延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本实验的总体目标是通过高分辨率的活体多光子显微成像技术，可视化肿瘤微环境中的动态事件。该方法有助于回答有关肿瘤微环境的关键科学问题，例如哪些动态过程参与了血管通透性及多细胞相互作用。该技术的主要优势在于能够实时观察并定量分析肿瘤微环境中各类事件的动力学特征。

开始实验前，打开所有显微镜和激光组件，包括双光子激光器和探测器。将加热箱设置为30摄氏度，以预热载物台。用70%乙醇擦拭显微镜载物台和载物台插板。

当载物台干燥后，在25 × 1.05 NA的显微镜物镜上滴加一大滴水，以保持与盖玻片的光学接触，并将一片1.5厚度的盖玻片覆盖在插件成像口上。然后，剪取一段30厘米长的聚乙烯管。将橡胶垫置于盖玻片上方。

使用镊子将31号针头从其塑料接头上折断，并将针头尾部的钝端插入导管中。将另一根31号针头插入PE导管的另一端。然后，用无菌PBS充满一支1 cc注射器，并将该注射器连接到31号针头上。

使用 PBS 冲洗管路和针头中的所有空气。然后，准备一支 1 ml 的注射器，内含 200 µL 适当的血管标记物，另准备一支注射器，内含适当的可注射蛋白。在开始手术前，通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉效果，并为麻醉小鼠涂抹眼膏。

接下来，将动物置于手术平台上，并在加热灯下放置以促进尾部血液循环。两分钟后，用70%乙醇对尾部进行消毒，将31号导管的尖端插入外侧尾静脉，深度为两到三毫米。然后，剪取一段一厘米长的实验室胶带贴在导管上，使针头与尾部静脉平行并沿尾部长度方向固定。

固定导管后，用70%乙醇擦拭腹部腹侧及肿瘤表面。然后提起腹部上方的皮肤，使用无菌剪刀沿腹部腹侧正中线做长约1厘米的皮下切口，注意避免刺破腹膜。轻轻剪开将乳腺和肿瘤与腹膜相连的结缔组织，以暴露肿瘤。

然后，使用剪刀和镊子轻轻去除肿瘤暴露表面的筋膜和脂肪组织。当肿瘤完全暴露后，将小鼠转移至预热的成像载物台。用实验室胶带固定盖玻片，然后将肿瘤置于覆盖在显微镜物镜上方盖玻片的橡胶垫孔洞中。

当动物就位后，用 PBS 填充橡胶垫片腔室，以保持组织湿润并维持与盖玻片的光学接触。将脉搏血氧仪探头环绕于动物颈部，以监测其生命体征，并将加热箱罩住动物。随后，使用显微镜 IP 聚焦于肿瘤表面的荧光肿瘤细胞，并定位含有血流血管的区域。

选定感兴趣区域后，将显微镜切换至多光子成像模式，并使用聚焦调节器将物镜移至所需的起始位置。然后，单击Z位置顶部按钮，设定Z序列的上限，并在二次谐波生成通道中观察肿瘤表面的胶原纤维网络。接着，将物镜移动至所需的成像深度，单击Z位置底部按钮，设定Z序列的下限。

接下来，在步长字段中输入所需的数值。然后切换到时间间隔面板，并输入相应的时间间隔。确定成像参数后，将连接在导管上的注射器更换为含有血管标记染料的注射器，缓慢注入最多 200 微升染料溶液，注意确保溶液进入静脉。

注射后，将PBS注射器重新连接至导管，并开始进行z步进时间序列成像。当所有图像采集完成后，将PBS注射器更换为含有可注射蛋白的注射器，注意避免向管路中引入气泡。然后缓慢将蛋白悬液注入小鼠体内，并再次更换为含有PBS的注射器。

巨噬细胞可通过荧光标记的70千道尔顿葡聚糖进行示踪，该物质可积聚在吞噬性巨噬细胞内。对肿瘤细胞和巨噬细胞进行双重标记，可实现实时观察这两种细胞类型之间的直接相互作用。为了观察肿瘤血管通透性的变化，也可使用量子点标记血管腔隙。

由于其分子足够大，无法轻易通过血管间间隙扩散。连续的高分辨率成像有助于捕捉血管通透性事件，并对葡聚糖外渗及清除的动力学过程进行定量分析。在此示例视野中，血管双向外渗的峰值出现在29至34分钟之间，表现为血管外TMR信号的增强。

注射额外的血管染料或蛋白质以诱导血管通透性，可为调控血管通透性的信号事件提供研究依据。事实上，在注射后的最初几秒内，即可观察到10千道尔顿的FITC标记葡聚糖从血管中渗出，而155千道尔顿的TMR标记葡聚糖则仍局限于血管腔内。若操作熟练，正确实施该技术可在一小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要轻柔地去除结缔组织，避免损伤肿瘤表面，同时保持肿瘤表面湿润。通过该细胞动态观察方法，可进一步可视化肿瘤细胞的迁移过程，以探究肿瘤细胞迁移方向性及内渗行为等相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用活体多光子显微镜对肿瘤微环境中的动态细胞事件进行可视化观察。