Name: 从冷冻芯的外层部分外源物质的去除探讨古代生物群落里面窝藏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解永久冻土芯采集与去污技术，在受控实验室环境中去除外源物质，研究冰川冰和永久冻土中保存的微生物，揭示历史生态系统中的微生物多样性。

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本工作由美国陆军工程研究与发展中心基础研究项目办公室资助。发布此信息已获得工程师主管的许可。

1. 仪器准备与永久冻土岩心采集
<ol>
	<li>设备准备及野外样品采集与保存装备
	<ol>
		<li>将驱动适配器插入钻筒顶部，并旋转杠杆将其锁定，组装用于样品采集的螺旋钻。将适配管销接在驱动适配器上，再将电机销接在适配管上。在钻筒上安装切削刀具。</li>
		<li>穿戴轻型防护服、腈类手套和口罩，以减少对样品的任何污染。进入永久冻土隧道时，应佩戴听力保护装置和安全帽以确保安全。图1).</li>
		<li>进入隧道并选择采样位置（图1B). 
		注意：对于垂直或水平钻孔位置，应选择有已知证据表明材料处于冻结状态的区域例如，冰或永久冻土），无已知的大型根系，且无已知的砾石。采样前应清除该区域所有活体植物材料。若进行垂直或水平钻取，应选择地势相对平坦且便于使用钻具到达的区域。</li>
		<li>用70%异丙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液对塑料材质进行消毒后铺于地面，以制备工作台。</li>
		<li>将一根直径为10 cm的聚氯乙烯（PVC）管沿纵向切成两半，放置在工作台上，用作收集从土钻中取出的土芯的槽道。使用70%异丙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液对PVC管进行去污染处理。</li>
		<li>在工作台附近，使用70%异丙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液喷洒钻头进行去污染。用擦拭纸清除钻头上的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冰和永久冻土岩心的采集与保存
	<ol>
		<li>选择待采样的墙面区域（参见1.2.1注意事项）。</li>
		<li>用70%异丙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液擦拭约10 cm直径的冷冻箱内壁区域进行去污染。</li>
		<li>将已去污的钻具提升至目标区域，使其与样本区域垂直，并开始向墙面的清洁表面钻孔（图1C，D).</li>
		<li>小心地将钻孔器从采样区域取出。断开钻孔器与电机的连接，并将钻孔器置于洁净工作台中的无菌PVC管上方。轻轻倾斜钻孔器，使冻结的岩心样品滑落到无菌PVC管上（图1E).</li>
		<li>使用70%异丙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液对手套进行去污染处理。</li>
		<li>使用无菌手套取冰芯和永久冻土芯，并将其放入无菌袋中。</li>
		<li>将样本芯置于冷藏箱或冷室中，直至运输或处理。</li>
		<li>使用干冰运输冷冻样本，以保持其温度低于 0 °C。</li>
		<li>立即将芯样储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 永久冻土与冰芯处理
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>将无菌、无核酸的加厚铝箔、金属架、玻璃器皿、金属镊子和玻璃棉置于烘箱中，在450°C下烘烤4小时。处理完毕后，将这些材料放置一旁备用。</li>
		<li>使用0.22 µm滤器过滤95%乙醇和超纯水以进行灭菌。</li>
		<li>将乙醇溶液于 -20 °C 保存，水于 4 °C 保存。</li>
		<li>用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液依次喷洒塑料尺进行消毒，每喷一种溶液后立即用布擦干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌培养物制备
	<ol>
		<li>准备培养液和培养基以培养 粘质沙雷氏菌.
		<ol>
			<li>液体培养基：将5 g胰蛋白胨、1 g葡萄糖、5 g酵母提取物和1 g磷酸氢二钾混合，加蒸馏水至1 L。制备平板培养基时，在上述混合物中加入15 g琼脂。液体培养基和平板培养基均调节pH至7，于121 °C高压灭菌15 min。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将8 g氯化钠、0.2 g氯化钾、1.44 g磷酸氢二钠和0.24 g磷酸二氢钾溶于800 ml蒸馏水中，配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）。调节pH至7.4，再用蒸馏水定容至1 L。121 °C高压灭菌15 min。</li>
		<li>用无菌接种环蘸取菌液，接种于肉汤中 S. marcescens 先前于 -80 °C 冻存的菌种。在无菌条件下，将 1 ml 菌液加入 9 ml PBS 中进行连续稀释，并手动颠倒混匀。取 1 ml 该稀释液加入另一管含 9 ml PBS 的离心管中，手动颠倒混匀。重复此步骤八次，直至获得 10⁻¹⁰ 稀释度-9 稀释度达到。</li>
		<li>铺展 10-6, 10-7, 10-8，和 10-9 将1 ml液体培养基均匀涂布于琼脂平板上，使用细胞涂布器进行分散。每个稀释度设三个重复。将原始培养物保存于4 °C。</li>
		<li>在30 °C下孵育平板24小时。计数菌落数量，以计算原始培养物中的细胞数量。注意：原始培养物中的菌落数量取决于细菌的生长速率。</li>
		<li>将250 µl原始培养物移入一支无菌的1.5 ml微量离心管中。通过加入适量的1x PBS稀释原始培养物，使总体积约为109 细胞/ml，根据前一步的菌落计数确定。将细胞在微量离心管中于2,500 × g离心10分钟，收集沉淀。 
		注意：1×PBS 的体积将根据细菌的生长速率而变化。</li>
		<li>在无菌生物安全柜中，用移液器吸除培养基，并将细胞重悬于1 ml 1×PBS缓冲液中。4 °C保存，直至使用或约两个月。</li>
		<li>处理当天，稀释 S. marcescens 从2.2.7步骤的培养物中加入1 ml原液 S. marcescens 将培养物加入含有39 ml 1× PBS缓冲液的50 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备冷库空间用于岩心处理和保存设备
	<ol>
		<li>在冷却冷藏室之前，使用1%的次氯酸钠溶液清洁墙壁、地面和金属台面。</li>
		<li>将冷室温度设置为约 -11 °C。</li>
		<li>当冷藏室达到设定温度后，穿戴轻型防护服、腈手套和口罩，以减少对冷藏室和样品的任何污染。 
		注意：本操作需要两名着装规范的人员。</li>
		<li>将无菌材料（例如， 铝箔、金属架、玻璃器皿、托盘 S. marcescens 培养物、切片刀和样本放入低温室，并置于无菌台面上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>低温实验室中冻土与冰芯的处理
	<ol>
		<li>将永久冻土岩心置于无菌、无核酸的铝箔纸上。</li>
		<li>轻轻将稀释的菌液接种到核心外部 S. marcescens 使用无菌泡沫塞（图2B).</li>
		<li>将核心置于托盘上方的无菌金属架上。</li>
		<li>用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液对钢制切片刀进行灭菌。</li>
		<li>让个体A用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液清洁腈手套，并将核心样本以45°角悬于托盘上方。</li>
		<li>由个体B使用无菌刀片轻轻刮取整个芯样外表面约5毫米的范围，包括两端，同时由个体A在每次刮取后旋转芯样图2C 和 3A，B）。根据需要，用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液擦拭刀片。</li>
		<li>由操作者B将过滤除菌的95%乙醇小心且迅速地倾倒在芯部上，同时由操作者A在倾倒过程中转动芯部（图2D、图3C).</li>
		<li>让个体B立即用滤膜除菌水冲洗核心部分。</li>
		<li>将托盘上使用过的金属架更换为新的无菌金属架。</li>
		<li>让个体A用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液清洁其腈类手套，并将核心部件置于托盘上方呈45°角持握。</li>
		<li>让个体B用DNA去污染溶液喷洒整个核心。</li>
		<li>让个体B立即用滤膜除菌水冲洗核心部分。</li>
		<li>让个体B用RNase去污染溶液喷洒整个核心区域。</li>
		<li>让个体B立即用滤膜除菌水冲洗核心部分。</li>
		<li>将核心置于无菌的铝箔纸上并轻轻包裹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻外层核心
	<ol>
		<li>在无菌生物安全柜中，将一个无菌金属架放置于无菌玻璃培养皿上方。</li>
		<li>放置两块特定的琼脂平板 S. marcescens 在无菌架下方的玻璃皿中收集芯部液体图2E).</li>
		<li>将核心部件置于无菌金属架上。</li>
		<li>在23 °C下使岩心外表面约2-5 mm厚度解冻（平均约需10分钟）。每2分钟将岩心旋转约90°。</li>
		<li>使用无菌镊子和无菌玻璃棉擦拭核心区域的整个表面，并接种至两块特定的琼脂平板上 S. marcescens 通过将这些材料涂布到平板表面进行接种。另取两块新平板，接种最初用于涂抹在核心外部的原始培养物，该培养物曾暴露于冷藏室的低温条件下。</li>
		<li>将无菌直尺置于已解冻的圆柱形岩心样本旁（但不接触样本），测量其外部尺寸。</li>
		<li>将核心样本放入大型无菌袋中，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查生长情况
	<ol>
		<li>在23 °C下孵育琼脂平板一周。</li>
		<li>检查琼脂平板上的菌落生长情况 S. marcescens 菌落。
		<ol>
			<li>若平板上无可见菌落，则进行步骤 2.5.3。</li>
			<li>若平板上出现菌落，则从第2节的2.1.1步骤开始重复操作 &#34;永久冻土与冰芯处理&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从冷冻箱中取出核心样本，并在无菌条件下转移至无菌袋中。</li>
		<li>将核心样本置于无菌袋中，在4 °C下保存约24-48小时，以完全解冻整个样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从冰芯和永久冻土中获取用于核酸提取的子样品
<ol>
	<li>从冰芯中提取核酸
	<ol>
		<li>轻轻摇晃冰芯样品袋，使冰芯融化后的材料混合均匀（图 2G）。</li>
		<li>在真空条件下，将融化后的材料倒入带有 0.22 µm 滤膜的无菌容器中，以收集微生物。</li>
		<li>使用无菌镊子无菌操作取出滤膜，并将其放入无菌的 2 ml 陶瓷珠管（1.4 mm）中。</li>
		<li>将滤膜在 -80 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从冻土岩芯中提取核酸
	<ol>
		<li>轻轻揉捏冻土岩芯样品袋，使融化后的材料混合均匀。</li>
		<li>待冻土充分混匀后，用无菌刮勺取约 0.5 g 整体土壤样品，放入已称重的无菌 2 ml 陶瓷珠螺口管（1.4 mm）中，该管应垂直放置于天平上。</li>
		<li>将子样品在 -80 °C 下保存。</li>
		<li>测定样品的重量含水量。
		<ol>
			<li>用无菌刮勺称取 10 g 冻土样品，置于已称重的锡箔罐中，并在天平上测量冻土与锡箔罐的湿重。</li>
			<li>将冻土样品置于设定为 105 °C 的烘箱中孵育 24 小时，然后测量冻土与锡箔罐的干重。</li>
			<li>通过从冻土湿重减去干重，再除以冻土干重，计算重量含水量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将冻土样品在 -80 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从永久冻土和冰芯中提取核酸
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>通过使用0.1%二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理琥珀色小瓶，37 °C孵育过夜，随后进行高压灭菌，以用于盛装溶液。</li>
		<li>配制240 mM磷酸钾缓冲液。加入2.5 g磷酸二氢钾和38.7 g磷酸氢二钾，用无菌水定容至500 ml。</li>
		<li>通过将4.1 g氯化钠溶解于80 ml水中，并在加热和搅拌条件下缓慢加入10 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），配制CTAB提取缓冲液。用无菌水定容至100 ml。</li>
		<li>将磷酸盐缓冲液与CTAB缓冲液等体积混合，并用0.22 µm滤膜过滤除菌。用铝箔包裹瓶体，室温保存。</li>
		<li>通过将9.35 g氯化钠（NaCl）溶于100 ml无菌水中，配制1.6 M氯化钠溶液。向1.6 M NaCl溶液中加入10 g聚乙二醇8000，并过滤除菌。4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据Griffiths et al.22 和 Töwe et al.23 方法的改良版进行核酸提取
	<ol>
		<li>穿戴轻型防护服、腈手套和口罩。使用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液清洁实验空间和移液器。</li>
		<li>从-80 °C冰箱中取出含有样品（冰芯或永久冻土土壤样品的滤膜）的2 ml陶瓷珠螺口管，在室温下解冻。</li>
		<li>加入0.5 ml十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取缓冲液，短暂涡旋振荡。</li>
		<li>加入0.5 ml苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）（pH 8），使用涡旋仪上的平板适配器水平摇动10分钟。</li>
		<li>珠击处理后，在4 °C下以16,100 × g离心5分钟。</li>
		<li>将水相转移至新的无菌1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），在4 °C下以16,100 × g离心5分钟。</li>
		<li>将水相转移至新的无菌1.5 ml离心管中，加入两倍体积的30%聚乙二醇8000和1.6 M NaCl溶液。在4 °C下孵育2小时。</li>
		<li>在4 °C下以16,100 × g离心10分钟。</li>
		<li>用约500 µl预冷的70%乙醇洗涤核酸沉淀，在4 °C下以16,100 × g离心10分钟。</li>
		<li>在无菌生物安全柜中将沉淀风干2小时。用50 µl无DNase/RNase的TE缓冲液（pH 8.0）重悬。所得DNA可用于后续实验，如PCR和qPCR。</li>
		<li>使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
		<li>用无菌、无DNA的水稀释DNA，使每反应体系中含20 ng DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

冰冻圈为研究在以往环境条件下得以保存的生物体提供了途径。尽管所获得的分类单元可能无法代表完整的历史群落，但通过对冰川冰和永久冻土样本的分析所获得的生物信息，仍可为特定历史时期提供有价值的资料15-16。例如，已有研究从对格陵兰冰盖中厌氧活性的冰芯研究20，以及对冻土融化导致的碳循环过程的研究33中获得了有意义的生物学信息，并揭示了白令陆桥地区永久冻土中的真菌多样性16。在对这些冻结材料中的生物群落开展下游分析之前，必须进行规范的样品采集与去污染处理。尽管这些步骤对数据解读具有重要影响，但许多研究并未提供有关样品采集与处理过程的具体细节，也未展示处理冻结材料的操作图像。例如，以往一些研究曾使用荧光微球或已知细菌对岩芯外层进行示踪标记15，但并未说明这些物质的具体浓度。其他研究虽详细描述了去污染方案，却未采用高通量分析方法来验证该方法的有效性15, 32。因此，本研究通过在培养皿上培养检测完整细菌以及利用qPCR检测外源DNA，系统筛查了样品采集、保存和分析流程的无菌程度，以确定这些操作是否足够洁净，从而准确识...

冰冻圈（例如，永久冻土、冰体特征、冰川积雪、粒雪和冰层）为了解过去环境条件下存在的生物类型提供了线索。由于这些基质的年龄可达数万至数十万年，其微生物群落在沉积后若一直处于冻结保存状态，则能够反映古代的环境状况。为了恰当地分析这些生态系统，并从冻结的土壤和冰体中提取有意义的生物学信息，必须正确采集和处理冻结样品。这一点至关重要，因为针对21世纪的气候预测表明st 世纪表明北极和亚北极地区存在显著变暖的潜力1具体而言，预计到2100年，美国阿拉斯加内陆和格陵兰的气温将分别上升约5 °C和7 °C。2,3这预计将对土壤和水生微生物群落及其相关的生物地球化学过程产生显著影响。许多地区的温度升高和降水模式改变预计将引发永久冻土的退化。2-5 可能导致更厚的季节性融化层（活动层）6,7冻土的融化，以及地下冰、冰楔和分凝冰等大量冰体的融化8这将显著改变这些生态系统中动植物的生物多样性以及生物地球化学特征。
冰川冰以及同生冻土中的沉积物和冰体特征，封存了形成这些特征时当地环境的化学与生物学证据。例如，在阿拉斯加内陆地区，存在伊利诺伊阶和威斯康星阶的古老冻土，这些冻土尤其提供了从现代至距今约15万年（YBP）的独特地点，其中包含过去气候变化对生物多样性影响的生物学和地球化学证据。因此，这些沉积物记录了数万年以来的生物地球化学过程和生物多样性演变。由于该区域沉积速率较低且从未经历冰川作用，因此可获取未受扰动的样品用于采集与分析，采样方式包括垂直钻取土壤剖面或在隧道中进行水平钻取。更重要的是，已有大量研究记录特别突出了该地区冻土独特的生物地球化学特征9-14。具体而言，通过对现存及古代冰体和冻土样品进行DNA分析，可评估生物多样性的存在及其分布范围，从而探索古代环境条件与栖息地同特定生物占据之间的关联。
以往的研究利用可追溯至距今5万年前的样本，已确定气候对哺乳动物、植物和微生物的影响11, 15-19，但这些研究在采集和去污染永久冻土或冰芯时采用了不同的方法。在某些情况下，钻取的岩芯经过了灭菌处理16, 20-21，但具体方法并未明确说明是否同时清除了样本中外源性的核酸。在其他研究中，曾使用细菌分离株15（例如，Serratia marcescens）以及荧光微球22来评估去污染程序的有效性。
本实验是一项大型研究的一部分，旨在探究可追溯至约40,000年前的永久冻土样本中的微生物群落。本部分研究的具体目标是成功去除冰层和永久冻土岩心表面的污染物。据我们所知，目前尚无方法整合使用旨在清除冷冻岩心外部外来核酸及其相关核酸酶的溶液，尽管这类溶液常用于分子实验中实验室设备的去污处理。
在对样品芯进行去污染处理后，采用Griffiths et al.23 和 Töwe et al.24 建立的方案提取基因组DNA，使用分光光度计进行定量，并用无菌、无DNA的水稀释至每反应含20 ng DNA。使用引物331F和797R以及探针BacTaq25 扩增细菌16S rRNA基因，使用引物Arch 349F和Arch 806R以及探针TM Arch 516F26 扩增古菌16S rRNA基因，扩增条件如下：95 °C 预变性600秒，随后进行45个循环，每个循环为95 °C 变性30秒、57 °C 退火60秒、72 °C 延伸25秒，最后在40 °C 下终延伸30秒。所有qPCR反应均设两个重复。每个20 µl的反应体系包含20 ng DNA、10 µM引物、5 µM探针以及10 µl qPCR反应混合液。细菌和古菌qPCR的标准品分别使用Pseudomonas fluorescens 和 Halobacterium salinarum 的基因组DNA制备。两种菌均培养至对数生长期，进行平板计数后从培养物中提取DNA。使用分光光度计对基因组DNA进行定量，并假设H. salinarum 和 P. fluorescens 每基因组分别含有1个和6个拷贝的16S rRNA基因27-28。根据标准曲线计算细菌和古菌基因的拷贝数，为消除不同处理间方差不等的影响，对数据进行对数转换，随后采用ANOVA进行统计分析。
通过使用流动池和桥式扩增技术对16S rRNA基因进行测序，并利用“微生物生态学定量分析”（QIIME）29对群落进行分析，以确定群落组成。将正向和反向测序读段拼接后，对序列进行过滤、索引，并筛选高质量的代表性序列，通过与参考数据库进行序列比对，进行从头（de novo）操作分类单元（OTU）划分。将比对后的序列与另一个独立的参考数据库进行比对，以完成分类学注释。构建门水平的OTU表，用于确定群落的整体组成。

<table><tbody><tr><td>奥杰</td><td>雪冰与永久冻土研究机构（SIPRE），费尔班克斯，阿拉斯加州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>沃尔玛</td><td>551116880</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇（变性）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>A407-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA去污染溶液，DNA Away</td><td>Molecular Bio-Products, Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>RNase去污染溶液，RNase Away</td><td>Molecular Bio-Products, Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥&amp;nbsp;</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>轻型防护服</td><td>Kimberly-Clark Professional，罗斯威尔，GA</td><td>10606</td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>FFS-700</td><td></td></tr><tr><td>抗病毒口罩</td><td>屈拉德，沃尔格林</td><td>CUR3845</td><td></td></tr><tr><td>无菌采样袋&amp;nbsp;</td><td>Nasco，Fort Atkinson，WI</td><td>B01445</td><td></td></tr><tr><td>钢制切片刀&amp;nbsp;</td><td>B-Sharp 微型刀，美国北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属架</td><td>在美国新罕布什尔州汉诺威的CRREL制造</td><td></td><td></td></tr><tr><td>托盘</td><td>Handy Paint Products，Chanhassen，MN</td><td>7500-CC</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Western Plastics，加利福尼亚州特梅库拉</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml 带有 0.22 的瓶子&amp;nbsp;&amp;mu;m 滤光片</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;粘质沙雷菌&lt;/em&gt;</td><td>ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>17991</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>NuAire，明尼苏达州普利茅斯</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 琼脂 181-胰蛋白胨</td><td>Acros Organics，新泽西州</td><td>61184-5000</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 琼脂 181-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 琼脂 181-酵母提取物</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>BP1422-500</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 琼脂 181-磷酸二氢钾</td><td>JT Baker，菲利普斯堡，新泽西州</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 琼脂 181-琼脂</td><td>Difco，斯帕克斯，马里兰州</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific，特拉华州威尔明顿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 系统</td><td>罗氏分子系统公司，印第安纳波利斯，印第安纳州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;盐杆菌 salinarum&lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas fluorescens&lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物DNA提取试剂盒</td><td>MoBio Laboratories，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>12224-50</td><td></td></tr><tr><td>听力保护</td><td>Elvex</td><td>EP-201</td><td></td></tr><tr><td>安全帽</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional，罗斯威尔，GA</td><td>34705</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Pyrex</td><td>430330</td><td></td></tr><tr><td>尺子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>称量锡&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>S-9625</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>JT Baker，菲利普斯堡，新泽西州</td><td>3040-04</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>JT Baker，Phillipsburg，NJ</td><td>&amp;nbsp;3246-01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>JT Baker，菲利普斯堡，新泽西州</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>康宁，纽约州，康宁</td><td>4558</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微型离心管</td><td>MoBio Laboratories，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>1200-250-T</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 陶瓷珠管（1.4&amp;nbsp;mm</td><td>MoBio Laboratories，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>13113-50</td><td></td></tr><tr><td>药勺</td><td>赛默飞世尔科技公司，特拉华州威尔明顿</td><td>1437520</td><td></td></tr><tr><td>平衡</td><td>Ohaus，帕西帕尼，新泽西州</td><td>E12130</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics，新泽西州</td><td>22716-5000</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P5413-1KG</td><td></td></tr><tr><td>苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）（pH 8）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>BP1752-400</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf，美国纽约州霍普奇</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿-异戊醇（24:1）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>C0549-1PT</td><td></td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td>Ambion（Thermo Fisher），特拉华州威尔明顿</td><td>AM9860</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Rainin，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>Pipet Lite XLS，2、10、200 和 1,000 &amp;micro;移液管</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Rainin，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>Rainin LTS 预灭菌、低吸附、带滤芯吸头，10、20、200、1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries，博伊米亚，纽约州</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>涡旋适配器</td><td>MoBio 实验室，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>13000-V1</td><td></td></tr><tr><td>透明瓶</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>C1395500</td><td></td></tr><tr><td>琥珀色瓶子</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>C5135250</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td>Becton, Dickenson and Company，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>BD 309653</td><td></td></tr><tr><td>密理博注射器滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore，比勒里卡，马萨诸塞州</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>BP2818-500</td><td>稀释的 &amp;且经滤膜除菌</td></tr><tr><td>Isotemp 100 L 烤箱</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>151030511</td><td></td></tr><tr><td>细胞涂布棒</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>08-100-10</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州</td><td>22-363-602</td><td></td></tr></tbody></table>

去除冰芯外层的外源物质以研究其内部封存的古代生物群落

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

冰冻圈为我们提供了研究在以往环境条件下得以保存的生物体的机会。事实上，这些冻结的物质可能反映了长时间尺度下的环境状况，对其内部所含生物材料的研究可为了解古代环境提供重要线索。为了恰当地分析这些生态系统并从冻土和冰层中提取有意义的生物学信息，必须正确采集和处理冻结样品。这一点对于微生物和DNA分析尤为重要，因为其中存在的微生物群落可能与现代环境中的群落存在显著差异。本文介绍了一种成功采集和去污染冻结岩心的实验方案。外表面接种菌落及外源DNA的缺失表明，我们已成功实现了冻结岩心的去污染，所检测到的微生物来源于样品本身，而非钻取或处理岩心过程中引入的污染。

本方法可用于对从各种冰冻圈环境（从冰川冰到永久冻土）采集的冷冻样品进行去污染处理。本文展示的数据特别来自从位于阿拉斯加州福克斯的工程研究与发展中心—寒冷地区研究与工程实验室（ERDC-CRREL）永久冻土隧道中采集的冰和永久冻土样品（图1A 和 1B）。该永久冻土隧道深入金斯溪谷侧壁约110米，可进入富含冰的粉砂和冲积层30-31。2014年10月24日，从隧道壁上小心采集了冰楔和冻土样品，每种样品均设三个重复。采样时，永久冻土壁的温度为-2.9 °C。冰楔样品采自距隧道入口约27米处，冻土样品则采自距入口35米和60米处（图1C 和 1D）。在采样过程中特别注意尽量减少对冰和永久冻土岩芯的污染（图1E）。冷冻岩芯按照我们的去污染流程（图2）进行处理，并用干冰运输至新罕布什尔州汉诺威市CRREL土壤微生物学实验室进行后续处理。
<p clas...

冰冻圈为研究在以往环境条件下存留至今的生物提供了途径。本文介绍了一种采集和去污染土壤与冰层永久冻土岩心的实验方案。外源菌落和DNA的缺失表明，所检测到的微生物代表了样品本身的组分，而非钻取或处理过程中引入的污染。

冰冻圈为研究在以往环境条件下存活并被保存下来的生物提供了途径。事实上，这些冰冻物质可能反映了……

冰冻圈为研究在以往环境条件下存留的生物提供了途径。本实验的总体目标是通过成功采集冰芯并去除其外源物质，揭示其中隐藏的生物多样性。该方法可通过鉴定从冰川冰和永久冻土中回收的生物，帮助解答有关特定历史时期的重要科学问题。在野外采集无菌岩芯具有挑战性，因为极易引入污染。因此，该技术的主要优势在于污染去除可在受控的实验室环境中进行。本方案的可视化演示至关重要，因为刮除和去污染步骤可能较难掌握。这实际上是一项需要两人配合的工作，因此特别需要极大的耐心和团队协作。本次操作将由我实验室的两名科研助理Karen Foley和Robert Jones进行演示。本实验方案要求极其严格的清洁环境。将烤箱设定为 450 摄氏度，加热以下物品四小时：无菌无核酸的金属架、玻璃器皿、金属镊子和玻璃棉。使用厚铝箔包裹以防止再次污染。接下来，使用 0.22 微米滤器对 85% 乙醇和超纯水进行过滤除菌。这些液体必须保持在 4 摄氏度或更低温度，否则会导致样本破裂，增加污染风险。将乙醇储存在 -20 摄氏度。并将水储存在4摄氏度。然后，用70%乙醇对塑料尺进行灭菌，随后使用DNA去污染溶液和RNase去污染溶液处理。每种溶液使用后应立即擦拭干净。然后将尺子存放在无菌、无核酸的Whirl-Pak自封袋中。接下来，准备冷室空间：先用1%次氯酸钠溶液擦洗墙壁、地面及其中的金属工作台，然后将室温调节至约-11 °C。制备完成后，在进入冷室时应穿戴轻型防护服、腈类手套和口罩，以降低冷室或样品被污染的风险。该操作需两人协同进行。考虑到存在多次再污染的可能性，此过程可能具有挑战性。为了确保成功，我们相互监督、保持沟通，并频繁更换手套。在准备好所有物品后，将已灭菌的材料和样品带入冷室，并放置在用漂白剂擦拭过的实验台上。其中包括准备好的粘质沙雷氏菌（S. marcescens）培养物。首先，将冻土岩心置于预先准备好的铝箔纸上。接着，使用无菌泡沫塞蘸取稀释的粘质沙雷氏菌（S. marcescens）培养液，轻轻涂抹于岩心外表面。然后，将岩心放置在托盘上方的无菌金属支架上。现在，使用70%乙醇、DNA去污染溶液和RNase去污染溶液对钢制切片刀进行无菌擦拭。接下来，研究人员A以相同方式清洁其腈类手套。然后，A将组织芯在托盘上方以45度角持握。B 使用无菌刀片轻轻刮除整个岩心（包括两端）外侧约五毫米的物质，同时由 A 在每次刮取后转动岩心。根据需要，刀片必须用三种溶液重新清洗。接着，B 快速而小心地将过滤除菌的 95% 乙醇倒在岩心表面，同时由 A 转动岩心。然后，用清水快速冲洗岩心。更换托盘上方的金属架，并将岩心置于新的支架上。操作人员A清洁其丁腈手套，然后将岩心放置在托盘上方的洁净支架上。随后，B 使用 DNA 去污染溶液喷洒整个岩心，再用滤膜除菌水冲洗。接着，B 使用 RNase 去污染溶液喷洒整个岩心，再用相同的水进行另一次冲洗。最后，将岩心放入无菌 Whirl-Pak 袋中。首先，在具有层流的生物安全柜中，将金属架放置于玻璃皿上方。然后将组织芯置于金属架上，使组织芯外表面约 2 至 5 毫米在约 10 分钟内解冻。在此期间，每两分钟将岩心转动90度。解冻后，用镊子夹取少量玻璃棉，擦拭岩心整个表面以收集细菌。然后，用该玻璃棉接种两个培养皿。接下来，使用直尺测量核心的外部尺寸，但不要触碰核心。同时，用先前用于接种核心外部的原始培养物再接种两个额外的培养皿，以验证接种物是否具有活性。然后，将核心转移至一个大的无菌袋中，并在负80摄氏度下保存。将接种后的平板在23摄氏度下孵育一周，随后检查是否存在在此温度下呈红色的S. marcescens菌落。尽管本实验方案包含一系列关键步骤，但其中最重要的步骤之一是确认粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的生长情况。若未观察到明显的S. marcescens菌落，则进入下一阶段的冻融操作。如果存在粘质沙雷氏菌（S. marcescens）菌落，则从核心再刮取五毫米并重复该操作步骤。检查粘质沙雷氏菌是否从暴露于低温冷藏室温度条件下的原始培养物中生长出来。样品采自位于美国阿拉斯加福克斯（Fox）一处深110米的隧道中的冰层与永久冻土。该隧道可进入富含冰的粉砂和冲积层。样品采集了三份重复样本。在新罕布什尔州的设施中，执行了所述的实验方案。对从核心样品中培养的细菌进行了16S rRNA基因测序。其中以假单胞菌属（Pseudomonas）物种为主，但也存在与浮霉菌纲（Planctomycetia）相关的成员。尤其值得注意的是，粘质沙雷氏菌（Serratia）物种未被检出，表明去污染方案已充分去除了外源性DNA。观看本视频后，您应能充分理解如何成功地对冰芯和永久冻土芯进行去污染处理。一旦掌握相关技术，若操作得当，可在30至45分钟内完成冷室中的样品处理步骤。在尝试该流程时，必须时刻注意您接触的所有物品及各个位置。如有疑问，只需更换手套并重新灭菌。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如扩增子测序和宏基因组测序，以回答更多问题，例如该时间段内的物种组成是什么，或在这些环境条件下哪些功能特征占主导地位。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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