Name: Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, çok fotonlu mikroskopi ile tümör mikroçevresindeki dinamik olayları canlı olarak görüntülemeyi. Bu yöntem, vasküler geçirgenlik ve çok hücreli etkileşimlerin kinetiğini ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma ödül sayısı (ASH, W81XWH-13-1-0010) kapsamında Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı, NIH CA100324, PPG CA100324 ve Entegre Görüntüleme Programı tarafından desteklenmiştir.

açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır. 1. Getirici floresanla işaretlenmiş tümörler ve tümör bağlantılı makrofajlar <ol><li> Gelişmiş yeşil floresan fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı, yani fluoresan muhabir [transgenik fareler polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) tahrik kendiliğinden, yerli, genetik olarak fare meme kanseri modeli geçerek floresan etiketli tümör hücrelerinin oluşturmak protein (EGFP), geliştirilmiş mavi floresan proteinin (ECFP) ya da Dendra2] 8,9. </li><li> PyMT hayvanlarda floresan etiket makrofajlar ile floresan [yani, MacGr myeloid- ve makrofaj spesifik floresan gazetecilere genetiği fare modelleri geçerek tümör hücrelerinin etiketlieen 15 veya MacBlue farenin CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP 16]. </li><li> Seçenek olarak ise, floresan floresan etiketli PyMT tümör hücreleri (singeneik), insan meme kanseri hücre soyları ya da primer insan hastaya türevli tümörlerde (ksenogrefleri) 11,17 ortotopik transplantasyon ile tümörlerinin, etiketli oluşturur. <ol><li> İmplant floresan floresan etiketli tümör hücreleri ve miyeloid hücreler 13 hayvanlar oluşturmak için floresan protein etiketli miyeloid hücreler ile singeneik farelere PyMT tümör hücrelerini etiketli. </li></ol></li><li> başlangıç ​​2 saat önce floresan etiket makrofajlara insan hücre çizgileri ve hasta türetilmiş primer tümörlerin ksenograft tümör ağır birleşik bağışıklık eksikliği (SCID) farelere 10 mg damar içi (IV) kuyruk damarı / kg floresan 70 kDa dekstran 100 ul enjekte intravital görüntüleme. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulum ve Görüntüleme Hazırlık Not: Bu yordam set-up açıklarBir multiphoton mikroskop 8 intravital görüntüleme için. <ol><li> iki foton lazerler ve dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın. </li><li> sahne öncesi ısınmak için 30 ° C, ısıtma kutusunu açın. Bu adım, bir hayvan fizyolojik ısısını muhafaza etmek için kritiktir. </li><li> ters bir mikroskop yerinde mikroskop sahnede ısmarlama sahne uç ile kullanım içindir. Özel uç görüntüleme için merkezi delikten geçen çapı &quot;sahne ekleme uzayda ve 1 ile uyacak şekilde işlenmiş kalın alüminyum&quot; 1/8 bir sayfadır. <ol><li> % 70 etanol ve kuru hava ile mikroskop sahne ve sahne parçasını silin. </li><li> cam kapak ile optik temas sağlamak için 20X, 1.05 NA mikroskop objektif su büyük damla yerleştirin. </li><li> mikroskop sahne uç üzerindeki görüntüleme portu üzerinden yer cam kapak (# 1.5 kalınlık). laboratuar bant ile yerde sabitleyin. </li><li> 2 cm x 2 cm delik yumruk bir delik yumruk kullanınve esnek bir lastik pedi özel sahne eki delik ile uyumlu pad deliği mikroskop sahnede lastik pedi yerleştirin. </li></ol></li></ol> Görüntüleme sırasında Enjeksiyon için 3. Kuyruk Ven Kateterine hazırlanması ve Reaktifler <ol><li> polietilen (PE) tüp içinde 30 cm uzunluğunda kesilir. </li><li> plastik montaj kopana kadar forseps kullanarak, ileri ve geri bir 31 G iğne metal iğne taşımak. </li><li> forseps kullanarak, PE boru içine müstakil iğnenin künt ucunu. </li><li> PE boru diğer ucunu bir 31 G iğne takın. </li><li> steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1 cc şırınga doldurun ve 31 G iğne takın ve PBS ile tüp ve iğne bütün havayı temizlemek. PBS hidrasyon ve kan ozmolarite 9,18 muhafaza etmek için kullanılır, bununla birlikte izotonik tuz da kullanılabilir. </li><li> 3 mg, 200 ul 1 cc şırınga doldurmak / 155 kDa dekstran-tetrametilrodamin (TMR kg) Veya vasküler etiketleme için kuantum noktaları. </li><li> Bu buz üzerinde 1 cc şırınga ve yerine vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGFA 165) içindeki bir 165 amino asit izoformunu gibi diğer enjekte edilebilir proteinleri hazırlayın. 0.05 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda 0.2 mg / kg VEGFA 165 19 enjekte edilir. </li></ol> Kalıcı Tail Ven Kateter 4. yerleştirilmesi <ol><li> Taşıyıcı gaz olarak O 2 ile% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasını kullanarak anestezi altında hayvan yerleştirin. </li><li> tam anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor kez ameliyat platforma fare aktarın. </li><li> Cerrahi platforma Açık izofluran anestezi hattı, indüksiyon odasına anestezi hattını kapatın ve hayvanın burnu üzerine burun konisi yerleştirin. 2.5% 5 ile% den izofluran azaltın. </li><li> anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri oftalmik merhem sürün. </li><li> ısıtma lambası altında hayvan ısıtınEk 2 dk kuyruk dolaşımını artırmak için sirkülasyon derin anestezi ile yavaşlatır olarak. </li><li> % 70 etanol ile fare kuyruğu ven sterilize edin. </li><li> hayvanın yan kuyruk damar içine Bölüm 3 inşa kateter 31 G iğne ucu yerleştirin ve 2-3 mm iğne itin. </li><li> kuyruk damarından yerleştirilir kateter sağlanması, kan görmek şırınga geri çekin. </li><li> kuyruk uzunluğu boyunca damar yer paralel iğne tutma iğne üzerine yerleştirilen laboratuvar bant 1 cm uzunluğu kullanın. </li></ol> 5. Cilt Kapak Cerrahi Prosedür Meme Tümör Açığa <ol><li> ameliyat işlemine hayvan tümörü ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi bez. Not: tarif edildiği gibi, bu işlem tam aseptik gerçekleştirilmez. enfeksiyon karıştırıcı bir faktör haline gelebilir uzun görüntüleme oturumları için, uygun aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Steri kullanmaSteril makas ventral orta hat uzunluğu yaklaşık 1 cm boyunca bir cilt altı kesi yapmak ile le forseps, ventral cilt kaldırın. insizyon sırasında periton delinmesiyle kaçının. </li><li> Yavaşça meme tümörü açığa çıkarmak üzere periton meme bezi ve tümör bağlama bağ dokusu kesti. </li><li> yavaşça çıkarın ve tümör damar bütünlüğünü korumak ve kanama en aza indirirken tümörün maruz yüzeyinden fasya ve yağ kesip, makas ve forseps kullanma. Bu adım tümörün tümör mimarisi ve damar kaynağı sağlamada önemlidir. </li></ol> Mikroskopi 6. Hayvan hazırlanması <ol><li> görüntüleme için mikroskop objektif üzerine sahne insert üzerine lamel üzerine yerleştirilir maruz tümör ile önceden ısıtılmış görüntüleme aşamasına hayvan aktarın. İğneyi çıkarmak için değil, böylece hayvan ile hafifçe kuyruk ven kateteri aktarmak için özen gösterin. </li><li> Yeri inciHayvanın burnu üzerinden e anestezi burun konisi% 3 izofluran anestezi seti korumak için. </li><li> Tümör kauçuk ped deliğe aittir ve cam lamel ile temas eder, böylece hayvan yerleştirin. </li><li> yavaşça yerine tümör tutun ve görüntü alımı sırasında hareketi azaltmak için laboratuvar bant ile mikroskop sahneye bunları düzeltmek için iki lastik pedleri kullanmayın. </li><li> hidratlı doku tutmak ve lamel ile optik temas sağlamak için PBS ile lastik pedi odasına doldurun. </li><li> Bir pulse oksimetre probu ile hayvanın hayati belirtilerini izlemek başlayın. hayvan uyluk bir klip sensörünü takın. Seçenek olarak boyun çevresine uyacak şekilde yapılandırılmış bir yaka kullanılabilir. </li><li> 30 ° C 20 korumak için hayvan üzerinde ısıtma kutusu yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş anestezi korumak ve kan akışını korumak için 0.5-1% izofluran düzeyini azaltır. </li></ol> 7. Görüntü Alma ve Fluoresc Enjeksiyonent Boyalar ve Enjekte Proteinler <ol><li> Tümörün yüzeyinde floresan tümör hücreleri üzerinde mikroskop mercek odak kullanma. </li><li> kan damarlarını akan alanları bularak ilgi alanı seçin. akan kan damarları ile ilgi alanının seçimi tümör damarsal değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. </li><li> ilgi bir bölge seçildikten sonra multiphoton görüntüleme moduna mikroskop geçin. </li><li> z-serisi üst ve alt limitlerini ayarlayın. istediğiniz başlangıç ​​konumuna hedefi taşımak için odak ayarlayıcısı kullanarak ve Z konumu &quot;Üst&quot; butonuna tıklayarak z serinin üst sınırını ayarlayın. ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal tümör yüzeyindeki kolajen lif şebekesi görselleştirilmesi ve hiçbir hücre sadece kolajen lifleri görünür olduğunda gözlemleyerek z serisinin üst sınırını belirleyin. <ol><li> (Typica istenen görüntüleme derinliğe kadar objektif hareket ettirerek z serisinin alt sınırını ayarlayınLly 50-150 mikron) ve Z konumu tıklayarak &quot;Alt&quot; tuşuna basınız. </li><li> adım büyüklüğü alanına istediğiniz değeri yazarak adım boyutunu ayarlayın. çözünürlük ve satın alma süre hususlara dayalı adım boyutunu belirlemek (genellikle 2 mikron yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan ve 5 mikron aksi bir). </li></ol></li><li> Time-Lapse alanına istenilen hızlandırılmış zamanı Time-Lapse paneline geçiş ve girerek time-lapse aralığını ayarlayın. Optimal zamansal çözünürlük için sürekli görüntüleme için 0 sn için zaman aralığını ayarlayabilirsiniz. Not: Uzun time-lapse görüntüleme için objektif daldırma sıvı doldurmak için satın almalar arasında 10 sn zaman aralığını ayarlamak için tavsiye edilir. </li><li> görüntüleme için parametreler belirlenmiştir edildikten sonra, yavaş yavaş 155 kDa dekstran-TMR enjekte edilir. <ol><li> Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve li içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 155 kDa dekstran-TMR özen içeren şırınga ile değiştirinne. </li><li> Yavaş yavaş 200 ul maksimum hacmi ile, fare içine 155 kDa dekstran-TMR enjekte ve şırınga PBS içeren şırınga değiştirin. KRİTİK ADIM: yavaş yavaş enjeksiyon yapın ve ven dışında çözüm almamak için önlem alın. </li></ol></li><li> Kayıt butonuna tıklayarak daha sonra bunları bastırmak için Z-Stack ve Time-Lapse düğmeleriyle tarafından Z-yığın time-lapse görüntüleme edinilmesini başlatın. </li><li> Diğer floresan dekstranlar, örneğin, 10 kDa dekstran-floresin izotiyosiyanat (FITC), veya proteinler, örneğin, VEGFA 165, önceden hazırlanmış ise, 0 = en az bir başlangıç ​​için görüntü elde başladıktan sonra bunları enjekte edilir. <ol><li> Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve hattına herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 10 kDa dekstran-FITC veya VEGFA 165 özen içeren şırınga ile değiştirin. </li><li> Yavaşça kuyruk ven kateter yoluyla fare içine enjekte edilebilir enjekteve PBS ihtiva eden bir şırınga ile bir şırınga değiştirin. </li></ol></li><li> Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir. </li></ol> 8. Ötenazi <ol><li> görüntü alımı bitiminde, hayvan euthanize. <ol><li> % 5 izofluran artırın. </li><li> nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun. </li><li> tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 9. Görüntü İşleme <ol><li> her zaman bir noktada her kanal için 16 bit TIFF dosyalar görüntüleri kazanmak ve sırayla kaydedin. </li><li> Spektral örtüşme (yani, GFP ve OBP), xy sürüklenme ortadan kaldırılması ve ImageJ 9 kurulan yöntemler kullanılarak time-lapse dizilerinden film nesil ayrılmasını gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü görüntüler 13 3D yüzey rekonstrüksiyon gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Gerlowski, L. E., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability+of+normal+and+neoplastic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues.</a> Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).</li>
<li>Wang, H. -L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rous-Whipple+Award+Lecture.+How+tumors+make+bad+blood+vessels+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma.</a> Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).</li>
<li>Nagy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+tumor+surrogate+blood+vessels+induced+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.</a> Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumor+xenograft%3A+molecular+size+dependence+and+cutoff+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size.</a> Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).</li>
<li>Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumour+xenograft%3A+molecular+charge+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence.</a> Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).</li>
<li>Patsialou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+reveals+multicellular+streaming+as+a+crucial+component+of+in+vivo.+cell+migration+in+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors.</a> Intravital. 2 (2), e25294(2013).</li>
<li>Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+classification+links+tumor+microenvironments+with+tumor+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype.</a> PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mena+invasive+%28MenaINV%29+promotes+multicellular+streaming+motility+and+transendothelial+migration+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer.</a> J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+Reveals+Local%2C+Transient+Vascular+Permeability%2C+and+Tumor+Cell+Intravasation+Stimulated+by+TIE2hi+Macrophage-Derived+VEGFA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA).</a> Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Robinson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+of+metastasis+in+human+breast+carcinoma%3A+a+potential+prognostic+marker+linked+to+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination.</a> Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).</li>
<li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukcocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+disruption+by+VEGF-mediated+Src+activity+potentiates+tumor+cell+extravasation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis.</a> J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).</li>
<li>Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Multiphoton+Imaging+of+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo.+Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors.</a> In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo.+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6 (9), e24807(2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability%2C+accumulation%2C+and+penetration+of+macromolecular+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).</li>
<li>Chittajallu, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+cell-cycle+profiling+in+xenograft+tumors+by+quantitative+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

tümör mikroçevresinde kendiliğinden meydana gelen hücresel etkileşimler, tümör hücre hareketliliği ve intravasation değişikliklere yol açabilir. Canlı tümör dokusunun yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme son derece geçici 10,13,24 olabilir çok hücreli dinamikleri görselleştirme izin verir. Tümörün mikro süreçlerin moleküler mekanizmaları hakkında gerekli bilgi verebilir ayrık zamanlı noktaları ile elde edilen in vivo deneylerde veya time-lapse görüntüleri uç noktası. Intravital görüntü...

primer meme tümörü tümör hücrelerinin yayılması makrofajlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere stromal hücreler sadece tümör hücrelerini içerir, ancak ana bilgisayar gösterilmiştir. Bundan başka, tümör damar sistemi artan geçirgenliği 1 anormaldir. Bu durumda, tümör hücreleri, makrofajlar ve endotelial hücreler, primer tümör mikro-vasküler geçirgenliği ve tümör hücre intravasation aracılık etkileşim belirleyen anlaşılması metastaz için önemlidir. damar geçirgenliği, tümör hücre intravazasyonunda ve tümör mikroçevresinde çok hücreli etkileşimler altında yatan sinyal mekanizmasının kinetik anlama anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesine ve yönetiminde önemli bilgiler sağlayabilir. In vivo olarak tümör damar geçirgenliğini incelemek birincil yöntemi Evans Mavi 2, yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar (155 kDa) halinde ekstravasküler boyalar ölçülmesi olmuşturBoyanın enjeksiyonundan sonra sabit bir zaman noktalarında 3 ve florofor ya da (albümin dahil) Radyoaktif-konjüge proteinler 4. Mikroskopi Gelişmeler, hayvan modelleri ve floresan boyalar intravital mikroskobiyle 5 boyunca hücresel süreçleri ve canlı hayvan vasküler geçirgenliğin görselleştirme sağlamıştır. Birkaç kez puan üzerinden statik görüntülerin, ya da kısa time-lapse dizilerinin satın alarak Canlı hayvan görüntüleme tümörün mikro 6,7 dinamik olayların anlaşılması için izin vermez. Nitekim, 24 saat boyunca statik bir görüntü elde etme tümör damar ancak damar geçirgenliği dinamikleri 6 gözlenmemiştir, sızdıran olduğunu göstermiştir. Böylece, 12 saate kadar uzatılmış sürekli time-lapse görüntüleme tümör mikroçevresinde dinamik olayların kinetik yakalar. Bu protokol, uzun bir zaman atlamalı multiphot kullanımını tarif ederintravital mikroskopi tümör mikro-dinamik çok hücreli olayları incelemek için. tümör mikroçevresinde birden fazla hücre tipleri enjekte edilebilir boyalarla veya floresan proteinleri ifade transgenik hayvanlar kullanılarak etiketlenir. vasküler boyalar veya proteinler görüntüleme başladıktan sonra enjekte edilebilir bir kuyruk damarından sonda kullanılarak tümör mikro çok hücreli olayların kinetik veriler elde etmek için. canlı hücre görüntüleme için meme tümörü deri bir kapakla cerrahi hazırlık aracılığıyla maruz kalmaktadır. Görüntüler birden photomultiplier tüpler (PMT) dedektörleri 8 ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak 12 saate kadar için edinilir. Uygun filtreleri kullanarak, bir çıkarma algoritması tümörün mikro aynı anda 9 5 floresan sinyalleri elde etmek 4 PMT dedektörleri sağlar. Yüksek çözünürlüklü multiphoton İntra vital mikroskopik daha iyi bir yol, tümörün mikro tümör stromanın etkileşimleri, tek bir hücre çözünürlüklü görüntü yakalar Uvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation 10-13 nderstanding. Spesifik olarak, bir tümör hücresi, bir makrofaj ve endotel hücre arasındaki etkileşimi bölgelerde seçici meydana genişletilmiş intravital görüntüleme ortaya yüksek derecede lokalize edilen, geçici vasküler geçirgenlik etkinlik 13 (metastaz, TMEM 14 tümör mikro-olarak tanımlanmıştır). Bundan başka, tümör hücre intravasation, sadece TMEM gerçekleşir ve uzamsal ve geçici olarak vasküler geçirgenliği 13 ile ilişkilidir. Bu olayların dinamiklerinin tek hücreli çözünürlükte tümör mikroçevresinde floresan işaretli hücrelerin uzun time-lapse multiphoton mikroskobu kullanımı ile mümkün olmuştur.

<table><tbody><tr><td>155 kDa dekstran-tetrametilrodamin izotiyosiyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td>, <td>1x PBS'de 20 mg / ml'de sulandırılır</td></tr><tr><td>70 kDa dekstran-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td>, <td>1x PBS'de 10 mg / ml'de sulandırılır 10</td></tr><tr><td>kDa dekstran-floresein izotiyosiyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S,</td><td>1x PBS'de 20 mg / ml'de sulandırılır</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Kuantum Noktaları Ömrü</td><td> </td><td></td><td>Seyreltik 25 & # 956 Q21561MP Teknolojiler; 175 &#956'da L; l enjeksiyon için 1x</td></tr><tr><td>PBS MMTV-PyMT fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP fareleri (Csf1r-Gal4 / VP16, UAS-ECFP)</td> <td>Jackson Laboratuvarı</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolezi (izofluran)</td> <td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga, tüberkülin kayma ucu</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0,3 mm x 25&nbsp; mm) iğne</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen mikro tıbbi boru & nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE / 1</td><td>0,28 mm İç Çap x 0,64 mm Dış Çap</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>kalınlık 1.5, 22 x 50&nbsp; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT nabız oksimetresi, yazılım ve sensörler</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>yumuşak kauçuk ped</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Ultra Yumuşak Poliüretan Film, 3/16" Kalın, 12 "x 12", 40 Oo Durometre, Düz Arka</td></tr><tr><td>sert lastik ped</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Yüksek Mukavemetli Neopren Kauçuk Levha 1/4 "Kalınlık, 12" x 12", 50&nbsp; Bir Durometre</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td>Mikroskop, 20X 1.05NA objektif lensi kullanan bir Olympus IX-71 standına dayanan özel olarak üretilmiş iki lazerli multifoton mikroskobudur.</td></tr><tr><td>7-Zımba seti</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>1/4" ila 1" Delik Çapı, Çekiç Tahrikli Delgeç için</td></tr></tbody></table>

tümör mikroçevresinde gerçek zamanlı multisellüler dynamics genişletilmiş time-lapse intravital görüntüleme

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Tümör mikroçevresinde, konakçı stromal hücreler, tümör ilerlemesini, anjiyogenezini, tümör hücresi yayılımını ve metastazı teşvik etmek için tümör hücreleri ile etkileşime girer. Tümör mikroçevresindeki çok hücreli etkileşimler, yönlü tümör hücresi motilitesi ve vasküler geçirgenlik dahil olmak üzere geçici olaylara yol açabilir. Tümör vasküler geçirgenliğinin ölçülmesi, vasküler boyaların ekstravazasyonunu ölçmek için sıklıkla kullanılan son nokta deneylerine sahiptir. Bununla birlikte, çok hücreli etkileşimlerin geçici doğası ve vasküler geçirgenlik nedeniyle, bu dinamik olayların kinetiği ayırt edilemez. Hücreleri ve damar sistemini enjekte edilebilir boyalar veya floresan proteinlerle etiketleyerek, yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış intravital mikroskopi, tümör mikroçevresindeki geçici olayların doğrudan, gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin vermiştir. Burada, tümör mikroçevresindeki çok hücreli dinamikleri doğrudan görselleştirmek için canlı farelerde genişletilmiş intravital görüntüleme gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobu kullanmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, hücresel etiketleme stratejilerini, bir meme derisi flebinin cerrahi hazırlığını, enjekte edilebilir boyaların veya proteinlerin kuyruk ven kateteri ile uygulanmasını ve hızlandırılmış görüntülerin elde edilmesini detaylandırır. Bu yöntemden elde edilen hızlandırılmış sekanslar, tümör mikroçevresindeki hücresel motilite ve vasküler geçirgenlik olaylarının kinetiğinin görselleştirilmesini ve niceliklendirilmesini kolaylaştırır.

Genişletilmiş zaman atlamalı intravital mikroskopi tümör mikroçevresinde çok hücreli süreçlerin tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. floresan etiketleme tümör hücreleri, makrofajlar, vasküler alan, ikinci harmonik oluşumu sinyali kullanılarak kolajen lif şebekesi görselleştirerek, tümörün mikro birden fazla bölme aynı zamanda görüntüleme sırasında izlenir. Dendra2 (Şekil 1A) ile etiketlenmiş meme tümörü hücreleri, MMTV PyMT-Dendra2 farelerde yapıldığı gibi fl...

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü, intravital çok fotonlu mikroskopi aracılığıyla tümör mikroçevresindeki dinamik olayları görselleştirmektir. Bu yöntem, vasküler geçirgenlik ve çok hücreli etkileşimlerde hangi dinamik olayların rol oynadığı gibi tümör mikroçevresine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör mikroçevresindeki olayların kinetiğinin gözlemlenebilmesi ve ölçülebilmesidir.Prosedüre başlamadan önce, iki foton lazerleri ve dedektörler dahil tüm mikroskop ve lazer bileşenlerini açın. Ardından, sahneyi ön ısıtmak için ısıtma kutusunu 30 °C'ye ayarlayın. Mikroskop sahnesini ve sahne ekini %70 etanol ile silin.Sahne kuruyken, lam örtü camı ile optik teması sürdürmek için 25 x 1.05 NA mikroskop objektifine büyük bir su damlası yerleştirin ve görüntüleme portu girişinin üzerine 1.5 kalınlığında bir örtü camı koyun. Ardından, 30 santimetrelik bir parça polietilen tüp kesin. Kauçuk pedi örtü camının üzerine yerleştirin.Pens kullanarak, 31 gauge bir iğneyi plastik başlığından kırın ve iğne göbeğinin küt ucunu tübe yerleştirin. PE tübün diğer ucuna 31 gauge bir iğne yerleştirin ve sabitleyin. Ardından, bir cc'lik bir şırıngayı steril PBS ile doldurun ve şırıngayı 31 gauge iğneye takın.Hortumdaki ve iğnedeki tüm havayı dışarı atmak için PBS kullanın. Ardından, bir adet 1 cc'lik şırıngayı 200 µL uygun vasküler etiketle ve bir diğerini uygun enjekte edilebilir proteinle doldurun. Cerrahi işleme başlamadan önce, ayak parmağı sıkıştırma yöntemine yanıt alınmadığından emin olarak anestezinin uygunluğunu doğrulayın ve anestezi altındaki fareye göz pomadları uygulayın.Ardından, kuyruk dolaşımını artırmak için hayvanı bir ısı lambası altında cerrahi platforma yerleştirin. İki dakika sonra kuyruğu %70 etanol ile sterilize edin ve 31 gauge kateterin ucunu lateral kuyruk venine iki ila üç milimetre derinlikte yerleştirin. Daha sonra, iğneyi kuyruk boyunca vene paralel tutmak için kateterin üzerine bir santimetre uzunluğunda laboratuvar bandı yapıştırın.Kateter sabitlendikten sonra, ventral yüzeyi ve tümör yüzeyini %70 ethanol ile silin. Ardından, karın üzerindeki deriyi kaldırın ve peritona zarar vermemeye dikkat ederek, karnın ventral orta hattı boyunca yaklaşık bir santimetrelik subkutan bir insizyon yapmak için steril makas kullanın. Tümörü açığa çıkarmak için meme bezini ve tümörü peritona bağlayan bağ dokusunu nazikçe kesin.Ardından, makas ve pens kullanarak tümörün açığa çıkan yüzeyindeki fasya ve yağ dokusunu nazikçe temizleyin. Tümör açığa çıktıktan sonra, fareyi önceden ısıtılmış görüntüleme tablasına aktarın. Lamine camı sabitlemek için laboratuvar bantları kullanın ve ardından tümörü, mikroskop objektifinin üzerindeki lamine camı örten kauçuk bir pedin deliğine yerleştirin.Hayvan uygun pozisyona getirildiğinde, dokuyu nemli tutmak ve lamel ile optik teması sürdürmek için kauçuk ped haznesini PBS ile doldurun. Hayvanın yaşamsal bulgularını izlemek için boyun çevresine bir nabız oksimetresi probu kolye sensörü yerleştirin ve ısıtma kutusunu hayvanın üzerine koyun. Ardından, tümör yüzeyindeki floresan tümör hücrelerine ve kan akışının olduğu bölgeye odaklanmak için mikroskop IP'lerini kullanın.İlgilenilen bölge seçildikten sonra, mikroskobu çok fotonlu görüntüleme moduna getirin ve objektifi istenen başlangıç konumuna taşımak için odak ayarlayıcıyı kullanın. Ardından, z serisinin üst sınırını belirlemek için Z konum üst düğmesine tıklayın ve tümör yüzeyindeki kolajen fiber ağını ikinci harmonik üretimi kanalında görselleştirin. Daha sonra objektifi istenen görüntüleme derinliğine getirin ve z serisinin alt sınırını belirlemek için z konum alt düğmesine tıklayın.Ardından, adım boyutu alanlarına istenen değeri girin. Daha sonra, Time Lapse Paneline geçin ve uygun lapse süresini girin. Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, katetere bağlı şırıngayı vasküler işaretleme boyası içeren bir şırınga ile değiştirin ve çözeltinin vena içine girdiğinden emin olarak, boya çözeltisinden maksimum 200 µL'yi yavaşça uygulayın.Enjeksiyondan sonra, PBS şırıngasını katetere geri takın ve z adımlı zaman atlamalı görüntülemeye başlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, hatta hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, PBS şırıngasını enjekte edilebilir protein içeren şırınga ile değiştirin. Ardından, protein süspansiyonunu fareye yavaşça enjekte edin ve şırıngayı PBS içeren bir şırınga ile değiştirin.Makrofajlar, fagositoz yapan makrofajlarda biriken floresan işaretli 70 kilodalton ve dekstran ile takip edilebilir. Tümör hücrelerinin ve makrofajların çiftle işaretlenmesi, bu iki hücre tipinin doğrudan etkileşiminin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır. Tümör vasküler geçirgenliğindeki değişiklikleri görselleştirmek için vasküler alanı işaretlemek amacıyla kuantum noktaları da kullanılabilir.Interarteriyel boşluklardan kolayca difüze olamayacak kadar büyük oldukları için, sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme, vasküler geçirgenlik olaylarının yakalanmasını ve dekstran ekstravazasyon ve klirens kinetiğinin nicelendirilmesini kolaylaştırır. Bu örnek görüş alanında, ekstravasküler TMR sinyalinin kanıtladığı üzere, vasküler di-ekstravazasyonun zirvesi 29 ile 34. dakikalar arasında gözlemlenmektedir.Vasküler geçirgenliği indüklemek için ek vasküler boyalar veya proteinlerin enjekte edilmesi, vasküler geçirgenliği düzenleyen sinyalizasyon olayları hakkında bilgi sağlayabilir. Nitekim, enjeksiyondan sonraki ilk birkaç saniye içinde, 10 kilodaltonluk FITC dekstranın damar dışına sızdığı gözlemlenebilirken, 155 kilodaltonluk TMR dekstran vasküler alanla sınırlı kalır. Bu teknik bir kez kavranıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde bir saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, tümör yüzeyine zarar vermeden bağ dokusunu nazikçe temizlemeyi ve tümör yüzeyini nemli tutmayı unutmamak önemlidir. Hücresel dinamiklere yönelik bu prosedürün ardından, tümör hücresi göçünün yönü ve intravazasyon hakkındaki ek soruları yanıtlamak için söz konusu tümör hücresi göçü görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, intervital çok fotonlu mikroskopi ile bir tümör mikroçevresindeki dinamik hücresel olayların nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Transgenik raportör fareler ve enjekte edilebilir floresan etiketler kullanarak, uzun süreli intravital eğirme diski konfokal mikroskobu, ApcMin/+ kolorektal kanser modelinde miyeloid hücre davranışının bağırsak adenomuna doğrudan görselleştirilmesini sağlar.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme Süm Min / + Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Burada, aynı yaşam hayvanında invazif cerrahi müdahalenin (örn. biyopsi) önce ve sonra beyin tümörü hücrelerinin yüksek çözünürlüklü zaman aşımı multifoton görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bu invaziv cerrahi prosedürlerin tümör hücrelerinin migrasyon, invazif ve proliferatif davranışlarının tek bir hücre seviyesinde etkisini inceleyerek sağlar.

Invaziv cerrahi biyopsiye yanıt olarak beyin tümörü hücre davranışının boyuna Intravital görüntüleme

Biz metastazın tümör mikroortamı ile ilişkili geçici vasküler geçirgenliği değerlendirmek için iki yöntem tarif (tmem) kapı fonksiyonu ve kanser hücresi konvülsyon yüksek molekül ağırlığı İntravenöz enjeksiyon kullanarak (155 kDa) farelerde dekstran. Yöntemleri, canlı hayvanların intravital görüntüleme ve immünofluorescence kullanarak sabit doku analizi içerir.

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Öğrenin, çok fotonlu mikroskopi ile tümör mikroçevresindeki dinamik olayları canlı olarak görüntülemeyi. Bu yöntem, vasküler geçirgenlik ve çok hücreli etkileşimlerin kinetiğini ölçmenizi sağlar.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Daha fazla video keşfet