干细胞基工程免疫抗HIV感染的人性化小鼠模型

该程序的总体目标是创建用嵌合抗原受体修饰的人源化小鼠。这种方法可以帮助回答 HIV 和免疫学领域的关键问题，即测试基于干细胞的工程免疫对 HIV 感染和其他慢性感染和恶性肿瘤的疗效。例如免疫失败的机制和增强免疫系统的方法，并开发一种疗法来产生更好的抗病毒或抗肿瘤免疫力。

这种技术的主要优点是它能够进行大量的实验作。人源化 BLT 小鼠模型模拟人类免疫力，在这种情况下，允许对针对 HIV 感染的基于细胞的基因疗法进行临床前测试。演示该程序的是 Valerie Rezek 和 Brianna Lam，他们是我实验室的技术人员。

首先用手术刀将胸腺切成约 1 毫米的小块，切成小块，放入含有补充 RPMI 培养基的培养皿中。然后使用弯曲的钝镊子将每个胸腺块放入 96 孔板上的单个孔中。向所有孔中加入 100-200 微升培养基，使组织不会干燥。

在显微镜下观察组织，以消除任何可能不是胸腺或附着结缔组织的组织。接下来，取出确认的胸腺碎片，将它们合并到 T25 细胞培养瓶中。向培养瓶中加入 7 mL 补充了抗生素的 RPMI 培养基，轻轻摇动混合。

然后将培养瓶放入组织培养箱中。此步骤可防止组织受到细菌污染。通过使用两把手术刀将肝脏切成约 3 毫米的小块，在含有 IMDM 的培养皿中切块，开始从胎儿肝脏中分离 CD34 阳性 HSC。

去除并丢弃任何白色结缔组织。然后使用装有 16 号钝针的 10 毫升注射器取出肝脏碎片和培养基，并转移到 50 毫升锥形管中。轻轻吸取并排出 5 到 7 次，以使组织完全匀浆。

制备 10 毫升 IMDM 培养基后，补充胶原酶、透明质酸酶、抗生素、Dnase 和抗真菌剂。使介质通过 0.22 微米过滤器。然后将过滤后的培养基添加到肝脏悬液中。

加盖含有肝脏悬液的 50 毫升锥形管后，用自密封膜（如封口膜）密封，以防止泄漏。在 37 摄氏度培养箱中旋转管旋转器 90 分钟。孵育后，通过 100 微米细胞过滤器将消化的细胞悬液过滤到新鲜的 50 毫升试管中。

向悬浮液中加入 PBS，使总体积达到 50 毫升。将其分成两个 50 毫升的试管，每个试管含有 25 毫升的细胞悬液。用 10 毫升 a 密度离心培养基（如 Ficoll）减慢并轻轻覆盖每个试管中的细胞。

以 1200 倍 g 离心 20 分钟，不间断。离心后，小心地从每根试管中取出接口，并将其转移到两个单独的 50 mL 试管中。用 PBS 使每管接口的体积达到 50 毫升。

然后以 300 倍 g 离心 7 至 10 分钟。混合细胞沉淀物，用 50 毫升含 2% FBS 的 PBS 洗涤 3 次，每次以 300 次 g 离心 7 至 10 分钟。最后一次旋转后，将沉淀重新悬浮在 50 毫升 RPMI 培养基和 10% FBS 中。

使用血细胞计数器计数细胞。接下来，根据制造商的方案，立即使用 CD34 分选试剂盒对 CD34 阳性细胞进行分选，并保存 CD34 阳性和 CD34 阴性组分。将培养瓶中的胸腺块和培养基倒入 60 毫米的培养皿中。

将一些外置活塞式移液器吸头放入冰上的开放式 1.5 ml 无菌螺旋盖管中，使其冷却。此外，将细胞沉淀和一体积的凝胶状蛋白质混合物（如基质胶）置于冰上。根据批准的动物方案，用注射麻醉剂麻醉受体小鼠。

通过挤压爪子检查鼠标的麻醉水平。对捏没有反应表明手术麻醉平面。从臀部到肩膀，从背部中心和腹部之间剃掉每只鼠标的左侧。

皮下注射每公斤 6 毫克稀释的卡洛芬到动物的肩部或腹股沟三角区。在 60 毫米培养皿中用 PBS 冲洗套管针的套管。使用一对钝弯曲的镊子，将 60 毫米盘中的一块胸腺放入套管开口内，然后拉回套管针以将组织吸入套管。

接下来，使用外置活塞式移液器和冷冻吸头将 5 微升冷凝胶状蛋白质混合物加入装有细胞沉淀的试管中。并轻轻搅拌以生成细胞悬液。将细胞悬液移液到套管的开口中，然后慢慢拉回套管针以加载针头。

用聚维酮碘擦拭小鼠的剃光区域，然后用异丙烯擦拭 3 次。确定皮肤下最黑的点，表明脾脏的位置。肾脏位于脾脏背侧约 5 毫米处。

子捏合反应的情况下确保适当的麻醉水平后，使用弯曲的镊子提起皮肤，并使用手术剪刀在平行于脾脏的皮肤上切开 15 毫米的切口。然后在下面的腹膜层做一个类似的切口。在男性中，肾脏很容易看到，因此只需按压腹部即可挤出。

用止血钳或一对弯曲的钝镊子支撑肾脏。在女性中，卵巢往往会阻止肾脏轻松提取。使用止血钳，取出卵巢并小心地露出肾脏。

使用针尖镊子在肾包膜后端挖一个小孔。将套管针滑入这个孔中并沿着肾脏滑入，直到套管的开口完全被肾包膜覆盖。轻轻挤出肾包膜下的组织，然后将套管针拉出。

使用弯曲的镊子确保胸腺片不会随针头一起出来。接下来，用镊子提起腹膜，轻轻使用止血钳将肾脏推回原位。在腹膜中用手术缝合线打一针双结。

此外，放置两个 Autoclips Wound 剪辑以闭合皮肤。现在混合转导的 CD34 阳性细胞，并以 100 μL 体积将 0.5 乘以 10 的剂量吸至六个细胞中，放入胰岛素注射器中。通过眼眶后静脉注射将这些细胞注射到小鼠体内。

注射后，将一小滴眼液擦拭到每只眼睛上，然后将鼠标侧放到笼子里。植入所有小鼠后，确认动物已经恢复了意识并且可以走动，然后再将它们送回饲养室。手术后 10 周处死小鼠，收获血液、脾脏、胸腺和骨髓。

用抗人 CD45 和抗人 CD4 抗体对所得细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。如图所示，可以通过流式细胞术在多个淋巴组织中检测到 CD4 嵌合抗原受体修饰细胞。CD4 嵌合抗原受体修饰细胞可以分化为多个谱系。

在这里，收获来自 CD4 嵌合抗原受体修饰小鼠的脾细胞并对 T 细胞和 B 细胞的标志物进行染色。T 细胞和 B 细胞标志物阴性的细胞对单核细胞和巨噬细胞标志物以及自然杀伤细胞呈阳性。来自 HIV 感染的 CD4 嵌合抗原受体小鼠的脾细胞被 HIV 感染或未感染的 T 1 细胞刺激，并显示它们在细胞内产生细胞因子。

看完这个视频，你应该对如何构建用嵌合抗原受体修饰的人源化 BLT 小鼠有一个很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 48 小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住以稳定的速度工作并密切注意正在作的鼠标的状态。

对于初学者来说，在处理更珍贵的组织和干细胞之前练习手术和眼部注射很重要。开发后，这项技术为 HIV 和其他传染病领域的研究人员在人源化小鼠模型中探索疾病发病机制和基于免疫的疗法铺平了道路。