用于研究分化命运空间组织的人类多能干细胞模板微图形化技术

基于模板的微图案化方法用于人类多能干细胞的总体目标是提供一种简单且稳健的方法，以生成控制干细胞分化模式的空间环境梯度。该方法可帮助您利用人类干细胞模型回答组织图案化中的关键问题，例如细胞间及细胞与基质间黏附力的空间梯度如何调控干细胞分化命运。该方法的优势在于无需额外的表面修饰即可生成供细胞附着的细胞黏附性细胞外基质（ECM）图案。

这意味着该方法可兼容多种细胞外基质和底物构型，适用于不同细胞系。该方法的可视化演示至关重要，因为微图形化步骤难以掌握，需要对模板和细胞进行精确而谨慎的操作。

进行此操作时，PTMS模板必须已完成设计和制备。同时，应使人源EFC细胞在基底膜基质上生长，以便在后续步骤中细胞集落已准备好用于接种。开始时，将700 µL的70%分析纯乙醇（溶于超纯水）加入培养皿中。

然后，将PDMS膜板放置于溶液上，并将培养皿放入生物安全柜中过夜干燥。次日，检查膜板下方是否产生气泡。随后，对培养皿进行处理，直至细胞可接种至膜板上。

通过向 DMF12 中加入 16.7 毫升制备人 ESC 级质量的基底膜基质等分试样，制成 1.5 倍浓度溶液，并置于冰上保存。用 100 瓦的氧气等离子体处理基底 90 秒。在放入等离子体腔室之前不要打开培养皿，处理完成后立即盖好。

该处理可防止基底浸入溶液时产生气泡。现在，用450 µL预先配制的1.5倍浓度基底膜基质溶液覆盖模板。然后，用封口膜密封培养皿，并在5小时内孵育。

在继续操作前，检查已准备好的六孔板中的 hESC 克隆。识别并吸除已分化、失去典型 hESC 形态的克隆。理想的克隆应呈圆形，具有紧密排列的上皮样形态，核质比高，并有明显的核仁。

然后，用两毫升 DMEM/F12 溶液将每孔细胞洗涤两次，每次两毫升。第二次洗涤后，向每孔加入一毫升消化酶（如 accutase），并在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。孵育结束后，轻轻敲击培养板，使所有细胞集落从基质上脱落。

接着，每孔加入的消化酶每1毫升使用至少4毫升培养基清洗各孔，并将细胞悬液收集至一个15毫升的锥形离心管中。在室温下以200 ×g离心3分钟，使细胞形成沉淀。然后吸除上清液，将细胞重悬于400微升hESC维持培养基中，培养基中添加10微摩尔的ROCK抑制剂。

轻轻吹打细胞三次，以分散细胞团块。接着，调整悬液的密度。充分混匀后，在培养基中以1:20的比例制成200微升的稀释液。

使用血细胞计数板对稀释液中的细胞进行计数。然后，根据需要使用含有ROCK抑制剂的培养基稀释主悬液。接下来，将所需数量的细胞接种到每个预先准备好的模板上。

应仅沉积单层细胞，因此需将细胞均匀铺开。静置模板五分钟，使细胞充分沉降。随后，小心地将载有细胞的模板转移至培养箱中，转移过程中始终保持培养皿水平。

将细胞在培养箱中孵育约一小时，使其贴附于模板上。待细胞充分贴附后，在显微镜下观察，确认其贴附情况良好。将模板重新转移至超净台中，吸除未贴附的细胞。

接着，向模板周围区域加入 2 毫升 0.5% 的 DMF12 兼容性非离子表面活性剂。轻轻旋转溶液，使其覆盖模板。然后，使用一对已灭菌的镊子小心地将模板从培养皿上剥离。

移除模板后，在显微镜下检查微图形化细胞。非离子型表面活性剂可防止这些细胞干燥。将微图形化细胞置于添加了表面活性剂的培养基溶液中，在37摄氏度下孵育10分钟。

10分钟后，吸去溶液，用2毫升普通DMF12培养基洗涤培养板，共洗涤三次。洗涤后，加入含ROCK抑制剂的2毫升HESC维持培养基。再次观察细胞，检查微图案是否已正确形成。

然后，将细胞在37摄氏度下孵育过夜。第二天，吸除培养基，用DMF12洗涤细胞一次，然后加入2毫升添加补充物的分化培养基，以诱导细胞进行中内胚层分化。之后，分析结果。

使用激光切割机制备细胞模板，可提供1000微米的特征尺寸。该模板由带有微图案通孔的薄型模板片和用于容纳细胞的PDMS垫圈组成。利用此工具，在中内胚层分化过程中对微图案化的HESC进行了研究。

H9-HESC 克隆边缘的整合素黏附高于克隆内部的细胞。因此，当使用激活素、BMP4 和 FGF2 诱导时，这些细胞会分化为肢体 T 阳性中内胚层细胞。当将此类细胞构建成不同几何形状的单层结构时，几何形状和各向同性直角以及凸曲率会导致整合素介导的牵引力在局部集中，从而促进中内胚层分化的增加。

在单个克隆的不同区域中，T蛋白表达强度的检测结果显示，在方形和矩形克隆的尖锐角落以及半圆形弧线的凸面曲率处，中胚层和内胚层诱导程度确实更高。这表明，可通过所述方法调控由细胞黏附介导的机械力。在实施该操作前，针对您所使用的特定人多能干细胞系，优化基质包被时间、细胞消化时间以及细胞贴壁时间至关重要。