Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

该程序的总体目标是评估从慢性病毒感染小鼠中分离的调节性 T 细胞的体外抑制功能。该方法可以帮助回答有关慢性病毒感染期间活化调节性 T 细胞的表型和体外抑制功能的问题。该技术可以评估调节性 T 细胞对个体的直接影响，在体外对 T 细胞有阳性反应。

这是这种技术的一大优势。首先将 50 微升 facs 缓冲液中的 5 乘以 10 至第五个总脾淋巴细胞转移到新的 U 底 96 孔板的每个孔中，然后是 150 微升 facs 缓冲液。离心板并弃去上清液。

然后搅拌细胞沉淀，并在每孔 200 微升 facs 缓冲液中再洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于每孔 50 μL 抗体混合物中，在 4 摄氏度的黑暗中 20 分钟。然后在 facs 缓冲液中洗涤细胞两次，并倒出上清液。

接下来，在 4 摄氏度下用 100 μL 固定缓冲液在黑暗中固定细胞 20 分钟，然后用透化洗涤缓冲液洗涤两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于 50 μL 抗 FOXP3 抗体中。为了制备抗 CD3 CD28 包被的磁珠，将适当体积的磁珠转移到 15 毫升试管中，并加入等体积的 PPS。

通过移液轻轻混合溶液，然后离心磁珠。洗涤结束时，弃去上清液，并在每孔 50 μL 完全培养基中稀释珠子。接下来，在 96 孔 U 底板中接种 50 微升 1 乘 10 至第五个 CD4 阳性 CD25 阳性调节性 T 细胞，然后在 96 孔 U 底板中接种 50 微升 1 乘 10 至第五个 CD8 阳性反应型 T 细胞。

当所有细胞都铺板后，向每个孔中加入 50 微升稀释的抗 CD3 CD28 包被微珠，并添加最多 50 微升培养基，使每个孔的总体积达到 200 微升。然后用箔纸盖住板子，将其置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 72 小时。为了分析 CD8 阳性 T 细胞细胞因子的产生，培养三天后，根据制造商的说明，将上清液转移到另一个 96 孔板中，并通过 ELISA 分析上清液。

为了分析 CD8 阳性 T 细胞的增殖，用 facs 缓冲液洗涤细胞板 3 次。然后将沉淀重悬于 50 微升针对增殖的 CD8 阳性 T 细胞的适当抗体混合物中，在 4 摄氏度的黑暗中重悬 20 分钟。孵育结束时，在 facs 缓冲液中洗涤细胞两次，并在 4 摄氏度下用 100 微升固定缓冲液在黑暗中固定 20 分钟。

最后，在 facs 缓冲液中再洗涤细胞两次，并将沉淀重悬于 200 微升 facs 缓冲液中。然后通过流式细胞术测量叶酸二标记的 CD8 阳性 T 细胞增殖的百分比。在幼稚和感染小鼠获得的脾淋巴细胞中，PD-1 在 LCMV 克隆 13 感染小鼠的常规 FOXP3 阴性 CD4 阳性和 FOXP3 阴性 CD8 阳性细胞中特异性上调。

LCMV 克隆 13 感染小鼠中 FOXP3 阳性 CD4 阳性调节性 T 细胞的频率是幼稚小鼠的两倍，大多数 FOXP3 阳性 CD4 阳性细胞也表现出活化的 PD-1 高表型。CD8 阳性反应 T 细胞可以成功分离，而不会受到其他免疫细胞的严重污染。调节性 T 细胞分离后，可以获得纯度超过 80% 的 CD25 阳性 CD4 阳性 T 细胞的优势群体。

抗 CD3 CD28 包被的磁珠刺激分离的调节性和反应性 T 细胞，导致 CD8 阳性反应性 T 细胞以剂量依赖性方式受到抑制。事实上，当 CD8 阳性反应者 T 细胞与慢性调节性 T 细胞以 1：1 的比例共培养时，CD8 阳性反应者 T 细胞增殖受到显著抑制。与幼稚小鼠的静息调节性 T 细胞共培养相比，当 CD8 阳性应答 T 细胞与慢性感染小鼠的活化调节性 T 细胞共培养时，CD8 阳性反应细胞产生的干扰素 γ 也受到显著抑制。

我们发现如果执行得当，这项技术可以在 80 小时内完成。当您尝试此程序时，请务必记住在分离后立即使用新鲜分离的调节性 T 细胞。在此发展之后，这项技术为医学领域的研究人员探索调节性 T 细胞在慢性炎症性疾病中的功能铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何使用调节性和反应性 T 细胞共培养系统设置体外调节性 T 细胞抑制程序有很好的了解。