Name: 干细胞基工程免疫抗HIV感染的人性化小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 了解利用CD34阳性造血干细胞和胸腺组织构建人源化BLT小鼠模型的方法，用于测试抗HIV的工程化免疫疗法。该模型为HIV免疫治疗研究提供了重要的临床前实验平台。

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我们感谢杰西卡·塞兰德女士在制作图表过程中提供的艺术协助。本研究由美国国家过敏与传染病研究所/国立卫生研究院（NIAID/NIH）资助，项目编号RO1AI078806；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR），项目编号P30AI28697；加州再生医学研究所，项目编号TR4-06845；美国艾滋病研究基金会（amfAR），项目编号#108929-54-RGRL；以及加州大学多校区研究计划与倡议、加州抗病毒药物发现中心（CCADD）资助。

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<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
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<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
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<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着基于CAR和造血干细胞（HSC）的工程化免疫疗法逐步推进至临床研究阶段，建立合适的动物模型以深入研究这些工程化细胞的分化与功能显得尤为重要。在本方案中，我们描述了构建和测试携带经基因修饰、靶向HIV的人源化小鼠的方法。在移植前实现干细胞的高效转导至关重要。然而，由于T细胞在识别靶细胞后具有增殖能力，即使干细胞的修饰水平较低，也足以产生针对HIV复制的强效免疫应答8。
然而，为了实现高效的干细胞修饰，我们建议在小鼠手术中使用经转导的 CD34+ 细胞与自体胸腺组织共同植入，而不是采用此前文献中描述的肝脏和胸腺组织块13-15。明胶样蛋白混合物是一种富含细胞外基质蛋白的可溶性组织基底膜。在正常生理条件下，明胶样蛋白混合物可聚合形成重建的、具有生物学活性且稳定的基质，从而有效促进干细胞的黏附与分化20。术后6至8周可通过眶后静脉取血并结合流式细胞术检测人源细胞的重建情况。为确保载体对干细胞的存活与自我更新无毒性，建议在实验前按照1.2.6节所述方法在CD34+细胞中对载体进行滴度测定。
<p class="jo...

尽管联合抗逆转录病毒疗法已取得成功，HIV感染仍是一种终身性疾病。机体针对HIV的细胞免疫反应在控制HIV复制过程中发挥着极为重要的作用。近年来，干细胞操作技术的进步推动了HIV治疗基因疗法的快速发展1-3因此，拥有一个合适的动物模型至关重要，该模型能够允许 体内 细胞疗法抗HIV功效的研究
由于HIV仅感染人类细胞，因此在动物模型中研究HIV具有复杂性。为克服这一限制，科学家已采用诸如在恒河猴中使用猴免疫缺陷病毒（SIV）等疾病模型4,5。然而，该模型存在重大局限性，原因在于物种间的固有差异以及SIV与HIV之间的不同。此外，仅有高度专业化的设施能够支持非人灵长类动物的研究工作，且每只恒河猴都需要大量投入。因此，迫切需要一种能够利用对HIV感染/致病过程易感的人类免疫系统、且经济成本较低的模型。
非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（SCID）-共同γ链敲除（cγ-/-)（或NSG）血液/肝脏/胸腺（BLT）人源化小鼠模型已被 increasingly 证明是研究HIV感染的重要工具。通过移植造血干细胞（HSCs）和胎儿胸腺组织，这些小鼠能够发育并重建人类免疫系统1-3一种基于干细胞的基因疗法是通过重编程造血干细胞（HSCs），使其分化为抗原特异性T细胞，从而“重定向”外周T细胞以靶向HIV。我们先前已证明，在人源化NSG-BLT小鼠模型中，利用分子克隆的针对HIV-1 Gag蛋白SL9表位（氨基酸77-85；SLYNTVATL）的抗HIV特异性T细胞受体（TCR）对HSCs进行基因工程改造，可引导干细胞发育为成熟的T细胞，进而抑制HIV的复制。6使用分子克隆T细胞受体（TCR）的局限性在于其受限于特定的人类白细胞抗原（HLA）亚型，从而限制了该疗法的应用范围。相比之下，嵌合抗原受体（CAR）可普遍适用于所有HLA亚型。早期研究采用了一种嵌合抗原受体，其由人CD4分子的胞外区和跨膜区与CD3分子的胞内ζ信号域融合而成（称为CD4ζCAR）。在CD8 T细胞上表达的CD4ζCAR能够识别HIV包膜蛋白，并触发类似于T细胞受体介导的细胞毒性T细胞反应。7我们最近证明，人HSCs可经CD4ζCAR修饰，随后分化为多种造血谱系，包括能够在人源化小鼠模型中抑制HIV复制的功能性T细胞。8随着嵌合抗原受体癌症疗法的快速发展9以及对强效广谱中和抗体的持续表征10-12 针对HIV的单链抗体CAR构建成为可能，因此除了CD4ζCAR之外，许多新的候选构建体将被开发并用于基于干细胞的HIV及其他疾病基因治疗的研究。此外，包含这些抗原特异性CAR的人源化NSG-BLT小鼠模型也可作为有效工具，用于深入研究人类T细胞应答 在体内重要的是，我们的方案与此前报道的人源化BLT小鼠构建方法有所不同13-15 其中，以明胶蛋白混合物中的造血干细胞替代胎肝主干16本方案描述了以下内容：1）构建携带CD4ζCAR的人源化BLT小鼠；2）表征基因修饰细胞的分化特性；3）表征基因修饰细胞的功能特性。

<table><tbody><tr><td>CD34 微珠试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>用于分选人 CD34+ 祖细胞</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>QIAamp 病毒 RNA 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>用于检测血清中的病毒载量</td></tr><tr><td>MACSQuant 流式细胞仪</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>用于流式分析</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>用于流式分析</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&amp;nbsp;</td><td>用于组织消化</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&amp;nbsp;</td><td>用于组织消化</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Life technology</td><td>17104-019&amp;nbsp;</td><td>用于组织消化</td></tr><tr><td>CFX 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Biorad</td><td></td><td>用于检测病毒载量和基因表达</td></tr><tr><td>小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>用于构建人源化小鼠</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>哌拉西林/他唑巴坦</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>两性霉素 B（Fungizone 抗真菌剂）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>自动夹伤口夹，9 mm，1000 个/盒</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&amp;nbsp;</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>无菌聚酯加强型 Aurora 外科手术服，每箱 30 件&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&amp;nbsp;</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>缝线，4-0，Vicryl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>23000J304H&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>酒精消毒片&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>3583006818</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>外科手套，6.5 号</td><td>Owens and Minor</td><td>4075711102</td><td>用于手术</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s 无血清 T 细胞培养基</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-102</td><td>用于 CD34+ 细胞转导</td></tr><tr><td>人血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>用于 CD34+ 细胞转导</td></tr></tbody></table>

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗hiv感染

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

随着基于干细胞的HIV基因疗法的快速发展，迫切需要一种动物模型来研究经基因修饰细胞的造血分化及免疫功能。人源化骨髓/肝脏/胸腺（BLT）小鼠模型能够在外周系统中完全重建人类免疫系统，包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。该模型中的人源胸腺移植物还可支持T细胞在自体胸腺组织中的胸腺选择过程。除用于HIV感染研究外，该模型也是研究造血干细胞（HSCs）来源细胞分化、发育及功能的有力工具。本文概述了人源化非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（SCID）-共同γ链敲除（cγ-/-)-骨髓/肝脏/胸腺（NSG-BLT）小鼠，其造血干细胞（HSCs）经CD4嵌合抗原受体（CD4CAR）慢病毒载体转导。我们证明，CD4CAR修饰的造血干细胞能够成功分化为多种细胞谱系，并具有抗HIV活性。本研究旨在展示NSG-BLT小鼠模型在 体内 用于构建抗HIV工程化免疫的模型。需要注意的是，由于实验中使用了慢病毒和人体组织，所有实验操作和手术均应在生物安全二级（BSL2）条件下，于配备特殊防护措施（BSL2+）的二级生物安全柜中进行。

图1展示了利用基因修饰干细胞构建人源化BLT小鼠的示意图。在移植手术后10周，处死小鼠以评估基因修饰细胞的分化与发育情况。如图2所示，从一只经CD4ζCAR修饰的小鼠中获取了多种淋巴组织（血液、脾脏、胸腺和骨髓）。本实验方案中使用的CD4ζCAR包含CD4嵌合抗原受体和GFP，可通过抗CD4抗体以及GFP8的表达进行检测。分离细胞后，使用抗人CD45抗体及抗CD4抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析。检测到GFP与CD4双阳性细胞，表明CD4CAR+细胞存在于多种淋巴组织中。
为了研究基因修饰细胞的分化情况，使用针对人CD45（淋巴细胞）、CD3（T细胞）、CD19（B细胞）、CD14（单核细胞和巨噬细胞）以及CD337（NK细胞）的抗体对脾细胞进行染色。如图3所示，CD4ζCAR造血干细胞可分化为多种细胞谱系。
<p ...

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

随着基于干细胞的HIV基因疗法的快速发展，迫切需要一种动物模型来研究造血……

本实验的总体目标是构建经嵌合抗原受体修饰的人源化小鼠。该方法有助于解答艾滋病与免疫学领域中的关键问题，例如评估基于干细胞的工程化免疫系统在抵抗HIV感染及其他慢性感染和恶性肿瘤方面的有效性，以及探究免疫系统功能衰竭的机制，增强免疫系统功能的方法，并开发可增强抗病毒或抗肿瘤免疫能力的治疗策略。该技术的主要优势在于能够进行大量实验操作。人源化BLT小鼠模型可模拟人类免疫系统，在本案例中可用于针对HIV感染的细胞基因治疗的临床前测试。演示该实验流程的将是Valerie Rezek和Brianna Lam，她们是我实验室的技术人员。首先，在含有补充RPMI培养基的培养皿中，使用手术刀将胸腺切成约1立方毫米大小的小块。然后用弯头钝性镊子将每一块胸腺组织分别放入96孔板的单个孔中。向所有孔中加入100–200 µL培养基，以防止组织干燥。在显微镜下观察组织，剔除任何可能不是胸腺的组织或带有结缔组织的部分。随后，将确认的胸腺组织取出并收集至一个 T25 细胞培养瓶中。向培养瓶中加入 7 mL 含抗生素的 RPMI 培养基，轻轻摇动以混匀。然后将烧瓶放入组织培养箱中。此步骤可防止组织受到细菌污染。在含有IMDM的培养皿中，使用两把解剖刀将肝脏切成约3立方毫米大小的小块，以开始从胎肝中分离CD34阳性造血干细胞。去除并丢弃所有白色结缔组织。然后使用配备16号钝头针头的10毫升注射器吸取肝脏组织块及培养基，转移至50毫升锥形管中。轻柔吹打五到七次，以彻底匀浆组织。配制10毫升IMDM培养基后，加入胶原酶、透明质酸酶、抗生素、DNase和抗真菌剂。将培养基通过0.22微米滤器过滤。然后将过滤后的培养基加入肝组织悬液中。盖紧含有肝细胞悬液的50毫升锥形管，再用自封膜（如Parafilm）密封，以防泄漏。将管子置于37°C培养箱中的管子旋转仪上旋转孵育90分钟。孵育结束后，将消化后的细胞悬液通过100微米细胞滤网过滤至新的50毫升管中。加入 PBS 至悬浮液中，使总体积达到 50 毫升。将悬液分装至两个 50 毫升离心管中，每管含 25 毫升细胞悬液。缓慢且轻柔地向每管中加入 10 毫升密度梯度离心介质（如 Ficoll），使其沉降至细胞下方。在1200 × g条件下离心20分钟，期间不得中断。离心后，小心地从每根试管中移取界面层，并转移至两个独立的50毫升离心管中。用PBS将每管界面层的体积补至50毫升。然后在300 × g下离心7到10分钟。用50 mL含2% FBS的PBS将细胞沉淀合并并洗涤3次，每次300 × g离心7至10分钟。最后一次离心后，将沉淀重悬于50 mL RPMI培养基（含10% FBS）中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，根据制造商说明书，立即使用CD34分选试剂盒分选CD34阳性细胞，并分别保存CD34阳性与CD34阴性组分。将培养瓶中的胸腺组织碎片

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医学

干细胞基工程免疫抗HIV感染的人性化小鼠模型

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。...

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

本视频展示了一种构建人免疫系统（HIS）小鼠模型的技术。从人脐带血富集层细胞中，使用抗体包被的磁珠分离出 CD34+ 造血干细胞（HSCs）。CD34+ HSCs 在富含细胞因子的生长培养基中进行扩增，并进行冷冻保存。最后，将解冻后的 HSCs 注射到免疫缺陷小鼠幼鼠体内，以建立 HIS...

分离脐带血造血干细胞以制备人免疫系统小鼠

本视频展示了一种构建双人源化小鼠模型的方法，该模型同时具有人免疫系统和人肝细胞。该方法包括将人肝细胞和造血干细胞与祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内。...

开发含有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

该视频展示了一种利用基于干细胞的工程化免疫系统构建人源化小鼠模型的技术，以抵抗人类免疫缺陷病毒（HIV）。将人类胎儿胸腺组织和经过基因工程改造的造血干细胞（HSCs）植入重度免疫缺陷小鼠的肾包膜下。这些表达针对HIV的嵌合抗原受体（CARs）的HSCs被混合于一种胶状蛋白质混合物中，以促进其与胸腺组织的共定位。术后，HSCs分化为多种人类免疫细胞，从而形成功能性人类免疫系统对抗HIV的人源化小鼠模型。...

构建具有抗HIV工程化免疫系统的人源化小鼠模型

本方案提供了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人源造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有响应，是研究HIV复制与潜伏的理想病理生理模型。...

人源化 NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 小鼠模型在 HIV 复制与潜伏研究中的应用

本方案提供了一种可靠的方法，用于建立同时具有人类免疫系统和肝细胞的人源化小鼠模型。双重建免疫缺陷小鼠实现 通过 人肝细胞和CD34的脾内注射+...

建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

本文介绍了三种用于研究人源化小鼠中 HIV...

人源化免疫缺陷小鼠模型中的慢性、急性及再激活HIV感染

我们建立了一种基于干细胞移植、阴道内人类免疫缺陷病毒暴露以及液滴数字PCR...

用于阴道内HIV暴露及HIV感染治疗研究的人源化NOG小鼠

本方案描述了一种新型的口服联合抗逆转录病毒药物递送方法，该方法在人源化小鼠中成功抑制了HIV-1...

HIV-1感染人源化小鼠的口服联合抗逆转录病毒治疗

本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。...

在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

了解利用CD34阳性造血干细胞和胸腺组织构建人源化BLT小鼠模型的方法，用于测试抗HIV的工程化免疫疗法。该模型为HIV免疫治疗研究提供了重要的临床前实验平台。

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

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