人体血液，脑脊液屏障的脉络丛上皮基于Cell的产品型号从基底外侧面研究细菌感染
2016年5月6日
脉络丛 （CP） 的上皮细胞形成血脑脊液屏障 （BCSFB）。BCSFB 的体外模型采用人脉络丛瘤 （HIBCPP） 细胞。本文介绍了使用细胞培养滤器插件系统对 HIBCPP 细胞进行培养和基底外侧感染。
该方法的总体目标是生成基于脉络丛上皮细胞的人类血脑脊液屏障模型。能够从基底-外侧研究细菌感染。这种方法可以帮助回答有关中枢神经系统传染病的关键问题，例如细菌与脉络丛上皮相互作用过程中涉及哪些过程。
该技术的主要优点是它允许分析病原体与上皮细胞基底外侧黑色侧的相互作用。该方法也可应用于其他研究，例如，研究免疫细胞和肿瘤细胞穿过脉络丛上皮的迁移。当我阅读 Shibata et.al 2005 年的手稿时，我第一次想到使用人脉络丛状瘤或 HIBCCP 细胞进行这种方法。
描述细胞系。首先使用无菌镊子将 0.33 平方厘米生长区域的细胞培养滤膜插入物中，将 3 微米大小的孔倒置到 12 孔板的各个孔中。然后，用血清移液管，用约 3 毫升预热的培养基淹没孔，吸出任何额外的溶液，直到下隔室刚好装满。
接下来，在过滤器顶部添加 100 微米的 37 度传代培养基，并补充有 10% 的 FCS。添加培养基时，避免产生气泡非常重要，因为气泡会阻止细胞得到足够的喂养。将培养基添加到所有小室中后，盖上板并将小室转移到 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中。
现在，用 10 毫升 PVS 洗涤一瓶 HIBCPP 细胞，涡旋洗涤两次。第二次洗涤后，向细胞中加入 3 毫升 0.25% 的 tripsyn EDTA，并旋转培养瓶。然后，将细胞孵育约 20 分钟。
在孵育结束时，确认细胞已从培养瓶底部抬起并显示圆形。细胞不会彼此完全分离，通常存在于团聚体中。用 17 毫升培养基重悬培养物以终止反应，并将悬浮液转移到 50 毫升试管中。
然后，旋转细胞，并将沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中进行计数。接下来，将细胞稀释至每毫升浓度的 1 倍 10 到 6 个细胞，并倒置试管以均匀分布细胞。然后，在每个过滤器插件的顶部添加 80 微升细胞。
当所有插入片段都接种完毕后，盖上板，然后将其放回培养箱中进行过夜培养。第二天，向 24 孔板的每个孔中加入 1 mL 培养基。然后，使用镊子提起每个插入物并丢弃里面的培养基，将插入物正面朝上放入 24 孔板的各个孔中。
当过滤器插件从 12 孔板翻转到 24 孔板时，小心不要让细胞生长在顶部时接触滤膜。用 0.5 mL 新鲜培养基填充插入物，然后将板放回培养箱中。每两天将插入物转移到装有新鲜培养基的新 24 孔板中，从而更换上部隔室中的培养基。
要测量细胞的跨上皮电阻或 TEER，首先将上皮组织伏欧姆表的电极尖端浸入 80% 的乙醇中。15 分钟后，从乙醇中取出电极，让电极干燥。然后，将吸头放入等分的传代培养基中再放置 15 分钟。
当电极平衡后，放置较长的臂，使其接触细胞培养板的一个孔的下室底部，放置较短的臂，使其伸入过滤器插入室。在无细胞培养基中测量细胞培养过滤器插入片段的电阻值，以获得空白值。然后，测量每个种子插入片段的 TEER。
测量后，将电极放回 80% 乙醇中 15 分钟，然后储存在干管中。当 HIBCPP 接种插入片段的 TEER 值超过每平方厘米 70 欧姆时，使用补充有每毫升 5 微克胰岛素和 1% FCS 的新鲜培养基更新培养基，并将板放回细胞培养箱过夜。为了确定插入室培养物的细胞旁通透性，将每毫升新鲜制备的 FITC-菊粉在新鲜血清低培养基中加入到每个插入物的上过滤室中，然后将细胞放回培养箱中。
当培养物达到每平方厘米约 500 欧姆的 TEER 时，用感兴趣的细菌悬浮液感染细胞，感染倍数为 10，并将细胞放回培养箱中进行适当的培养。然后，将过滤器转移到装有 1 mL 无血清培养基的新孔中，洗涤细胞 3 次。每次，将培养基放入装有 500 微升相同培养基的过滤室中，最后，通过从每个细胞培养过滤器插件的下孔收集培养基样品，并在微量读板器中测量所有样品，确定细菌感染后通过细胞层的菊粉浓度 FITC-菊粉标准稀释液。
HIBCCP 细胞表现出特定的屏障功能，使它们能够在一定程度上限制其分子交换。例如，对与蛋白质 ZO-1、Occludin 和 Claudin-1 相关的类型连接进行免疫荧光分析，可在细胞间接触的位点显示不间断的信号。通过连续的紧密连接链来说明细胞的互连性。
在适当的条件下培养时，HIBCPP 细胞表现出高膜电位，无需处理即可达到每平方厘米约 500 欧姆，维持了血脑脊液屏障的典型屏障功能，如膜电位的形成，以及大分子的低渗透性。然而，随着 DMSO 浓度的增加，TEER 值以剂量依赖性方式降低，在细胞松弛素 D 处理后观察到 TEER 值也出现类似的显着下降。此外，添加 2 体积百分比的 DMSO 或细胞松弛素 D 导致 FITC-菊粉通量的相应通透性显着增加。
此外，HIBCCP 细胞的细菌感染导致两种病原菌菌株显着侵入细胞层。MC58 及其胶囊缺陷突变体。而仅观察到对冷漠性 alpha 14 菌株的轻微侵袭。
在尝试此过程时，请务必记住在接种细胞后不要触摸滤膜，因为完整的 HIBCCP 层会因接触而破裂。在此程序之后，可以进行其他方法，如体外迁移测定，以回答有关免疫和肿瘤细胞跨脉络丛上皮细胞迁移机制的其他问题。开发后，这项技术为该领域药理学的研究人员在体外探索底物穿过脉络丛上皮的转移铺平了道路。
看完这个视频，你应该对如何准备一个基于 HIBCCP 细胞的血脑脊液屏障模型有一个很好的了解，用于病原体的基底外侧感染。不要忘记，与人类病原体一起工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在适当的安全罩下工作。
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概览
本文介绍了一种生成基于脉络丛上皮细胞的人类血脑脊髓屏障（BCSFB）模型的方法。该模型利用人类脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞从基底侧面研究细菌感染。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 传染病学
背景
- 脉络丛形成了BCSFB，对中枢神经系统稳态至关重要。
- 了解细菌与脉络丛上皮的相互作用对于解决中枢神经系统感染至关重要。
- HIBCPP细胞为研究这些相互作用提供了相关模型。
- 该方法还可用于研究免疫和肿瘤细胞的跨膜迁移。
研究目的
- 开发用于研究BCSFB处细菌感染的模型。
- 探索细菌与脉络丛上皮相互作用的过程。
- 促进研究免疫和肿瘤细胞在脉络丛上的行为。
使用的方法
- 使用细胞培养过滤器插入系统培养HIBCPP细胞。
- HIBCPP细胞的基底侧感染以模拟细菌相互作用。
- 分析病原体与上皮细胞的相互作用。
- 应用该模型研究免疫和肿瘤细胞的跨膜迁移。
主要结果
- 成功建立了脉络丛上皮细胞模型。
- 洞察细菌与BCSFB的相互作用。
- 研究免疫和肿瘤细胞动力学的潜在应用。
- 增强对中枢神经系统传染病机制的理解。
结论
- 开发的模型是研究中枢神经系统感染的有价值工具。
- 它允许对病原体-上皮相互作用进行详细分析。
- 该方法可以为未来的免疫和肿瘤细胞行为研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This model enables mechanistic de-risking of CNS-targeted therapeutics by simulating pathogen interactions at the blood-cerebrospinal fluid barrier from the physiologically relevant basolateral side. It supports target validation and assay development for anti-infective strategies against meningitis-causing bacteria like N. meningitidis. The system provides predictive confidence in early discovery by quantifying bacterial invasion and adhesion through standardized TEER and permeability readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding bacterial virulence factors and host-pathogen interactions at the BCSFB.
- Operational Value: Enables functional target validation via quantitative measurement of pathogen invasion and adhesion using double immunofluorescence.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that reduce bacterial translocation across epithelial barriers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for high-throughput screening of antimicrobial compounds.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible TEER and FITC-inulin permeability assays for barrier integrity assessment.
- Scalability: Enables platform reuse across pathogen strains and compound libraries with defined multiplicity of infection (MOI=10) protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models disease-relevant CNS infection pathways applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory conditions.
- Preclinical Alignment: Connects early discovery to mechanistic de-risking of CNS-penetrant therapeutics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on pathogen-induced barrier disruption thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, specifically for CNS infectious disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of bacterial transmigration mechanisms and pathway clarification of virulence factor engagement.
- Screening: Delivers assay readiness through TEER stabilization (>500 Ω·cm²) and low macromolecular permeability baselines.
- Analytics: Provides quantitative readouts of invaded and adhered bacteria via fluorescence intensity, enabling dose-response and inhibition profiling.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant BCSFB pathophysiology in infection and metastasis contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying immune, tumor, and pathogen cell migration across choroid plexus epithelium.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in CNS infection models.
- Operational Value: Standardization of barrier assays, reproducibility across inserts, scalability to 24-well formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on CNS-active compounds, capital efficiency via early de-risking, reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of antimicrobial leads based on barrier penetration efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, tight junction biology, and pathogen handling under BSL-2 conditions.
- Dependent on epithelial tissue volt-ohm meters for TEER, fluorescence microscopes for immunofluorescence, and plate readers for permeability assays.
- Necessitates cross-team standardization of infection timing, MOI, and wash protocols between virology, microbiology, and assay development groups.
- Adaptation considerations include varying pore sizes, coating matrices, and infection durations for different pathogen models.
- Practical limitations include susceptibility to mechanical disruption of the epithelial layer during insert handling and variability in TEER maturation timelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Human Choroid Plexus Papilloma (HIBCPP) Cell Culture Filter Insert Seeding
4:25
Transepithelial Electrical Resistance (TEER) Measurement
5:50
Paracellular Permeability Determination
7:06
Results: Representative HIBCPP Barrier Function Analysis
8:48
Conclusion
