使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

本实验的总体目标是设计一种能够将小分子药物（如siRNA）递送至大脑的递送系统。该方法可以解答神经退行性疾病领域中的一些关键问题，例如：siRNA是否可作为蛋白质错误折叠疾病的可行治疗手段？我们能否设计出一种可靠的大脑药物递送系统？

构建脂质体药物递送系统的主要优势在于，我们可以通过静脉或血液循环递送siRNA，而无需直接穿入神经组织，从而避免造成神经元损伤。该技术在神经退行性疾病的治疗与诊断方面具有重要意义，因为它能够实现跨越血脑屏障的特异性递送，尤其是靶向表达乙酰胆碱的神经元。由于小鼠尾静脉较细小，尾静脉注射技术难以掌握，因此对该技术进行可视化演示至关重要。

首先准备摩尔比为1:1的DOTAP与胆固醇。对于外源动物脂质体的制备，将2纳摩尔DOTAP与2纳摩尔胆固醇加入10毫升氯仿与甲醇体积比为1:1的溶液中混合。然后，用氮气蒸发9毫升的氯仿和甲醇溶液。

在通风橱中过夜蒸发至剩余约1毫升溶剂，期间不充入气体。次日，烧瓶底部应可见一层薄薄的脂质膜。将此带有脂质膜的烧游戏副本和10毫升10%蔗糖溶液一同加热至55摄氏度。

然后，一边缓慢地将加热的蔗糖溶液用移液器滴加到薄脂膜上，一边轻轻旋转烧瓶。接着，按照制造商的说明，组装带有1微米滤膜的挤出器。随后，将1毫升加热的脂质体悬液加入挤出器的一个注射器中。

然后将悬浮液在两个注射器之间反复通过11次。在保持脂质体悬浮液加热以利于粒径均一的同时，依次通过45微米和2微米滤膜进行挤出。为制备大的单层囊泡，接下来将20微升含4 nmol的脂质体悬浮液加入200微升浓度为20 µM的siRNA储备液中，室温孵育10分钟。然后向siRNA-脂质体混合液中加入80微升浓度为500 µM的RVG-9R靶向肽储备液，室温孵育10分钟。

通过将2.2 纳摩尔的DSPE或DOTAP与1.6 纳摩尔胆固醇及2 纳摩尔DSPE-peg加入10毫升氯仿与甲醇按2:1配制的溶液中，制备外源性动物脂质体悬液。随后，通入氮气，待大部分溶剂蒸发后，将烧瓶置于通风橱中过夜。然后，缓慢加入10毫升预热至75摄氏度的1×PBS缓冲液至形成的薄脂膜中。

在粒径均一化前，将脂质于75摄氏度下水合至少一小时。如前所述，使用挤出器对脂质体悬液进行粒径均一化后，用移液器将四种4 nmol脂质体悬液各20 µL分装至一次性分装管中，并使用台式冷冻干燥机冻干30分钟。接下来，将1.4 µL的26.6 µM硫酸鱼精蛋白溶液加入200 µL的20 µM siRNA储备液中，室温孵育10分钟，以压缩siRNA。

孵育结束后，用201.4 µL siRNA鱼精蛋白溶液重悬DSPE小丸，用200 µL siRNA异源动物储备液重悬DOTAP小丸。将每种脂质体siRNA溶液在室温下孵育10分钟。

接下来，向每管重悬的脂质体中加入10 µL 60 mM的EDC溶液。然后向DOTAP和DSPE小片的脂质体siRNA溶液中均加入10 µL 150 mM的sulfo-NHS溶液。室温孵育2小时。

最后，向siRNA脂质体交联溶液中加入80微升浓度为500微摩尔的RVG-9R肽储备液，在室温下孵育10分钟。使用含2%至3%异氟烷的氧气麻醉小鼠，用眼膏覆盖小鼠眼睛，并通过脚趾夹捏实验确认麻醉效果。只有在无反应时方可继续操作。

在维持麻醉状态下，将小鼠仰卧或侧卧以暴露尾静脉。用70%乙醇擦拭尾部，然后使用26号胰岛素注射器向尾静脉注射300 µL的LSPCs或palets。从远端开始注射，若静脉塌陷或破裂，则向近端移动继续注射。

将小鼠放入清洁的笼子中，直至其能够维持胸卧位。注射后监测动物数小时，以确保麻醉作用消失且治疗未产生不良影响。在让LSPCs或palets循环至少24小时后，处死小鼠，解剖取出半个脑半球。

然后将半球形组织和2.5毫升fax缓冲液置于40微米的细胞筛网上，使用注射器的推杆将组织压过滤膜进入培养皿中。用额外的2.5毫升fax缓冲液冲洗细胞筛网和培养皿。随后将单细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并置于冰上。

接下来，取100微升细胞悬液加入微量离心管中，在350 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，用1毫升fax缓冲液重悬细胞沉淀，并再次离心。然后，加入另一毫升fax缓冲液，将细胞悬液置于冰上。现在，将细胞与100微升含大鼠抗小鼠Fc阻断剂的fax缓冲液在冰上孵育30至60分钟。

离心收集并按前述方法洗涤后，加入 100 µL 荧光标记的一抗溶液，置于冰上孵育 30 至 60 分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于 1 mL RVC 裂解缓冲液中，作用 1 分钟，随后离心收集细胞。

弃去缓冲液后，将沉淀重悬于一毫升 fax 缓冲液中，并置于冰上。细胞现在可用于 fax 分析。通过 LSPC 递送 siRNA 处理的小鼠与 PBS 对照组相比，细胞型朊蛋白水平显著降低，而对照组显示正常的细胞型朊蛋白水平。

经LSPCs处理的小鼠表现出的细胞型朊蛋白水平接近于朊蛋白基因敲除小鼠。在三次实验中，与PBS对照组和类型对照组相比，经LSPCs处理的小鼠其细胞型朊蛋白水平均显著降低。在进行该操作时，需注意脂质体可在冰箱中保存数月，但组装完成的LSPCs必须在24小时内使用完毕。

在该技术开发之后，LSPCs 或类胚体的生成将为研究人员探索神经退行性疾病领域的更多治疗选择铺平道路。