维持与盖玻片的光学接触。</li>
	<li>使用脉搏血氧仪探头开始监测动物的生命体征。将夹式传感器连接至动物的大腿部位；也可选用适合颈部佩戴的颈圈式传感器。</li>
	<li>将加热箱罩在动物上方，维持温度在30 °C 20。</li>
	<li>缓慢将异氟烷浓度降低至0.5–1%，以维持麻醉状态并保证血流稳定。</li>
</ol>
7. 荧光染料和可注射蛋白的成像采集与注射
<ol>
	<li>使用显微镜目镜聚焦于肿瘤表面的荧光肿瘤细胞。</li>
	<li>通过寻找具有流动血管的区域来选定感兴趣区域。选择含有流动血管的感兴趣区域对于评估肿瘤血管系统至关重要。</li>
	<li>选定感兴趣区域后，将显微镜切换至多光子成像模式。</li>
	<li>设置z系列的上限和下限。通过调节焦距将物镜移动至期望的起始位置，并点击Z位置&#34;Top&#34;按钮来设定z系列的上限。通过在二次谐波生成（SHG）通道中观察肿瘤表面的胶原纤维网络，并确认仅可见胶原纤维而无细胞时，确定z系列的上限。
	<ol>
		<li>将物镜移动至期望的成像深度（通常为50 - 150 µm），然后点击Z位置&#34;Bottom&#34;按钮，设定z系列的下限。</li>
		<li>在步长设置栏中输入所需数值以设定步长。根据分辨率和采集时间的权衡来确定步长（通常高分辨率三维重建使用2 µm，其他情况使用5 µm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切换至时间推移成像面板，在时间推移字段中输入所需的时间间隔。为获得最佳时间分辨率，可将时间间隔设为0秒以进行连续成像。注意：对于长时间时间推移成像，建议在每次采集之间设置10秒的时间间隔，以便补充物镜浸没液。</li>
	<li>在确定成像参数后，缓慢注射155 kDa葡聚糖-TMR。
	<ol>
		<li>从尾静脉导管中移除含有PBS的注射器，更换为含有155 kDa葡聚糖-TMR的注射器，注意避免向管路中引入气泡。</li>
		<li>将155 kDa葡聚糖-TMR缓慢注入小鼠体内，最大体积为200 µl，随后更换回含有PBS的注射器。关键步骤：注射过程必须缓慢，并采取预防措施避免溶液外渗至血管外。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击Z-Stack和Time-Lapse按钮使其处于按下状态，然后点击记录按钮，开始Z轴堆栈时间推移成像的采集。</li>
	<li>如果已预先准备其他荧光葡聚糖，例如，10 kDa葡聚糖-异硫氰酸荧光素（FITC），或蛋白质，例如，VEGFA165，可在图像采集开始后立即注射，以实现t = 0 min的时间起点。
	<ol>
		<li>从尾静脉导管中移除含有PBS的注射器，更换为含有10 kDa葡聚糖-FITC或VEGFA165的注射器，注意避免向管路中引入气泡。</li>
		<li>通过尾静脉导管将上述试剂缓慢注入小鼠体内，随后更换回含有PBS的注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔30-45分钟，缓慢注射50 µl PBS或生理盐水，以维持动物的水合状态。</li>
</ol>
8. 安乐死
<ol>
	<li>图像采集结束后，对动物实施安乐死。
	<ol>
		<li>将异氟烷浓度提高至 5%。</li>
		<li>维持动物在 5% 异氟烷下，直至呼吸停止后 30 秒，然后将动物从成像台上移除。</li>
		<li>实施颈椎脱位以确保完全安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 图像处理
<ol>
	<li>在每个时间点，以16位TIFF文件格式分别采集各通道的图像，并按顺序保存。</li>
	<li>使用ImageJ中既定的方法9，对光谱重叠（即，GFP与CFP）进行分离，消除x-y轴漂移，并生成延时序列的视频。对高分辨率图像进行3D表面重建13。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肿瘤微环境中自发发生的细胞相互作用可导致肿瘤细胞运动性及内渗行为的改变。对活体肿瘤组织进行高分辨率活体成像，能够可视化呈现那些具有高度瞬时性的多细胞动态过程10,13,24终点 体内 离散时间点获取的检测数据或延时成像图像可提供有关肿瘤微环境中分子机制的关键信息。活体成像研究已被用于观察肿瘤微环境中持续数天的生物学过程，为血管生成、肿瘤细胞迁移以及对药物治疗的反应等提供了新的认识。25-30然而，由于所研究过程的时间尺度限制，这些检测方法可能无法捕捉肿瘤微环境中瞬时事件的动力学特征7,31区分多个瞬时事件与恒定过程是活体显微镜的一大显著优势。
本方案中描述的活体成像技术可通过荧光标记多种细胞谱系和结构，直接观察肿瘤微环境中的细胞动态。相较于单光子共聚焦显微镜，多光子显微镜能够实现更深层的成像，常规成像深度可达300 µm24。以2 µm为步进、采集50 - 100 µm的Z轴序列图像，其分辨率足以对细胞间的相互作用（包括细胞相互延伸时形成的突起）以及肿瘤微环境中的血管结构进行三...

研究表明，肿瘤细胞从原发性乳腺肿瘤的扩散不仅涉及肿瘤细胞本身，还包括宿主的间质细胞，如巨噬细胞和内皮细胞。此外，肿瘤血管结构异常，通透性增加1。因此，明确肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞如何相互作用，从而介导原发性肿瘤微环境中血管通透性和肿瘤细胞内渗，对于理解转移过程具有重要意义。阐明肿瘤微环境中血管通透性、肿瘤细胞内渗的动力学特征以及多细胞相互作用的潜在信号机制，可为抗癌疗法的研发与应用提供关键信息。
研究肿瘤血管通透性的主要方法 体内 一直是通过测量伊文思蓝等血管外染料来实现的2高分子量葡聚糖（155 kDa）3 以及荧光团或放射性示踪剂偶联的蛋白质（包括白蛋白）4 在染料注射后的固定时间点进行观察。显微镜技术、动物模型和荧光染料的进步使得通过活体显微成像技术在活体动物中可视化细胞过程和血管通透性成为可能。5.
通过获取静态图像或在多个时间点进行短时间延时成像，无法全面理解肿瘤微环境中发生的动态事件6,7。事实上，尽管在24小时过程中采集的静态图像显示肿瘤血管具有通透性，但并未观察到血管通透性的动态变化过程6。因此，长达12小时的连续延时成像能够捕捉肿瘤微环境中动态事件的动力学特征。
本方案描述了利用延时多光子活体显微镜技术研究肿瘤微环境中动态多细胞事件的方法。通过注射可染色剂或使用表达荧光蛋白的转基因动物，对肿瘤微环境中的多种细胞类型进行标记。在成像开始后，可通过尾静脉导管注射血管染料或蛋白，以获取肿瘤微环境中多细胞事件的动力学数据。进行活细胞成像时，需通过制备皮肤瓣膜的外科手术暴露乳腺肿瘤。使用配备多个光电倍增管（PMT）检测器的多光子显微镜，可连续采集长达12小时的图像8。通过使用适当的滤光片和减影算法，可使4个PMT检测器同时采集肿瘤微环境中5种不同的荧光信号9。高分辨率的多光子活体显微成像能够以单细胞分辨率捕捉肿瘤与基质间的相互作用，从而更深入地理解血管通透性及肿瘤细胞内渗过程10-13。具体而言，延长的活体成像揭示了高度局部化且短暂的血管通透性事件，这些事件仅发生在肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞三者相互作用的位点（定义为转移性肿瘤微环境，TMEM14）13。此外，肿瘤细胞内渗仅发生在TMEM位点，并且在空间和时间上与血管通透性事件密切相关13。实现这些事件动态过程的单细胞分辨率，得益于在肿瘤微环境中对荧光标记细胞进行的延时多光子显微成像技术。

<table><tbody><tr><td>155 kDa 葡聚糖-四甲基罗丹明异硫氰酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>用 1×PBS 以 20 mg/ml 浓度重悬</td></tr><tr><td>70 kDa 葡聚糖-德克萨斯红</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>用 1×PBS 以 10 mg/ml 浓度重悬</td></tr><tr><td>10 kDa 葡聚糖-异硫氰酸荧光素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>用 1×PBS 以 20 mg/ml 浓度重悬</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK 氨基（PEG）量子点</td><td>Life Technologies</td><td>Q21561MP</td><td>取 25 &amp;#956;l 稀释至 175 &amp;#956;l 1×PBS 中用于注射</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP 小鼠（Csf1r-Gal4/VP16, UAS-ECFP）</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1×PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isoethesia）</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>氧气</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器，结核菌素滑动针头</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G × 1（0.3 mm × 25&amp;nbsp;mm）针头</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯医用微管&amp;nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>内径 0.28 mm，外径 0.64 mm</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>厚度 1.5，22 × 50&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT 脉搏血氧仪、软件及传感器</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>软橡胶垫</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>超软聚氨酯薄膜，厚度 3/16&amp;rdquo;，12&quot; × 12&quot;，40 Oo 邵氏硬度，平面背衬</td></tr><tr><td>硬橡胶垫</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>高强度氯丁橡胶板，厚度 1/4&quot;，12&quot; × 12&quot;，50&amp;nbsp;A 邵氏硬度</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>该显微镜为基于 Olympus IX-71 支架定制的双激光多光子显微镜，配备 20× 1.05 NA 物镜。</td></tr><tr><td>7 孔打孔器套装</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>孔径范围 1/4&quot; 至 1&quot;，适用于锤击式打孔</td></tr></tbody></table>

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

在肿瘤微环境中，宿主间质细胞与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤进展、血管生成、肿瘤细胞播散及转移。肿瘤微环境中的多细胞相互作用可导致一些短暂性事件的发生，包括肿瘤细胞的定向运动和血管通透性变化。以往对肿瘤血管通透性的定量研究常依赖终点实验来测量血管染料的外渗情况。然而，由于多细胞相互作用和血管通透性具有短暂性，这些动态事件的动力学过程难以通过终点实验揭示。通过使用可注射染料或荧光蛋白标记细胞和血管系统，高分辨率的时间延时活体显微成像技术实现了对肿瘤微环境中瞬时事件的直接、实时可视化观察。本文介绍一种利用多光子显微镜在活体小鼠中进行长时间活体成像的方法，以直接观察肿瘤微环境中的多细胞动态过程。该方法详细描述了细胞标记策略、乳腺皮瓣的手术制备、经尾静脉导管注射可注射染料或蛋白的操作，以及时间延时图像的采集过程。通过该方法获得的时间延时序列有助于可视化并定量分析肿瘤微环境中细胞运动和血管通透性等细胞事件的动力学特征。

延长的活体延时显微技术能够以单细胞分辨率对肿瘤微环境中的多细胞过程进行成像。通过荧光标记肿瘤细胞、巨噬细胞、血管腔隙，并利用二次谐波信号成像胶原纤维网络，可在成像过程中同时追踪肿瘤微环境中的多个区室。表达荧光蛋白的肿瘤细胞可在转基因小鼠中构建，例如在 MMTV-PyMT-Dendra2 小鼠中，乳腺肿瘤细胞被标记为 Dendra2（图 1A）。通过将这些转基因小鼠与 Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP 小鼠杂交，后者巨噬细胞被标记为 ECFP，从而在 MMTV-PyMT 小鼠中实现肿瘤细胞和巨噬细胞的同时标记。采用肿瘤细胞与巨噬细胞双重标记策略，可实时可视化观察两种细胞类型的直接相互作用（图 1A）。此外，也可使用转导了 GFP 的人乳腺癌细胞系或患者来源的肿瘤细胞来标记肿瘤细胞。巨噬细胞可通过荧光标记的 70 kDa 右旋糖酐进行标记，该分子可富集于吞噬性巨噬细胞中（图 1B）。这些方法推动了对动态多细胞事件的研究，例如肿瘤细胞-巨噬细胞协...

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内 在单细胞分辨率下。

在肿瘤微环境中，宿主间质细胞与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤进展、血管生成、肿瘤细胞播散以及……

本实验的总体目标是通过高分辨率的活体多光子显微成像技术，可视化肿瘤微环境中的动态事件。该方法有助于回答有关肿瘤微环境的关键科学问题，例如哪些动态过程参与了血管通透性及多细胞相互作用。该技术的主要优势在于能够实时观察并定量分析肿瘤微环境中各类事件的动力学特征。开始实验前，打开所有显微镜和激光组件，包括双光子激光器和探测器。将加热箱设置为30摄氏度，以预热载物台。用70%乙醇擦拭显微镜载物台和载物台插板。当载物台干燥后，在25 × 1.05 NA的显微镜物镜上滴加一大滴水，以保持与盖玻片的光学接触，并将一片1.5厚度的盖玻片覆盖在插件成像口上。然后，剪取一段30厘米长的聚乙烯管。将橡胶垫置于盖玻片上方。使用镊子将31号针头从其塑料接头上折断，并将针头尾部的钝端插入导管中。将另一根31号针头插入PE导管的另一端。然后，用无菌PBS充满一支1 cc注射器，并将该注射器连接到31号针头上。使用 PBS 冲洗管路和针头中的所有空气。然后，准备一支 1 ml 的注射器，内含 200 µL 适当的血管标记物，另准备一支注射器，内含适当的可注射蛋白。在开始手术前，通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉效果，并为麻醉小鼠涂抹眼膏。接下来，将动物置于手术平台上，并在加热灯下放置以促进尾部血液循环。两分钟后，用70%乙醇对尾部进行消毒，将31号导管的尖端插入外侧尾静脉，深度为两到三毫米。然后，剪取一段一厘米长的实验室胶带贴在导管上，使针头与尾部静脉平行并沿尾部长度方向固定。固定导管后，用70%乙醇擦拭腹部腹侧及肿瘤表面。然后提起腹部上方的皮肤，使用无菌剪刀沿腹部腹侧正中线做长约1厘米的皮下切口，注意避免刺破腹膜。轻轻剪开将乳腺和肿瘤与腹膜相连的结缔组织，以暴露肿瘤。然后，使用剪刀和镊子轻轻去除肿瘤暴露表面的筋膜和脂肪组织。当肿瘤完全暴露后，将小鼠转移至预热的成像载物台。用实验室胶带固定盖玻片，然后将肿瘤置于覆盖在显微镜物镜上方盖玻片的橡胶垫孔洞中。当动物就位后，用 PBS 填充橡胶垫片腔室，以保持组织湿润并维持与盖玻片的光学接触。将脉搏血氧仪探头环绕于动物颈部，以监测其生命体征，并将加热箱罩住动物。随后，使用显微镜 IP 聚焦于肿瘤表面的荧光肿瘤细胞，并定位含有血流血管的区域。选定感兴趣区域后，将显微镜切换至多光子成像模式，并使用聚焦调节器将物镜移至所需的起始位置。然后，单击Z位置顶部按钮，设定Z序列的上限，并在二次谐波生成通道中观察肿瘤表面的胶原纤维网络。接着，将物镜移动至所需的成像深度，单击Z位置底部按钮，设定Z序列的下限。接下来，在步长字段中输入所需的数值。然后切换到时间间隔面板，并输入相应的时间间隔。确定成像参数后，将连接在导管上的注射器更换为含有血管标记染料的注射器，缓慢注入最多 200 微升染料溶液，注意确保溶液进入静脉。注射后，将PBS注射器重新连接至导管，并开始进行z步进时间

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落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

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