Name: 引导和分析男性超声波声（USV）歌曲 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习成年雄性小鼠超声波发声的采集与声学分析方法。该方案通过不同社会情境诱导USV，帮助研究人员利用动物模型研究神经精神疾病中的声音交流机制。

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本工作得到了霍华德·休斯医学研究所对 EDJ 的资助。我们感谢普鲁·西尔维·格拉诺（NeuroPSI - 巴黎第十一大学 - 法国）出借扬声器硬件。我们还感谢贾维斯实验室成员对本研究的支持、讨论以及在修改和评论方面提供的帮助，特别感谢约书亚·琼斯·马科普森在图示绘制和测试方面给予的帮助。我们感谢古斯塔沃·阿里亚加博士在小鼠鸣叫分析软件（Mouse Song Analyzer）方面的协助，他为我们将软件升级至 V1.3 版本，并协助了本方案的其他方面工作。该软件 v1.0 版本由 Holy 和郭开发，v1.1 和 v1.3 版本由阿里亚加开发。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了在实验室条件下，针对多种主要与雌性相关的刺激，收集、量化和研究雄性小鼠求偶发声的方法。如Chabout先前所述， 等 23在代表性结果中，该方法使我们能够发现对接受雌性具有重要意义的、依赖于情境的发声行为及语音结构。这些刺激的标准化将有助于可靠地收集大量超声波发声（USVs），并实现对雄性求偶歌曲及其发声序列的详细分析。
当有活体雌性与雄性共处时，本方案无法明确区分发声的来源个体。然而，先前的研究表明，在此类情境下记录到的大部分发声信号来自雄性26,29。大多数使用同种个体（雄性或雌性）作为雄性刺激的研究认为，雌性在此类情境中的发声量可忽略不计4,5,22,30。然而，最近一项研究采用三角定位法，在群体饲养条件下对发声个体进行了声源定位31，结果表明，在配对关系中，雌性贡献了约10%的超声波发声（USVs）。在本方案中，使用麻醉雌性可使研究者在存在雌性刺激的情况下研究雄性的发声行为，同时避免雌性自身发声的干扰。与上述近期研究的预期相反31，我们发现雌性存在（FE）与麻醉雌性（AF）两种条件下，雄性发出的音节数量并无显著差异23。这一结果可能说明活体雌性在录音中并未显著贡献发声信号，或雄性在活体雌性面前的发声频率低于在麻醉雌性面前。尽管如此，我们认为未来的研究应考虑采用这种三角定位方法，以评估雌性发声可能带来的影响。
还有其他软件可以执行我们所述的部分步骤，但我们认为，对于本研究提出的问题，仅使用单一软件尚不足以充分解决。因此，我们结合了三种程序：软件A、使用软件B的Mouse Song Analyzer软件脚本C、基于自定义电子表格软件D+E计算的句法分析软件，以及使用R语言的句法解码器。例如，最近有研究提出了一款名为VoICE的软件，该软件可允许用户从声谱图中自动提取声学参数，或直接对由用户手动选定的单元进行声学变量提取。32但自动化或半自动化的序列分析不如我们的方法详细。一些商业软件可以自动分析声学特征，但无法对音节进行自动分类；用户仍需在之后对不同音节进行手动分类。Grimsley, Gadziola, 等 33 开发了一种基于表格的虚拟小鼠发声器官程序，该程序可根据共享的声学特征对音节进行聚类，但不提供音节的自动检测功能。他们的程序34 其独特之处在于利用马尔可夫模型从录制的歌曲中生成全新的序列，因此相较于简单的编辑具有更先进的功能。
以往关于小鼠交流的大多数研究都集中在发声者一方35,36。少数研究探讨了接收者一方30,37,38。回放与辨别实验方案为研究接收者行为提供了简单的方法，例如Asaba, Kato, et al. 39近期所描述的方法。在该研究中，作者使用了一个用吸音泡沫分隔的双选择测试箱，而非本文所述的Y型迷宫箱。两种选择装置各有优缺点。首先，Y型迷宫无法将一个臂中的声音与另一个臂完全隔离，而双选择箱则可以实现声音隔离。然而，采用Y型迷宫设计，动物能够快速评估同时播放的两种歌声，并向其偏好的一方移动。尽管如此，总体而言，回放实验有助于研究者确定发声对同种动物所具有的意义及其功能。总之，在掌握本实验方案及其分析技术后，读者应能够探讨诸多影响小鼠超声波发声（USVs）的情境、遗传学及神经生物学因素的问题。
使用 B6D2F1/J 小鼠时，我们在实验室中测试的雄性小鼠几乎总是会被雌性相关的刺激诱发发出超声波发声（USVs）。为了能够进行有力的统计学分析，关键是要收集足够的音节（&#62; 100 个/5 分钟）。如果未记录到超声波发声（或数量不足），可参考以下故障排除方法：首先检查设备配置，确保声音正在被正常记录；在引入刺激后，通过计算机屏幕上实时显示的声谱图，现场观察笼内发生的情况。否则，可尝试将雄性小鼠与性成熟且具有接受性的雌鼠共处一晚，随后单独饲养数天至一周，再进行下一次记录。根据经验性观察，我们发现某些雄性小鼠在某一天可能持续鸣唱很长时间（几乎持续整整 5 分钟），而第二天则发声很少，之后又可能在另一天再次大量发声。目前尚不清楚此类个体内部变异发生的原因，但我们推测这可能与雄性自身的动机或季节性因素有关，也可能与雌性尿液所反映的动情周期状态相关。如果仍未记录到超声波发声，建议在多个不同日期重复记录，以捕捉这些可变效应。与鸣禽不同的是，我们并未观察到一天中不同时间段在鸣唱量上的明显差异。我们发现，雄性小鼠在7周龄之前通常发声较少（&#60; 100 个音节/5 分钟）。
本文介绍的检测方法可在几分钟内提取出数千个音节及所有声学参数。但与所有自动检测方法一样，该方法对背景噪声非常敏感。使用 Mouse Song Analyzer 检测软件分析噪声较多的录音（例如在垫料环境中录制的动物声音）时，可能需要调整检测&#34;阈值&#34;以增加灵活性。然而，这也会增加误检音节的数量，甚至导致自动检测失败。在此情况下，可采用人工编码方法。
如前所述，不同品系小鼠发声的数量、类型和潜伏期存在广泛差异，因此可能需要调整参数（录音时长、刺激方式、自动音节检测）。 等。) 对某些菌株进行处理，以确保获得适用于统计分析的最佳记录数据。

与人类相比，小鼠能够发出低频和高频两种类型的叫声，其中高频叫声称为超声波发声（USVs），其频率高于人类的听觉范围。USVs 出现在多种行为情境中，包括母鼠与幼崽间的呼唤、青少年期小鼠间的互动，以及成年小鼠同性或异性间的互动4,12。这些超声波发声具有多样化的多音节发声图谱，可通过人工方法9或自动化方法10,11进行分类。近年来，对 USVs 在交流中的作用的研究日益增多，包括将其作为神经精神疾病、发育障碍或行为异常小鼠模型的表型指标7,8，以及反映个体内部动机或情绪状态的指标13。目前认为，USVs 能够传递发声个体状态的可靠信息，对听者具有行为学意义14,15。
2005年，Holy 和 Guo 11，提出了成年雄性小鼠的超声波发声（USVs）由多音节发声单元或音节有序组成，类似于鸣禽的鸣唱。在许多物种中，多音节发声库允许发声者以不同方式组合和排列音节，从而增加声音信号所携带的潜在信息量。这种发声句法的变异被认为在性行为和配偶偏好中具有生态行为学意义。16,17后续研究表明，雄性小鼠能够在雌性出现之前、期间和之后改变其发出的音节类型相对组成。5,18也就是说，成年雄性小鼠利用其超声波发声（USVs）进行求偶行为，以吸引雌性、维持与雌性的近距离接触，或促进交配。19,20,21它们也在雄性之间的互动中释放，可能用于在互动过程中传递社会信息4为了捕捉这些发声谱系的变化，科学家通常会测量其声学特征参数（如振幅、频率等）。 等等。），USV音节或叫声的数量，以及首次发出USV的潜伏期。然而，很少有研究真正详细地分析这些USV的序列动态特征22最近，我们课题组开发了一种新方法，用于测量超声波发声音节序列的动态变化23我们发现，歌曲中音节的排列顺序（即句法）并非随机，而是会随社会情境的变化而改变，并且听觉动物能够察觉到这些变化并将其识别为具有生态学意义的信息。
我们注意到，许多研究动物交流的科研人员所使用的“语法”一词，其确切含义并不等同于人类语言中的语法。在动物交流研究中，我们仅指声音以某种规则排列形成的有序、非随机的序列。而对于人类而言，特定的序列具有特定的意义。目前尚不清楚小鼠是否存在类似情况。
本文及配套视频旨在提供可靠的实验方案，用于记录雄性小鼠在不同情境下的求偶超声波发声（USVs），并进行回放实验。文中展示了三种依次使用的软件：1）用于自动录音；2）用于音节检测与编码；3）用于对音节特征和语法进行深入分析（图1）。该方法有助于我们更深入地了解雄性小鼠超声波发声的结构与功能。我们相信，此类方法可简化数据分析过程，并分别为研究沟通障碍及神经精神疾病小鼠模型中正常与异常发声交流的表征开辟新的研究前景。

<table><tbody><tr><td>隔音沙滩冷藏箱</td><td>参见 Gus 论文，其中包含有关具体类型的更多信息</td><td></td><td>内部尺寸（长 27 × 宽 23 × 高 47 cm）：</td></tr><tr><td>电容式超声麦克风 CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics，德国柏林</td><td>#40011</td><td>包含延长电缆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasound Gate 1216H 声卡</td><td>Avisoft Bioacoustics，德国柏林</td><td>#34175</td><td>12通道声卡</td></tr><tr><td>超声门控播放器 216H</td><td>Avisoft Bioacoustics，柏林，德国</td><td>#70117</td><td>2通道播放器</td></tr><tr><td>超声波静电扬声器 ESS 胶片</td><td>Avisoft Bioacoustics，德国柏林</td><td>#60103</td><td>2 个播放扬声器</td></tr><tr><td>测试笼&amp;nbsp;</td><td>Ace</td><td>#PC75J</td><td>30 × 8 × 13 cm 高度；聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）</td></tr><tr><td>亚克力隔板分离</td><td>自制</td><td>-</td><td>4 个 13 厘米长的聚甲基丙烯酸甲酯管，每管带有 1 厘米直径的孔</td></tr><tr><td>视频摄像机</td><td>罗技</td><td>C920</td><td>罗技 HD Pro 网络摄像头 C920</td></tr><tr><td>加热垫&amp;nbsp;</td><td>阳光束</td><td>722-810-000</td><td></td></tr><tr><td>Y迷宫&amp;nbsp;</td><td>自制</td><td>-</td><td>内部尺寸（长 30 × 宽 11 × 高 29 cm）：</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;软件&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avisoft Recorder（软件 A）</td><td>Avisoft Bioacoustics，德国柏林</td><td>#10101, #10111, #10102, #10112</td><td>http://www.avisoft.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2013a（软件 B）</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>MATLAB R2013a (8.1.0.604)</td></tr><tr><td>小鼠鸣叫分析仪 v1.3（软件 C）</td><td>由 Holy、Guo、Arriaga 定制设计 &amp;amp; Jarvis；使用软件 B 运行</td><td></td><td>http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_&lt;br /&gt;v1.3-2015-03-23.zip</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel 2013（软件 D）</td><td>微软</td><td>-</td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>歌曲分析指南 v1.1（软件 E）</td><td>由 Chabout 定制设计 &amp;amp; Jarvis. Excel 计算器表格，与软件 D 配合使用</td><td></td><td>http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx</td></tr><tr><td>语法解码器 v1.1（软件 F）</td><td>由 Sakar、Chabout、Dunson、Jarvis 在 R studio 中定制设计</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr><tr><td>Graphiz（软件 G）</td><td>AT&amp;amp;T 研究及其他团队&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.graphviz.org</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab（软件 H）</td><td>Avisoft Bioacoustics，柏林，德国</td><td>#10101, #10111, #10102, #10112</td><td>http://www.avisoft.com</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;试剂&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine（20 mg/mL）</td><td>安内静</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮（100 mg/mL）</td><td>Henry Schein</td><td>#045822</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼膏&amp;nbsp;</td><td>Puralube Vet 软膏&amp;nbsp;</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

诱发与分析雄性小鼠超声 vocalization（usv）鸣唱

Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs

小鼠在发育期和成年期的多种社交情境中会产生超声波发声（USVs）。这些超声波发声被用于母鼠与幼崽之间的召回1、幼年个体间的互动2、异性及同性个体间的交流3,4,5，以及领地性互动6。数十年来，研究人员一直将超声波发声作为研究神经精神疾病、发育障碍或行为异常的间接指标7,8,9，而近年来也被用于理解脊椎动物发声交流的机制与进化过程10。在性相关互动中，成年雄性小鼠会发出具有多音节结构的超声波歌曲，其中某些特征与鸣禽的求偶鸣唱相似11。此类多音节发声序列的使用可增强其潜在的灵活性和信息承载能力，因为这些音节在组织方式和重新组合方式上可以发生变化，即所谓的“句法”。本实验方案描述了一种可靠的方法，用于在不同社交情境下诱发雄性小鼠产生超声波歌曲，例如暴露于新鲜雌鼠尿液、麻醉个体或处于动情期的雌鼠。该方法包含能够诱导小鼠产生大量音节的实验条件。我们采用低成本的隔音装置以减少环境噪声的干扰，并提供一种可自动检测、分类和分析超声波发声的量化方法。后者包括对发声频率、发声类型库、声学参数以及句法结构的评估。本文还介绍了多种利用播放实验（playbacks）研究动物对特定歌曲类型偏好的方法与见解。这些方法已被用于描述雄性小鼠在不同情境下的声学特征与句法变化，以及雌性小鼠的歌曲偏好。

在本实验方案中，对雄性B6D2F1/J小鼠的发声行为及发声序列结构的变化进行了表征。通常情况下，使用本方案可在每次5分钟的实验中，平均每只雄性小鼠记录到：对雌性新鲜尿液（UR）刺激产生675 ± 98.5个分类音节，对清醒雌性（FE）产生615.6 ± 72个音节，对麻醉雌性（AF）产生450 ± 134个音节，对清醒雄性（AM）产生75.6 ± 38.9个音节，对雄性新鲜尿液刺激仅产生0.2 ± 0.1个音节（n = 12只雄性小鼠）。在雌性尿液刺激、清醒雌性和麻醉雌性情境下的发声速率分别为约130音节/分钟、约120音节/分钟和约100音节/分钟（图5A）。雄性小鼠对新采集的尿液产生的音节数量明显多于过夜收集的尿液10,23。此外，当面对麻醉雄性或新鲜雄性尿液时，雄性小鼠的发声显著减少（图5A）。雄性小鼠的发声类型也会随情境变化而改变23。例如，B6D2F1/J雄性小鼠在雌性尿液刺激条件下会显著增加多音高跳跃型“m”类音节的产生（图5B）。它们还会在不同情境下改变单个音节的声学特征。例如，与其它情境相比，B6D2F1/J雄性小鼠在雌性尿液情境中发出的音节具有更高的振幅和带宽，而在清醒雌性情境中则表现出更高的谱纯度（图6）23。
该方案还提供了一种测量序列动态特征及句法变化的方法。采用Ey等人改进的方法， 等 22，我们使用 ISI 来定义序列之间的间隔（图7A)23，然后利用这些间隙来区分和分析音节序列的时间模式。我们发现，在清醒的雌性情境下会产生更长的序列长度图 7B)23该技术使我们能够计算复杂序列（由至少2个“m”音节类型组成）与简单序列（由1个或无“m”类型组成，因此主要由“s”类型构成）之间的比率。我们发现，在B6D2F1/J雄性小鼠中，雌性尿液环境所引发的该比率高于其他条件图7C)23，表明它们在雌性尿液条件下产生了更复杂的音节，且这些音节分布在更多的序列中。
我们还可以计算从一种音节类型到另一种音节类型的条件转移概率（共24种转移类型，包括与“静音”状态之间的转移）23。我们发现，在不同条件下，小鼠在给定起始音节时选择的转移类型有所不同，且在雌性尿液刺激条件下具有更高的鸣叫句法多样性（图8）23。这些观察结果与先前的研究报道一致，表明雄性个体能够根据不同的刺激和经历改变其发声的声学特征或鸣叫类型组成4,5,24。
最后，本方案提供了利用回放实验测试雌性偏好行为的指导。我们发现，B6D2F1/J品系雌性更倾向于比简单鸣唱（仅含1个“m”音节）更复杂的鸣唱（包含2个或更多“m”音节）23大多数雌性倾向于更频繁地停留在Y迷宫中播放复杂鸣唱的一侧（图 4B).
<img alt="超声波发声（USVs）音频分析流程图：录制、处理、统计分析、回放。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：软件使用与分析流程图。 每个程序及其相关代码均以字母命名，以帮助在正文中说明其身份和用途。（）内为我们方案中所使用的具体程序。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="声音衰减实验装置、声谱图数据分析、频率与时间图表对比。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：雄性小鼠鸣叫录音的实验装置。 (A) 声音衰减录音箱及其记录超声波发声（USV）的设置示意图。 (B) 使用软件 A（表 1）获得的录音示例声谱图，其中包含由“Mouse Song Analyzer v1.3”计算出的详细频谱特征：持续时间、音节间间隔（ISI）、峰值频率最小值（Pf min）、峰值频率最大值（Pf max）、峰值频率起始值（Pf start）、峰值频率结束值（Pf end）以及带宽。 (C) 同一只雄性小鼠在声音衰减箱内和实验室台面上（同一房间内但箱外）对一只活体雌鼠鸣叫时的声谱图对比。根据我们的经验观察，箱内录音显示声音音量更大（强度更高）、谐波更少，但即使在未使用吸音棉的情况下，箱内也未发现明显回声。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="频率和持续时间设置的声谱图分析界面；动物声音的频谱图。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：“Mouse Song Analyzer v1.3” whis_gui 窗口的截图，显示可用于分析的不同选项。图中所示参数用于记录雄性小鼠超声发声（USVs）的图像和数据分析（除最短音符持续时间设为3 ms外）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Y迷宫示意图及条形图，显示雄性鸣叫类型对雌性在迷宫臂中停留时间的影响，行为学研究。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：雌性对复杂与简单鸣叫回放的选择偏好。（A） 所使用的Y迷宫装置示意图及尺寸测量。（B） 雌性在播放同一雄性个体鸣叫的两个臂中的停留时间，其中一种为更复杂的鸣叫（由雌性尿液诱导产生），另一种为较简单的鸣叫（由清醒雌性诱导产生）。数据以n = 10只B6D2F1J雌性小鼠的平均值±标准误表示，同时展示了单个数据点；10只雌性中有9只更偏好音节/序列更复杂的鸣叫。* p &lt; 0.05，配对样本t检验。本图经许可改编自Chabout, et al. 23。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较上下文频率的柱状图和饼图；含 p 值的统计分析、数据可视化。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：不同条件下发出的音节数量与发声范围. （A） 不同情境下男性音节产生速率 (B) 雄性在接触雌性尿液（UR）、麻醉雌性（AF）、清醒雌性（FE）和麻醉雄性（AM）情境下的鸣唱曲目组成。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。* p&lt;0.03；** p&lt;0.005；*** p&lt;0.0001（经 Benjamini 和 Hochberg 校正后的事后配对样本 t 检验，n = 12 只雄性）。图片来自 Chabout， 等 23 经许可。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="振幅，带宽，频谱纯度条形图，上下文对比，实验数据分析" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：不同背景下的光谱特征示例 （A） 振幅。* p&lt; 校正后事后配对样本 t 检验的 p 值为 0.025。 (B) 频率范围或带宽。*：p &lt; 0.041；**：p &lt; 0.005；***：p &lt; 0.0001，校正后。 （C） 音节的光谱纯度。* p: &lt; 0.025；**：p &lt; 0.005；***：p &lt; 校正后为 0.0001。缩写：女性尿液（UR）、麻醉雌性（AF）、清醒雌性（FE）和麻醉雄性（AM）。图片改编自 Chabout， 等 23 经许可。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="频谱图和条形图；音频频率分析；不同情境下的音节复杂性" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7：序列测量。 （A） 使用ISI来分隔序列。短ISI（SI）和中等ISI（MI）用于分隔序列内的音节，而长ISI（超过250 ms，LI）用于分隔两个序列。 (B) 不同情境下雄性个体发出的序列长度（以每个序列的音节数量衡量）。*：p &lt; 0.025；** p &lt; 0.005；*** p &lt; 0.0001，校正后。 (C) 不同情境下雄性个体发出的复杂歌曲与简单歌曲的比例。* p &lt; 0.041; ** p &lt; 0.005；*** p &lt; 0.0001。数据以均值 ± 标准误表示（n = 12 只雄性）。图源自 Chabout， 等 23 经许可。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="说明通信系统中信号通路的网络图。" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8：基于每种语境下条件概率的序列音节句法图。 箭头粗细与每种语境中转移类型的条件概率发生率成正比，该概率由 n = 12 只雄性个体的数据取平均值计算得出：P（给定起始音节时发生某种转移的概率）。为清晰起见，发生概率低于 0.05 的罕见转移未予显示。图源自 Chabout，et al. 23，经许可使用。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

小鼠能够发出复杂且包含多个音节的超声波发声（USVs）。这些超声波发声被广泛用作神经精神疾病的研究指标。本实验方案描述了我们在持续诱导、采集和分析小鼠鸣叫声的声学特征与发声序列结构过程中总结并发展出的一些实践方法。

诱发与分析雄性小鼠超声 vocalization（USV）鸣唱

小鼠在发育期和成年期的多种社交情境中会产生超声波发声（USVs）。这些超声波发声用于母鼠与幼鼠之间的交流……

本实验的总体目标是，在多种社交情境下，可靠地采集成年雄性小鼠的超声 vocalizations（USVs）并进行声学分析。该方法有助于利用小鼠模型回答有关发声交流及其相关障碍的关键问题，包括神经精神障碍和自闭症障碍。该技术的主要优势之一在于它能够在多种情境下诱发小鼠发出超声波发声（USV）。通常，刚接触此方法的研究者可能难以让小鼠表现出相应行为，因此必须小心且轻柔地处理小鼠，以促使其发声。本方案采用标准的动物饲养条件即可。在中性笼中进行记录前的三天，将雄性动物与性成熟且处于发情期的雌性动物同笼过夜。每个笼子中最多可将三只雄性动物与一只雌性动物配对。次日移除雌性动物。在首次记录前，将雄性小鼠继续以群养方式饲养至少两天以上。记录超声波发声（USV）时，轻轻抓住已准备好的雄性小鼠尾巴，将其转移至一个无垫料的清洁笼子中，并将该笼子放入隔音箱内。然后用开口的金属网盖盖住笼子。关闭盒子，让动物适应环境15分钟。同时，按照下一部分所述方法准备检测用的刺激物。若使用新鲜尿液样本，需在记录开始前五分钟内收集。首先像进行药物注射一样，用一只手抓住小鼠颈背部的皮肤。然后用镊子夹住棉签，轻轻擦拭并按压小鼠的膀胱部位，以挤出一滴尿液，并用棉签完全吸收。接着，从另一个笼子中选取一只小鼠，使用同一根棉签重复上述过程。使用新鲜尿液的混合物非常重要。将棉签头保存在干净的培养皿中，直至需要时使用。为准备一只作为刺激物的警觉雌鼠，应选择处于前发情期或发情期的个体。该小鼠将具有较宽的阴道开口及粉红色的周围组织。将此类雌性小鼠隔离至需要时使用。制备麻醉小鼠时，按常规方法给予麻醉。通过脚趾夹捏确认麻醉状态，并涂抹眼用软膏。在需要使用之前，将麻醉后的动物置于干净的笼子中，笼内铺有纸巾，并在笼子下方放置加热垫，加热垫调至最低温度。务必定期检查动物的呼吸和体温。麻醉后的小鼠最多可用于三次连续实验操作。准备开始记录时，在软件中点击录制按钮，同时呈现刺激物。若要呈现尿液或活体动物，只需将其放入笼内即可。若要呈现麻醉后的动物，则应将其放置在笼盖顶部。然后轻轻关闭盒子，记录约五分钟的超声波发声（USV）。要结束记录，请在软件中按下停止方块。至少每15分钟检查一次麻醉动物的状态。直到其恢复胸卧位，然后可将其放回居住笼中。每次测试之间，需用70%酒精和蒸馏水清洁测试笼。使用小鼠鸣叫分析软件处理声学录音，从而可对音节、声学结构和句法进行分析，并根据需要重新构建以用于回放。首先用70%酒精清洗回放装置，然后用蒸馏水冲洗。使用黑色不透明的Y型迷宫，臂长为30厘米。在两个臂的末端底部钻孔，用于安装超声波扬声器。清洗后，用毛巾将迷宫擦干。干燥后，安装好播放扬声器并架设上方视频摄像机。开始测试时，先将雌性动物放入迷宫中，进行10分钟的适应期。10分钟后，如果雌性动物不在起始臂中，轻轻将其推回起始臂，并轻轻关闭塑料隔离窗。然后开始视频录制，并将音频 recordings 设为循环播放。例如，在一侧播放从尿道刺激中采集的歌曲，在另一侧播放从雌性刺激中采集的歌曲。现在让雌性在迷宫中自由探索五分钟。这构成一次实验。五分钟后停止记录，并将雌性动物放回起始臂。在此处停留一分钟，同时用蒸馏水清洁，以去除任何尿液或排泄物。每次实验之间均需执行此操作。在第二次实验中，将录音回放切换至相反的臂中，并记录雌性探索该情境的五分钟。在第三和第四次实验中，重复前两次实验的参数，总共获得20分钟的测试记录。每次实验结束后务必停止视频录制。一周后，对同一组动物再次进行测试，但使用不同的歌曲样本。这样做可以提高研究结果的可靠性。分析时，测量雌性小鼠在每次实验中于各臂所花费的时间。采用本方案，对雄性B6D2F1J小鼠的发声行为及发声序列结构的变化进行了表征。在五分钟的记录过程中，一名平均男性对三种刺激的反应截然不同。男性在不同情境下的发声模式也发生了变化。例如，面对新鲜尿液时，男性在其鸣唱中产生了显著更高比例的多音节发声。雄性个体在不同情境下也改变了单个音节的声学特征。例如，在雌性尿液情境中，它们以更高的振幅和带宽演唱某些音节；而在清醒雌性情境中，则表现出更高的谱纯度。在鸣声偏好测试中，雌性小鼠在Y型迷宫中选择在播放包含两个或更多多音节发声的复杂鸣声的臂中停留更长时间，而与之相对的另一臂仅播放简单鸣声。观看本视频后，您应能充分了解如何在多种社交情境下采集小鼠的超声发声（USV），如何将这些鸣声回放给小鼠，以及如何对其发声进行声学和序列分析。一旦掌握，每只小鼠的行为记录可在5到10分钟内完成。分析则需预留数小时。务必小心操作小鼠，以免影响其行为反应。

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行为

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学习成年雄性小鼠超声波发声的采集与声学分析方法。该方案通过不同社会情境诱导USV，帮助研究人员利用动物模型研究神经精神疾病中的声音交流机制。

诱发与分析雄性小鼠超声 vocalization（USV）鸣唱

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