Name: 治疗的siRNA递送至CNS使用阳离子和阴离子脂质体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习使用阳离子/阴离子脂质体与神经靶向肽将siRNA递送至中枢神经系统的方法。该技术可穿越血脑屏障，为朊病毒病及其他神经退行性疾病的治疗提供新途径。

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我们感谢以下资助来源：科罗拉多州立大学传染病转化研究培训项目（ID:TRTP）以及美国国立卫生研究院研究资助项目（R01 NS075214-01A1）。我们感谢Telling实验室提供单克隆抗体PRC5，同时也感谢Dow实验室提供DOTAP脂质体，并分享他们在脂质体制备方面的专业知识。

所有小鼠均在科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下，由国际实验动物评估和认可委员会认证的实验动物资源实验室饲养和维持。
1. 肝干细胞前体细胞（LSPCs）的制备
<ol>
	<li>使用1:1的DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）:胆固醇比例制备LSPC。对于4 nmol脂质体的制备，将2 nmol DOTAP和2 nmol胆固醇溶于10 ml氯仿:甲醇（1:1）溶液中，置于烧瓶内混合。</li>
	<li>使用 N 蒸发 9 ml 氯仿:甲醇溶液2 在通风橱中通入气体。在通风橱中过夜蒸发最后1 ml溶剂，不充入气体。观察烧瓶底部形成的薄层脂质膜。</li>
	<li>将10 ml 10%的蔗糖溶液加热至55 °C。</li>
	<li>将加热的10%蔗糖溶液缓慢倒入薄层脂膜上， 即 1 ml/min，同时轻轻摇动烧瓶。将10%蔗糖溶液和含脂质的烧瓶维持在55 °C，以确保脂质分子保持在凝胶-液体相。水合过程将形成多层囊泡（MLV）。</li>
	<li>在对脂质体进行粒径测定前，于55 °C下孵育至少1小时以使脂质充分水化。</li>
	<li>按照制造商的说明组装挤出器，并使用1.0 µm滤膜，或使用1.0 µm注射器滤器进行粒径控制。</li>
	<li>将1 ml加热的脂质体悬液加入挤出器的一个注射器中，使悬液在两个注射器之间来回通过11次。确保经过11次挤出后，悬液位于与起始注射器相对的另一个注射器中。</li>
	<li>再次将脂质体依次通过0.45 µm和0.2 µm滤膜，以制备大单层囊泡（LUVs）。保持脂质体悬浮液处于加热状态，以便更易进行粒径控制。</li>
	<li>将20 µl的4 nmole脂质体悬液（200 µM）与200 µl的20 µM（共4 nmole）siRNA储备液在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将80 µl的500 µM（总共40 nmole）RVG-9r储备液与siRNA/脂质体溶液在室温下孵育10分钟。LSPC应尽快使用，但也可在制备后数小时内使用。将LSPC在4 °C下保存数小时。&#160;制备后</li>
</ol>
2. PALETS 的制备
<ol>
	<li>制备PALETS时，使用55:40:5的摩尔比，可选择DSPE（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）:胆固醇:DSPE-PEG或DOTAP:胆固醇:DSPE-PEG。对于4 nmol的脂质体制备，将2.2 nmol的DSPE或DOTAP、1.6 nmol的胆固醇和0.2 nmol的DSPE-PEG溶于10 ml体积比为2:1的氯仿:甲醇溶液中，混匀于烧瓶内。</li>
	<li>严格按照上述步骤1.1和1.2所述方法制备脂质体悬液。将DSPE脂质体用10 ml预热至75 °C的1×&#160;PBS重悬，添加速度为1 ml/min。在75 °C条件下充分水合至少1小时后再进行粒径均一化处理。</li>
	<li>严格按照步骤1.6–1.8所述方法对脂质体悬液进行粒径均一化处理。</li>
	<li>在DOTAP和DSPE脂质体完成粒径均一化后，取每种4 nmol（200 µM）脂质体悬液各20 µl，分装为单次使用 aliquot，使用台式冷冻干燥机冻干30分钟（图2）。</li>
	<li>将200 µl浓度为20 µM（总含量4 nmol）的siRNA储备液与1.4 µl浓度为26.6 µM的硫酸鱼精蛋白溶液在室温下孵育10分钟，用于后续封装至DSPE PALETS脂质体中的siRNA处理。&#160;</li>
	<li>用200 µl浓度为4 nmol的siRNA储备液重悬DOTAP PALETS脂质体，或用201.4 µl siRNA/鱼精蛋白溶液重悬DSPE PALETS脂质体。将脂质体/siRNA混合液在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>向DOTAP和DSPE PALETS的脂质体/siRNA混合液中各加入10 µl浓度为60 mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液。</li>
	<li>向DOTAP和DSPE PALETS的脂质体/siRNA混合液中各加入10 µl浓度为150 mM的N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）溶液。</li>
	<li>将EDC和sulfo-NHS与siRNA/脂质体悬液在室温下共同孵育2小时。</li>
	<li>将80 µl浓度为500 µM（总含量40 nmol）的RVG-9r储备液加入siRNA/脂质体交联反应体系中，在室温下孵育10分钟。 
	注意：EDC/sulfo-NHS可使RVG-9r共价结合至PEG化脂质上。PALETS应在制备后数小时内使用。制备后可于4 °C保存数小时。&#160;&#160;</li>
	<li>测定PALETS中siRNA的包封率：
	<ol>
		<li>使用设定在260 nm波长的分光光度计，测量加入鱼精蛋白和脂质体前后siRNA的浓度。</li>
		<li>使用50 kDa截留分子量的离心过滤装置，将未包封的siRNA从脂质体/包封siRNA悬液中滤除。在1,000 × g条件下离心20分钟。</li>
		<li>使用分光光度计在260 nm波长下测定滤过液中未包封siRNA的浓度，以及截留液中包封siRNA的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 向小鼠注射LSPCs或PALETS
<ol>
	<li>将小鼠暴露于热灯下 5-10 分钟，以扩张血管系统。</li>
	<li>在注射前 5-10 分钟开始，使用 2-3% 异氟烷/氧气气流对小鼠进行麻醉，并在注射过程中持续维持麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉效果：当动物不再活动且呼吸减慢时，表明已进入麻醉状态。将小鼠仰卧或侧卧固定，以便接触尾静脉。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹小鼠眼睛，防止角膜干燥。</li>
	<li>用 70% 乙醇擦拭或喷洒尾部，使用 26 G 胰岛素注射器将 300 µl 的 LSPCs 或 PALETS 注入小鼠尾静脉。从尾部远端开始注射，若静脉塌陷或破裂，则向近端移动继续注射。</li>
	<li>将小鼠置于清洁的笼子中，直至其能够维持胸卧位。在完全恢复之前，不得将其与同笼动物放在一起。&#160;小鼠通常在 5 至 15 分钟内恢复。&#160; 若恢复时间较长，可将其置于加热垫上或热灯下以维持体温。&#160; 应密切监测小鼠，防止过热。</li>
	<li>注射后数小时内持续观察动物，确保麻醉作用完全消退，且治疗未引起不良反应。让 LSPCs 或 PALETS 在体内循环至少 24 小时。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分析蛋白质表达
<ol>
	<li>以每分钟20%的CO2流速处死小鼠，持续15分钟。</li>
	<li>使用剪刀剪开小鼠的皮肤和颅骨，取出半个脑半球。用镊子或剪刀末端将半个脑半球从颅骨上剥离下来。</li>
	<li>在培养皿中，用注射器推杆将每只小鼠的半个脑半球组织通过40 µm细胞筛网过滤，使用2.5 ml FACS缓冲液（1x&#160;PBS，1%胎牛血清，10 mM EDTA）进行压碎和冲洗。</li>
	<li>用额外的2.5 ml FACS缓冲液冲洗细胞筛网和培养皿。将获得的单细胞悬液转移至15 ml锥形管中，置于冰上保存。</li>
	<li>取5 ml单细胞悬液中的100 µl加入1.5 ml微量离心管中，以350 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml FACS缓冲液中。再次以350 × g离心5分钟。用另1 ml FACS缓冲液重复洗涤一次。将细胞悬液始终保持在冰上。</li>
	<li>将细胞与100 µl FACS缓冲液中的鼠源Fc阻断剂（0.5 mg/ml大鼠抗小鼠Fc阻断剂，按1:100稀释）在冰上孵育30–60分钟。参照步骤4.5的方法离心并洗涤细胞。将细胞悬液保持在冰上。</li>
	<li>将细胞与100 µl含7%小鼠血清的FACS缓冲液中的荧光标记抗体（抗小鼠PrPC，20 µg/ml）在冰上孵育30–60分钟。参照步骤4.5的方法离心并洗涤细胞。将细胞悬液保持在冰上。</li>
	<li>离心后将细胞重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液（1x&#160;PBS，155 mM NH4Cl，12 mM NaHCO3，0.1 mM EDTA）中，裂解1&#160;分钟。参照步骤4.5进行离心，再将细胞重悬于1 ml FACS缓冲液中。将细胞悬液保持在冰上。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析PrPC表达水平，方法如前所述10。从总细胞群体中圈选活细胞，再从活细胞群体中圈选PrPC阳性细胞，以测定MFI（中位荧光强度）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本报告描述了一种构建两种靶向递送系统的方法，可高效地将siRNA递送至中枢神经系统（CNS）。既往将siRNA递送至CNS的方法包括：直接向脑内注射siRNA/shRNA载体、静脉注射靶向siRNA，或静脉注射非靶向脂质体-siRNA复合物。向CNS内注射siRNA/shRNA载体虽可降低靶蛋白的表达水平，但siRNA/shRNA在CNS中无法自由扩散。此外，此类注射会造成邻近神经组织的损伤6-9。静脉注射靶向siRNA也可降低靶蛋白水平，但大部分siRNA会被血清蛋白降解20。最后，静脉注射非靶向脂质体-siRNA复合物会导致siRNA被肝脏截留，并被单核吞噬细胞系统降解21。上述siRNA递送载体LSPCs和PALETS通过直接将siRNA递送至CNS，提供了一种比既往方法更安全、更有效且高效的递送系统。LSPCs和PALETS还能够将其他小分子药物递送至CNS。
PALETS 或 LSPCs 应在组装后数小时内使用，否则 siRNA 可能会失活或降解。另一个不能停止或中断的关键步骤是用于流式细胞术的细胞悬液的制...

朊病毒病是一类严重的神经退行性疾病，可影响中枢神经系统（CNS）。该类疾病由一种具有传染性的异构体PrPRes诱导正常细胞型朊蛋白PrPC发生错误折叠而引发。这类疾病可影响多种物种，包括牛的牛海绵状脑病、羊的痒病、鹿科动物的慢性消耗性疾病以及人类的克雅氏病1-3。朊病毒引起的神经退行性病变最初表现为突触丢失，随后进展为空泡化、胶质细胞增生、神经元丢失及斑块沉积，最终导致动物或个体死亡4。数十年来，研究人员一直在探索能够延缓或阻止朊病毒病进展的化合物，但至今尚未发现有效的治疗方法或高效的系统性递送载体。
内源性PrPC的表达是朊病毒病发生所必需的5。因此，降低或消除PrPC的表达可能延缓或改善疾病进程。多个研究团队构建了PrPC表达水平降低的转基因小鼠，或将表达shRNA的慢病毒载体直接注射到小鼠脑组织中，以研究PrPC表达水平在朊病毒病中的作用。这些研究发现，减少神经元中PrPC的含量可阻止朊病毒病的进行性神经病理变化，并延长动物的寿命6-9。我们曾报道，PrPC siRNA处理可导致小鼠神经母细胞瘤细胞中PrPRes的清除10。这些研究表明，采用降低PrPC表达水平的治疗方法，例如可切割mRNA的小干扰RNA（siRNA），可能足以延缓朊病毒病的进展。然而，目前针对朊病毒病研究的大多数疗法，其给药方式在临床实践中并不实用。因此，siRNA疗法需要一种可系统性给药、通过静脉注射并靶向中枢神经系统（CNS）的递送系统。
研究人员已对脂质体作为基因治疗产品的递送载体进行了研究。阳离子脂质和阴离子脂质均可用于脂质体的制备。其中，阳离子脂质的应用比阴离子脂质更为广泛，因为阳离子脂质与DNA/RNA之间的电荷差异有利于实现高效的包载。阳离子脂质的另一优势在于其穿越细胞膜的能力强于其他类型的脂质11-14。然而，阳离子脂质的免疫原性高于阴离子脂质13,14。因此，研究人员已开始从使用阳离子脂质转向使用阴离子脂质制备脂质体。通过使用带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐多肽，可高效地将基因治疗产品包载入阴离子脂质体中，该多肽能够压缩DNA/RNA分子15-19。由于阴离子脂质的免疫原性低于阳离子脂质，其在体内的循环时间可能更长，在动物模型中也可能具有更好的耐受性13,14。通过将靶向性多肽连接到脂质体表面，可实现脂质体对特定组织的靶向递送。RVG-9r神经肽可结合烟碱型乙酰胆碱受体，已被用于将siRNA和脂质体靶向递送至中枢神经系统17-20。
本报告概述了一种制备三种siRNA递送载体的方法，并介绍了将siRNA包装并递送至神经元细胞的流程（图1）。脂质体-siRNA-多肽复合物（LSPCs）由脂质体构成，其中siRNA和RVG-9r靶向多肽通过静电作用结合在脂质体的外表面。多肽靶向脂质体包裹治疗性siRNA（PALETS）则将siRNA和鱼精蛋白包裹于脂质体内，同时将RVG-9r通过共价键连接至脂质体的PEG化脂质基团上。采用以下方法制备LSPCs和PALETS，可在神经元细胞中使PrPC siRNA将PrPC的表达水平降低高达90%，在治疗或显著延缓朊病毒病病理发生方面具有巨大潜力。

<table><tbody><tr><td>DOTAP 脂质</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Avanti Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipids</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipids</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt; 气体</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>挤出器</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0、0.4 和 0.2 &amp;#956;m 滤膜</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>分装为单次使用剂量</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>分装为单次使用剂量</td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD16/CD32 Fc 封闭抗体</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>抗 PrP 抗体 (PRC5)</td><td> proprietary - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性sirna递送至中枢神经系统

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

朊病毒病由正常的细胞型朊蛋白（PrPC）错误折叠为一种异常的抗蛋白酶异构体PrPRes所致。野生动物群体中朊病毒病的出现及其对人类健康的日益威胁，促使人们加大努力寻找治疗这些疾病的方法。近期研究已发现多种抗朊病毒化合物，这些化合物可抑制具有感染性的PrPRes异构体，或下调正常细胞型朊蛋白的表达。然而，这些化合物中的大多数无法有效穿过血脑屏障以抑制脑组织中PrPRes的形成，不能特异性靶向神经元中的PrPC，并且通常对动物或人类受试者具有过高毒性。
我们研究了靶向神经元PrPC并经血管内递送的siRNA是否是一种更安全、更有效的抗朊病毒化合物。本报告概述了一种制备两种siRNA脂质体递送载体的方法，并介绍了将PrP siRNA包装并递送至神经元细胞的流程。这两种脂质体递送载体分别为：1）使用阳离子脂质体的复合siRNA脂质体制剂（LSPCs），以及2）使用阳离子或阴离子脂质体的包封siRNA脂质体制剂（PALETS）。在LSPCs中，带负电荷的siRNA通过静电作用结合到阳离子脂质体上。随后向该复合物中加入带正电荷的肽段（RVG-9r［狂犬病毒糖蛋白］），使脂质体-siRNA-肽复合物（LSPCs）能够特异性地穿越血脑屏障（BBB），靶向中枢神经系统（CNS）中表达乙酰胆碱的神经元。对于PALETS（靶向肽修饰的脂质体包封治疗性siRNA），通过PrP siRNA对阳离子和阴离子脂质进行水化，从而使siRNA被包封于阳离子或阴离子脂质体内。同样，将RVG-9r神经肽结合至脂质体表面，以引导siRNA/脂质体复合物靶向中枢神经系统。利用这些制剂，我们已成功将PrP siRNA递送至表达AchR的神经元，并降低了中枢神经系统中神经元的PrPC表达水平。

为了提高siRNA在阴离子PALETS中的包封效率，将siRNA与鱼精蛋白混合。为确定siRNA的最佳鱼精蛋白浓度，将siRNA与不同浓度的鱼精蛋白按1:1至2:1的比例混合（图3A）。在未使用鱼精蛋白的情况下，阴离子脂质体的siRNA包封效率为60-65%。当鱼精蛋白与siRNA的摩尔比在1:1至1.5:1（133-266 nM）范围内时，siRNA包封效率达到80-90%。摩尔比高于1.5:1时会导致siRNA/鱼精蛋白复合物发生沉淀。这些沉淀的复合物无法被包封进阴离子脂质体中。在将鱼精蛋白加入siRNA后，siRNA浓度因稀释作用而略有下降；然而，在加入鱼精蛋白后浓度保持稳定（图3B）。经50 kDa滤膜过滤后，90-95%的siRNA存在于脂质体截留物中，而5-10%的siRNA以“游离”形式存在于滤过液中。在仅含鱼精蛋白或仅含脂质体的样品中未检测到siRNA（图3C）。
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本实验方案的目标是利用带有神经靶向肽的阳离子/阴离子脂质体作为中枢神经系统递送系统，使siRNA能够穿过血脑屏障。优化siRNA等治疗方法的递送系统，将为朊病毒病及其他神经退行性疾病提供更多治疗选择。

使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

朊病毒病是由于正常的细胞型朊蛋白（PrPC）错误折叠，转变为一种异常的、抗蛋白酶的异构体PrPRes所致。

本实验的总体目标是设计一种能够将小分子药物（如siRNA）递送至大脑的递送系统。该方法可以解答神经退行性疾病领域中的一些关键问题，例如：siRNA是否可作为蛋白质错误折叠疾病的可行治疗手段？我们能否设计出一种可靠的大脑药物递送系统？构建脂质体药物递送系统的主要优势在于，我们可以通过静脉或血液循环递送siRNA，而非直接穿入神经组织，从而避免造成神经元损伤。该技术在神经退行性疾病的治疗与诊断方面具有重要意义，因为它能够实现跨越血脑屏障的特异性递送，特别是靶向表达乙酰胆碱的神经元。由于小鼠尾静脉较细，尾静脉注射技术难以掌握，因此该操作的可视化演示至关重要。首先配制 DOTAP 与胆固醇一比一的混合物。对于外源性动物脂质体的制备，将 2 纳摩尔 DOTAP 与 2 纳摩尔胆固醇溶于 10 毫升氯仿与甲醇一比一的混合溶液中。随后，使用氮气蒸发 9 毫升氯仿和甲醇溶液。在通风橱中，将最后1毫升溶剂在无气体条件下过夜蒸发。次日，应在烧瓶底部观察到一层薄薄的脂质膜。将此带有脂质膜的烧瓶与10毫升10%蔗糖溶液一同加热至55摄氏度。然后，一边轻轻旋转烧瓶，一边将加热的蔗糖溶液缓慢地用移液器滴加到薄脂膜上。接着，根据制造商的说明，组装带有1微米滤膜的挤出器。随后，将1毫升加热的脂质体悬浮液加入挤出器的一个注射器中。然后将悬浮液在两个注射器之间反复通过11次。在保持脂质体悬浮液加热以利于粒径均一化的条件下，依次通过45微米和2微米滤膜进行挤出。为制备大单层囊泡，接下来将20微升含4纳米摩尔的脂质体悬浮液加入200微升浓度为20微摩尔的siRNA储备液中，室温孵育10分钟。随后向siRNA-脂质体混合液中加入80微升浓度为500微摩尔的RVG-9R靶向肽储备液，室温孵育10分钟。通过将2.2纳摩尔的DSPE或DOTAP与1.6纳摩尔胆固醇及2纳摩尔DSPE-peg混合于10毫升氯仿与甲醇按2:1比例配制的溶液中，制备外源性动物脂质体悬浮液。随后通入氮气，待大部分溶剂蒸发后，将烧瓶置于通风橱中过夜。然后，缓慢加入10毫升预热至75摄氏度的1×PBS缓冲液至形成的脂质薄膜中。在粒径均一化前，将脂质于75摄氏度下水合至少一小时。如前所述，使用挤出器对脂质体悬液进行粒径均一化处理后，用移液器将四种不同纳米摩尔浓度的脂质体悬液各20微升分装至一次性分装管中，并使用台式冷冻干燥机冻干30分钟。接下来，将1.4微升浓度为26.6微摩尔的硫酸鱼精蛋白溶液加入200微升浓度为20微摩尔的siRNA储备液中，室温孵育10分钟，以压缩siRNA。孵育后，用201.4 µL siRNA 鱼精蛋白溶液重悬DSPE小丸，用200 µL siRNA异源动物储备液重悬DOTAP小丸。将每种脂质体siRNA溶液在室温下孵育10分钟。接下来，向每管重悬的脂质体中加入10 µL 60 mM的EDC溶液。然后向DOTAP和DSPE脂质体siRNA溶液中均加入10 µL 150 mM的sulfo-NHS溶液。室温孵育2小时。最后，向siRNA脂质体交联溶液中加入80微升500微摩尔的RVG-9R肽储备液，在室温下孵育10分钟。使用氧流中含2%至3%异氟烷麻醉小鼠后，用眼用软膏覆盖小鼠眼睛，并通过脚趾夹捏实验确认麻醉状态。仅在无反应时继续操作。在维持麻醉状态下，将小鼠仰卧或侧卧以暴露尾静脉。用70%乙醇擦拭尾部，然后使用26号胰岛素注射器向尾静脉注射300 µL的LSPCs或palets。从远端开始注射，若静脉塌陷或破裂，则向近端移动继续注射。将小鼠置于干净的笼子中，直至其能够维持胸卧位。注射后监测动物数小时，以确保麻醉作用消退且治疗无不良反应。在让LSPCs或palets循环至少24小时后，处死小鼠，解剖取出半个脑半球。然后将半球形组织和2.5毫升fax缓冲液置于40微米孔径的细胞滤筛上，使用注射器的推杆将组织压过滤膜，收集至培养皿中。再用额外的2.5毫升fax缓冲液冲洗细胞滤筛和培养皿。随后将单细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并置于冰上。接下来，取100微升细胞悬液加入微量离心管中，在350 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升fax缓冲液中，再次离心。然后加入1毫升fax缓冲液，将细胞悬液置于冰上。现在，将细胞与100微升大鼠抗小鼠Fc阻断剂（溶于fax缓冲液）在冰上孵育30至60分钟。离心收集并按前述方法洗涤后，加入100 µL荧光标记的一抗溶液，置于冰上孵育30至60分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于1 mL RVC裂解缓冲液中，孵育1分钟，随后离心收集细胞。弃去缓冲液后，将沉淀重悬于一毫升 fax 缓冲液中，并置于冰上。此时细胞已准备好进行 fax 分析。通过 LSPC 递送 siRNA 处理的小鼠，其细胞型朊蛋白水平较 PBS 对照组显著降低，而对照组显示正常的细胞型朊蛋白水平。经LSPCs处理的小鼠表现出的细胞型朊蛋白水平接近于朊蛋白基因敲除小鼠。在三次实验中，与PBS对照组和类型对照组相比，经LSPCs处理的小鼠其细胞型朊蛋白水平均显著降低。在进行该操作时，需注意脂质体可在冰箱中保存数月，但完整的LSPCs在组装完成后必须在24小时内使用。在该技术开发之后，LSPCs 或类胚体的生成将为研究人员探索神经退行性疾病领域的更多治疗方案铺平道路。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

治疗的siRNA递送至CNS使用阳离子和阴离子脂质体

药物包封可增强对肿瘤细胞的特异性，并降低神经毒性。...

聚乙二醇包被的带电脂质体通过对流增强递送至大鼠脑肿瘤

来源：Ullah, I., et.al. 一种用于小鼠经鼻递送siRNA至中枢神经系统时固定体位的装置。J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了一种精确的经鼻给药技术，用于通过特制的定位装置将靶向神经元的肽-siRNA 复合物递送至小鼠脑部。将麻醉后的小鼠固定于头朝下并前倾的位置，以优化 siRNA 的吸入效果并防止其流入肺部。靶向肽可促进神经元中受体介导的摄取，从而实现脑内 siRNA...

使用定位装置将siRNA递送至小鼠脑部的鼻内给药方法

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关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

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大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

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