Name: 人类多能干细胞的模板微图案用于探测分化命运的空间组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习基于模板微图案技术的人类多能干细胞空间梯度构建方法，用于控制干细胞分化模式和组织工程研究。该方法无需额外表面修饰，兼容多种细胞系配置。

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本工作由新加坡国立大学启动基金（R-397-000-192-133）和ETPL差距基金（R-397-000-198-592）资助。G.S. 为新加坡国立大学研究学者。作者谨此感谢邢姜华博士在细胞微图形化技术方面的技术支持。

注意：本方案描述了通过激光切割制备具有1,000 µm图案的PDMS膜片，并利用该PDMS膜片对人胚胎干细胞系H9进行微图案化的方法。
1. 用于微图案化的PDMS模板的设计与制备
<ol>
	<li>设计具有所需几何形状和尺寸通孔的模板片例如，1,000 µm 圆形）以及模板垫圈，使用计算机辅助设计软件10.</li>
	<li>使用CO₂激光切割机分别在厚度为120-150 µm和2 mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）板材上切割出模板层和垫圈2 激光切割机10.</li>
	<li>使用未固化的液态PDMS将PDMS垫圈与PDMS模板片键合，并在60 °C下烘烤3–4小时，以获得用于微图案化的PDMS模板。</li>
	<li>将PDMS模板在120 °C下高压灭菌30分钟，随后在使用前于烘箱中干燥。</li>
</ol>
2. hESC 的培养
<ol>
	<li>将hESC细胞系在37 °C、5% CO2条件下，培养于经1× hESC级基底膜基质包被的无饲养层维持培养基中的细胞培养板上。</li>
	<li>当hESC细胞生长至约70%汇合时，用dispase处理，在37 °C下孵育3分钟，将hESC克隆机械解离为100–200 µm的细胞团块。以每9.6 cm2生长面积接种30–50个细胞团的密度，按1:6的传代比例，将hESC细胞团接种于经基底膜基质包被的组织培养用聚苯乙烯表面。</li>
</ol>
3. 人类胚胎干细胞的模板微图形化
<ol>
	<li>细胞图案化前的准备
	<ol>
		<li>向60 mm培养皿中加入700 µl超纯水中配制的70%分析纯乙醇，并将PDMS模板置于其上，以实现密封。</li>
		<li>将培养皿放入生物安全柜中过夜，使乙醇完全挥发干燥。</li>
		<li>检查模板下方无气泡存在，以确保模板与培养皿之间形成良好密封，防止细胞外基质（ECM）包被溶液泄漏。密封培养皿并在无菌条件下保存，直至准备接种细胞。</li>
		<li>根据分析证书准备人胚胎干细胞（hESC）专用基底膜基质的分装样品。确保每份样品按厂家产品说明书用25 ml杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释后，可得到1× hESC专用基底膜基质溶液。</li>
		<li>将一份hESC专用基底膜基质加入16.7 ml DMEM/F12中，配制成1.5× hESC专用基底膜基质溶液作为ECM包被液。全程将ECM包被液置于冰上，以防发生凝胶化。</li>
		<li>在hESC维持培养基中添加10 µM ROCK抑制剂（Y27632）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在模板化基底上进行ECM包被
	<ol>
		<li>使用100 W O2等离子体对培养皿处理90秒。为保证无菌，仅在等离子体处理前于等离子腔内打开培养皿盖，并在处理完成后立即重新盖好。此步骤有助于提高表面润湿性，并防止添加ECM包被液时微图案通孔中产生气泡。</li>
		<li>加入450 µl 1.5× hESC专用基底膜基质溶液，覆盖整个模板区域。用自封膜（如Parafilm）密封培养皿，防止溶液蒸发，然后在37 °C孵育5小时后使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将hESC接种至模板化基底
	<ol>
		<li>在6孔板中观察hESC集落，识别出失去典型hESC形态的分化区域（例如，失去圆形、紧密排列的上皮样形态，核质比降低且核仁不明显）。使用真空吸管去除已分化区域。</li>
		<li>每孔用2 ml DMEM/F12洗涤两次。</li>
		<li>每孔加入1 ml消化酶（如Accutase），在37 °C孵育8分钟。轻敲培养板，使所有集落从基底上脱落。</li>
		<li>每1 ml消化酶至少用4 ml DMEM/F12冲洗每个孔，并将细胞悬液收集至15 ml锥形管中。</li>
		<li>在室温下以200 × g离心3分钟。</li>
		<li>吸除上清液，加入400 µl含ROCK抑制剂（ROCKi）的hESC维持培养基重悬细胞。轻轻吹打细胞悬液3次，使细胞团块分散为单细胞。</li>
		<li>充分混匀单细胞悬液，取10 µl细胞样品稀释至190 µl DMEM/F12中（1:20稀释）。使用血细胞计数板测定原液细胞悬液的细胞密度。</li>
		<li>根据特定模板计算所需的细胞接种密度。 
		注：例如，我们通过实验确定，获得单层汇合的单细胞所需接种密度约为4,444 个细胞/mm2。因此，对于面积为450 mm2、接种体积为400 µl的模板，所需细胞悬液密度应为200万个细胞 / 400 µl。</li>
		<li>用含ROCKi的hESC培养基将原液细胞悬液稀释至所需接种密度（见步骤3.3.8注）。</li>
		<li>向每个模板中加入含有所需数量细胞的指定体积细胞悬液，在室温下静置5分钟，使细胞沉降，期间避免扰动培养皿。</li>
		<li>将培养皿转移至培养箱中，在37 °C孵育1小时以促进细胞贴附。转移过程中注意保持培养皿水平，以确保细胞在模板内保持单层分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>模板移除及未图案化基底的钝化处理
	<ol>
		<li>在显微镜下检查培养皿，确认细胞已正常贴附于基底表面。</li>
		<li>吸除模板中的细胞悬液。</li>
		<li>向模板周围区域每皿加入2 ml含0.5%细胞培养兼容性非离子型表面活性剂的DMEM/F12溶液。</li>
		<li>使用已灭菌镊子轻轻剥离模板。剥离过程中轻轻晃动非离子型表面活性剂溶液，防止细胞干燥。肉眼观察培养皿中微图案化的细胞。</li>
		<li>将微图案化细胞在含0.5%非离子型表面活性剂的DMEM/F12溶液中于37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>吸除非离子型表面活性剂-DMEM/F12溶液，每皿用2 ml DMEM/F12洗涤3次。</li>
		<li>每皿加入2 ml含ROCKi的hESC维持培养基，于37 °C孵育过夜。</li>
		<li>过夜孵育后，吸除含ROCKi的hESC维持培养基，用DMEM/F12洗涤一次，然后每皿加入含100 ng/ml Activin、25 ng/ml BMP4和10 ng/ml FGF2的分化培养基，诱导中内胚层分化。</li>
		<li>采用相差成像评估微图案，并按照先前所述方法8计算每个图案的平均Brachyury（T）荧光强度分布。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

微图案掩模的制备
模板微图形化技术为生成人多能干细胞（hPSC）微图案以研究微环境介导的分化模式提供了一种理想方法。与其他微图形化技术（如微接触印刷和光图形化）相比，模板图案化的主要优势在于无需进行表面修饰，并可在常规的组织培养聚苯乙烯（TCPS）基底上直接实施。因此，针对不同hPSC细胞系优化的培养基和细胞外基质（ECM）包被条件可直接应用于模板微图形化技术。
在细胞模板制备过程中，有多个关键步骤会影响微图案的质量。人多能干细胞微图案中设计几何形状的复制保真度，取决于模板片上通孔加工的质量与一致性。对于涉及多细胞微图案的研究， &#62; 1,000 µm时，可通过激光切割在预浇铸的PDMS片上直接加工通孔。激光切割的分辨率取决于激光束的光斑尺寸以及控制激光束路径的机械平台的精度。对于常规CO2 激光切割机，我们发现其能够高保真地加工出圆形或弧形特征，但无法加工具有尖锐拐角的几何形状（例如，方形）。在需要小尺寸或尖锐特征的应用中，可通...

人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），因其具有分化为三个胚层所有细胞谱系的潜能，已被广泛应用于再生医学以及正常和疾病状态下器官发生的实验建模1,2。hPSCs的分化命运对局部微环境因素高度敏感，这些因素可调节自分泌或旁分泌信号1，以及由物理信号介导的机械转导过程3-5。细胞微图形化技术是一类用于在空间上调控细胞群体几何形态与位置分布的技术，可用于控制细胞微环境，例如细胞-细胞相互作用6和细胞-基质相互作用3。在hPSCs研究中，细胞微图形化已被用于深入揭示依赖微环境的自分泌信号如何调控hESC的多能性-分化决策7以及早期胚胎分化模式的形成6。二维（2D）和三维（3D）微图形化的hPSCs已被用于调控多细胞结构的克隆大小，从而影响向三个胚层的分化决策8,9。我们已利用多细胞hPSC微图形化结构调控hPSC克隆内细胞-细胞和细胞-基质相互作用的程度，以探究整合素与E-钙黏蛋白之间的串扰如何导致细胞命运异质性10。上述研究结果为将hPSC多细胞微图形化结构作为实验模型的应用开辟了新途径，可用于发育性疾病中药物毒性筛选11、研究生长因子和激素在组织或器官发育过程中的作用，以及解析组织模式的形成机制。
已开发出多种细胞微图形化技术，Falconnet 等人对此进行了综述et. al.12，但仅有少数方法，如微接触印刷7,8,13、微孔培养14,15、光图形化6和微模板16，已成功应用于人多能干细胞（hPSCs）。对 hPSCs 进行微图形化的主要挑战在于其脆弱性，以及对特定细胞外基质（ECM）和生长条件的严格要求，以维持细胞的贴附与存活。对于二维 hPSC 图形，微接触印刷是在组织培养板和玻璃基底上生成 hPSC 微图形最常用的方法之一13。该方法可用于图案化 hPSC 培养中常用的 ECM，包括层粘连蛋白和基底膜基质（如 Matrigel）。然而，该方法通常需要借助多聚-D-赖氨酸进行两步涂覆，并需在特定的惰性气氛和湿度条件下操作，以形成稳定的 ECM 微图形供 hPSC 贴附6,13。每种微图形化方法最首要的考虑因素是：表面修饰策略是否能在目标几何分辨率下生成可供 hPSC 贴附的 ECM 图案，同时最大限度地减少细胞在周围区域的非特异性贴附。
在此，我们报道了使用模板微图案化技术作为一种简单方法，用于生成人多能干细胞（hPSC）微图案，该方法无需在生成供hPSC黏附的细胞外基质（ECM）图案前进行额外的表面修饰步骤。细胞模板由一层薄膜组成， 例如， 聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜片，其上具有微米至毫米尺寸的通孔，可密封于细胞培养基质表面，用于物理限定细胞外基质（ECM）包被区域，并随后接种人多能干细胞（hPSCs）。由于模板图案化技术通过物理限制hPSC接触和附着于底层ECM包被基质的位置来实现图案控制，该方法适用于多种支持hPSC培养的基质。唯一要求是所选模板材料能够与基质形成可逆密封。这些基质包括传统的组织培养用聚苯乙烯（TCPS）17配体偶联底物18，以及刚度可调的弹性基底（例如，聚二甲基硅氧烷）19该方法还可用于包被不同的细胞外基质（ECM），如纤连蛋白（或VTN蛋白）、层粘连蛋白以及基底膜基质例如、Matrigel 和 Geltrax）以促进 hPSCs 的正常贴附与分化。因此，我们可以将特定 hPSC 细胞系优化的 ECM 基质配置应用于模板微图形化技术，以实现最佳的细胞-基质黏附、存活和分化。近期，已有类似方法报道，通过使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微模板阵列对 hESCs 进行微图形化，引导其向肝细胞方向分化。16.
细胞掩模可由多种材料制成，包括金属20,21、聚对二甲苯聚合物22,23、PMMA16，其中最常用的是PDMS24-28。硅材料和聚对二甲苯聚合物掩模需要使用专用设备直接刻蚀通孔20-23，这限制了其在生物学用户中的普及性。PDMS掩模可根据所需特征尺寸的不同，采用多种方法制备，其典型尺寸范围为3 µm至2,000 µm11,26-29。若需要较小的结构特征，可通过将PDMS预聚物在含有微图案凸起结构的微加工硅模板上热压成型，制备出较薄的掩模片28。对于特征尺寸&#62; 1,000 µm的情况，可使用CO2激光切割机在预先浇铸的PDMS片上直接切割图案，该方法简便且成本较低。PDMS掩模可重复使用，因此在保证实验一致性的前提下，进行一系列实验时具有较高的成本效益。
本文介绍了通过激光切割制备具有1,000 µm特征结构的PDMS模板以及生成人胚胎干细胞（hESC）微图案的详细方法。这些hESC微图案用于调控整合素和E-钙黏蛋白介导的黏附在完整hESC集落中的分布程度，从而研究细胞黏附的空间极化如何导致细胞命运的异质性10。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;2 mm厚PDMS片材</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.005</td><td>用于制作模板的储液池</td></tr><tr><td>120–150 &amp;mu;m厚PDMS片材</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.040</td><td>用于制作模板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60 mm培养皿</td><td>Nunc Nunclon Delta</td><td>150326</td><td>微图案化的基底</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Accutase, Merck Millipore, Singapore</td><td>SCR005</td><td>将H9细胞解离为单细胞的酶</td></tr><tr><td>Activin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>338-AC-010</td><td>H9细胞分化的生长因子</td></tr><tr><td>BMP4&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>338-BP-010</td><td>H9细胞分化的生长因子</td></tr><tr><td>等离子体系统&amp;nbsp;</td><td>Femto Science, Korea</td><td>CUTE-MP</td><td>用于模板的等离子体氧化</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell&amp;trade; Technologies, Singapore</td><td>7923</td><td>传代过程中用于减弱细胞-细胞外基质黏附的酶</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, USA</td><td>11330032</td><td>H9细胞的基础培养基</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>233&amp;ndash;FB&amp;ndash;025</td><td>H9细胞分化的生长因子</td></tr><tr><td>H9细胞系</td><td>WiCell Research Institute, Inc., USA</td><td>WA09</td><td>人胚胎干细胞</td></tr><tr><td>适用于hESC的基底膜基质</td><td>Matrigel, BD Biosciences, Singapore</td><td>354277</td><td>支持H9细胞生长的细胞外基质包被材料</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica Microsystems, Singapore</td><td>DMi1</td><td>用于采集明场图像</td></tr><tr><td>激光切割机</td><td>Epilog Helix 24 Laser System</td><td></td><td>用于在PDMS片材上加工通孔</td></tr><tr><td>mTeSR&lt;sup&gt;&amp;trade;&lt;/sup&gt;1培养基&amp;nbsp;</td><td>StemCell&amp;trade; Technologies, Singapore</td><td>5850</td><td>H9细胞的维持培养基</td></tr><tr><td>PDMS&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184, Dow Corning Co., USA</td><td>3097358-1004</td><td>用于粘合PDMS模板和储液池</td></tr><tr><td>ROCKi Y27632</td><td>Calbiochem, Merck Millipore, Singapore</td><td>688000</td><td>维持H9细胞以单细胞形式存在&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff&lt;sup&gt;&amp;trade;&lt;/sup&gt; APEL&lt;sup&gt;&amp;trade;&lt;/sup&gt;培养基&amp;nbsp;</td><td>StemCell&amp;trade; Technologies, Singapore</td><td>5210</td><td>H9细胞的分化培养基</td></tr><tr><td>聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜</td><td>SureMark Singapore</td><td>SQ-6633</td><td>用于制作模板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞培养兼容的非离子型表面活性剂</td><td>Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore</td><td>P2443</td><td>钝化试剂，用于阻止非微图案区域的细胞黏附</td></tr></tbody></table>

用于研究分化命运空间组织的人类多能干细胞模板微图形化技术

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，具有分化为三个胚层的内在能力。这使得它们成为再生医学以及正常与疾病状态下器官发生实验建模的理想细胞来源。然而，hPSCs的分化 体外 具有异质性且空间排列无序。细胞微图形化技术有望实现对干细胞微环境的空间控制，并调控其分化的命运。对人多能干细胞（hPSCs）进行微图形化时，必须充分考虑其在存活与维持方面严格的要求。本文介绍了一种与hPSCs高度兼容的模板式微图形化方法。hPSCs的微图形由细胞模板上的通孔几何形状决定，这些通孔在物理上限制了hPSCs可接触并附着于底层包被有细胞外基质的基质表面的位置。由于该操作模式的存在，相较于其他细胞微图形化方法，本方法在选择能够充分支持hPSCs的基质材料方面具有更高的灵活性。我们同时强调了成功构建hPSC微图形的关键步骤。作为示例，我们展示了hPSC的模板微图形化可用于调控细胞间及细胞-基质黏附的空间极化，从而决定中内胚层的分化模式。这种简单而稳健的hPSC微图形化方法，拓展了建立实验模型以研究早期胚胎发育过程中组织形成与图形化机制的应用前景。

本文中，我们描述了一种使用激光切割机制备细胞掩膜的方法，用于生成尺寸为 1,000 µm 的微结构。该掩膜由两部分组成：一层含有微图案通孔的薄型掩膜片（厚度约为 100–200 µm），以及一个用于容纳 ECM 涂层溶液或细胞悬液的 PDMS 密封垫。此处分别采用市售的 127 µm 和 2 mm 厚 PDMS 片作为掩膜片和密封垫。其他可控制厚度的 PDMS 片制备方法，例如旋涂法，也可用于制备这些部件。两个组件通过液态未固化 PDMS 预聚物-交联剂混合物作为粘合剂或等离子体键合方式进行连接，并在 60 °C 下烘烤 3–4 小时（图 1）。
用于制作模板的材料需根据细胞培养基底的选择而定。当使用常规的组织培养用聚苯乙烯（TCPS）作为培养基底时，可采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）模板，因为PDMS模板片的柔韧性能够与刚性TCPS形成良好的密封E ~ 3 GPa) (图 2A</st...

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化并自组织形成特定组织结构的内在能力；然而这一过程需要空间环境梯度的引导。本文介绍了一种简单且可靠的模板微图形化技术，可用于构建生化和力学梯度，从而调控hPSCs的分化模式。

人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，具有分化为……的内在能力

基于模板的微图形化方法用于人类多能干细胞的总体目标是提供一种简单且稳健的方法，以生成控制干细胞分化模式的空间环境梯度。该方法可帮助您利用人类干细胞模型回答组织图形化领域中的关键问题，例如细胞间及细胞-基质黏附力的空间梯度如何调控干细胞分化命运。该方法的优势在于无需额外的表面修饰即可生成供细胞附着的细胞黏附性ECM图形。这意味着该方法适用于各种细胞外基质和底物构型，且针对每种细胞系具有特异性。该方法的可视化演示至关重要，因为微图案化步骤难以掌握，需要对模板和细胞进行精确而谨慎的操作。进行此操作前，必须已完成 PTMS 模板的设计与制备。同时，应提前培养人 EFC 细胞于基底膜基质上，使其在后续操作中能够形成适合接种的细胞集落。开始时，向培养皿中加入 700 µL 以超纯水配制的 70% 分析纯乙醇。然后，将PDMS膜板放置于溶液上，并将培养皿放入生物安全柜中过夜干燥。次日，检查膜板下方是否产生气泡。随后，对培养皿进行处理，直至可将细胞接种至膜板上。通过向 DMF12 中加入 16.7 毫升制备一份人胚胎干细胞级基底膜基质的等分试样，配制成 1.5 倍浓度溶液，并置于冰上保存。用 100 瓦的氧气等离子体处理基底材料 90 秒。在放入等离子体腔室之前不要打开培养皿，处理完成后应迅速将其盖好。该处理可防止基底浸入溶液时产生气泡。现在，用450 µL已配制好的1.5倍浓度的基底膜基质溶液覆盖掩膜。然后，用封口膜密封培养皿，并在5小时内孵育。在继续操作前，检查已准备好的六孔板中的 HESC 集落。识别并吸除已分化、失去典型 HESC 形态的集落。理想的集落应呈圆形，具有紧密排列的上皮样形态，核质比高，并有明显的核仁。然后，用两毫升 DMEM/F12 溶液将每孔细胞洗涤两次，每次两毫升。第二次洗涤后，向每孔加入一毫升消化酶（如 accutase），并在 37°C 条件下孵育 8 分钟。孵育结束后，轻轻敲击培养板，使所有细胞集落从基质上脱落。接下来，每个孔使用消化酶后，每毫升消化酶需用至少四毫升培养基清洗一次，将细胞悬液收集至一个15毫升锥形管中。在室温下以200 ×g离心三分钟，使细胞形成沉淀。然后吸除上清液，将细胞重悬于400微升hESC维持培养基中，并加入10微摩尔的ROCK抑制剂。轻轻吹打细胞三次，以分散细胞团块。接着，调整悬液的密度。充分混匀后，在培养基中以1:20的比例制备200微升的稀释液。使用血细胞计数板对稀释后的细胞进行计数。然后根据需要，用含有ROCK抑制剂的培养基稀释主细胞悬液。接着，将所需数量的细胞接种至每个预先准备好的模板上。应仅沉积单层细胞，因此需将细胞均匀铺开。静置模板五分钟，使细胞充分沉降。随后，小心地将载有细胞的模板转移至培养箱中，转移过程中始终保持培养皿水平。让细胞在孵育约一小时的过程中贴附到模板上。待细胞充分贴附后，在显微镜下观察以确

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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