全自动离心式微流控装置用于全血中超灵敏蛋白质检测
2016年4月16日
本方案展示了如何在30分钟内，利用集成于芯片实验室圆盘中的电纺纳米纤维膜，实现10 µL全血中蛋白质的飞摩尔级检测灵敏度。该方法通过提供高比表面积以及高效的混合与洗涤，显著提高了信噪比。
本实验的总体目标是利用天然纺丝纳米纤维提高ELISA的检测灵敏度。本视频展示了如何在30分钟内，仅用10微升全血样本实现对蛋白质的飞摩尔级检测灵敏度。在碟式实验室平台上，利用离心力将液体转移通过各个腔室，整个过程完全自动化。
通过整合纳米纤维，检测灵敏度可得到显著提升。然而，问题在于纳米纤维非常脆弱且难以操作。在本视频中，我们介绍一种简单的方法，将脆弱的二氧化钛纳米纤维膜固定在塑料圆盘上。
通过静电纺丝在硅胶基底上制备二氧化钛纳米纤维膜时，首先对硅胶基底进行硅烷化处理，涂覆聚二甲基硅氧烷（PDMS）并进行预固化。然后将纳米纤维膜转移至该预固化的PDMS表面，并将此复合物打孔，制成用于固定的圆形片。在反应腔室底部滴加一滴PDMS作为粘合剂，将圆形片固定于腔室底部。
然后，将PDMS放入烘箱中固化。最后，将圆盘各层组装成一个完整的ELISA装置。这种纳米纤维转移技术使我们能够利用纳米纤维的高比表面积进行生物分析。
这种离心式微流控芯片装置可实现ELISA所需全部流程的完全集成与自动化。该技术相较于其他现有方法的主要优势在于，仅需10微升全血即可检测到飞摩尔浓度的蛋白质。按照随附的实验方案所述，制备前体溶液。
然后将溶液装入静电纺丝装置中，并在最佳条件下通过静电纺丝制备纳米纤维。当聚合物纳米纤维膜制备完成后，在真空条件下于马弗炉中进行煅烧。煅烧结束后，最终得到二氧化钛纳米纤维膜。
使用 SOLIDWORKS 等 3D 设计软件制备微流控芯片布局，并将设计传输至数控铣床。操作数控铣床加工带有通道和腔室的圆盘。此时，圆盘与纳米纤维膜已准备好进行集成。
准备一个真空室、硅胶基底和氟硅烷。在真空条件下用氟硅烷对硅胶基底进行硅烷化处理，持续30分钟。通过将预聚物与固化剂按10:1的比例混合制备客体PDMS，并在650 RPM转速下旋涂到硅烷化处理后的硅胶基底上，持续60秒。
将涂覆在硅烷化晶圆上的 PDMS 在 65 摄氏度下固化 10 分钟，使其具有粘性。然后使用玻璃片等平坦物体施加适当压力，将这些纳米纤维膜转移至涂有 PDMS 的硅片上。将样品在 80 摄氏度下烘烤 1 小时，以完全固化具有粘性的 PDMS。
在附着于PDMS层的纳米纤维膜上滴加几滴乙醇，使用PunchIt打一个直径为6毫米的孔。然后将附着在PDMS上的 punched 纳米纤维膜从硅胶基底上剥离。接着，用约20微升PDMS混合物涂覆圆盘中的结合反应室，并将附着在PDMS上的纳米纤维放入反应室中。
然后，将集成有纳米纤维膜的圆盘在80摄氏度下孵育1小时。配制1%（体积比体积）的GPDES乙醇溶液。接着，用氧气等离子体处理圆盘中的纳米纤维。
在每片纳米纤维膜上加入100微升GPDES溶液，于密封容器中室温孵育两小时。孵育结束后，将圆盘在擦拭纸上轻拍以去除GPDES溶液。用乙醇洗涤，去除乙醇后，在80摄氏度下烘烤一小时。
烘烤后，用乙醇清洗并轻敲以去除残留物。重复此步骤，并用氮气流吹干。对于抗体固定化，加入稀释的捕获抗体溶液。
将圆片置于湿盒中，在37摄氏度下孵育4小时。用洗涤缓冲液洗去残留溶液。现在，使用双面胶带组装圆片。
施加适当压力，将各层组装成一个完整的圆盘。在结合反应室中加入封闭缓冲液，37°C孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤两次，将圆盘保存于40°C，待用。
将试剂、洗涤缓冲液和10微升全血加入试剂和样本室中。将碟片放入定制的可视化仪器中进行自动化免疫测定。该可视化系统包含一个与计算机连接的转子，用于自动化控制碟片运行，同时配备频闪灯和CCD相机以采集图像。
以 3,600 RPM 转速离心 60 秒，分离红细胞。将血浆与检测试剂抗体混合。将混合物转移至集成有二氧化钛纳米纤维膜的反应室中。
免疫反应完成后，将洗涤缓冲液转移至反应室，洗涤纳米纤维。然后，将化学发光底物溶液转移至结合反应室，在混匀模式下孵育一分钟。最后，将反应后的底物溶液转移至检测室。
当所有反应完成后，将圆盘转移至检测系统，并使用定制软件读取化学发光信号。圆盘操作与检测系统可集成于同一平台。通过优化电压和氟化物，获得了如本扫描电镜图像所示的均匀纳米纤维膜。
为了优化PDMS的固化时间，测量了粘附力。如果时间过短，纳米纤维膜会嵌入PDMS中；如果时间过长，则会脱落。经过优化后，纳米纤维膜能够稳定地附着在PDMS上。
该图显示了两种平台检测C反应蛋白的线性范围。利用圆盘上的纳米纤维完整性实验室技术，我们仅用30分钟和10微升血清即可实现对C反应蛋白的高灵敏度检测。目前可用的技术，例如基于96孔板的ELISA，则需要更大的样本量和更长的检测时间。
总体而言，集成纳米纤维的圆盘式ELISA检测C反应蛋白的动态范围宽达六个数量级，检测限低至6飞摩尔。由于圆盘中集成的纳米纤维提供了高比表面积，该方法的检测灵敏度显著优于传统ELISA，后者的检测限为2,000飞摩尔。观看本视频后，希望您已充分掌握如何制备离心式微流控圆盘装置、如何集成相分离纳米纤维，以及如何利用ELISA进行蛋白质检测。
该技术可用于在极少量生物样本中检测低丰度结合蛋白。
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概述
本方案展示了如何在30分钟内，利用集成于芯片实验室圆盘平台的静电纺丝纳米纤维膜，通过高效混合与洗涤，提升信噪比，实现在10 µL全血中对蛋白质的飞摩尔级检测灵敏度。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 蛋白质检测
- 纳米技术
背景
- ELISA 是一种常见的蛋白质检测方法。
- 提高检测灵敏度对于准确诊断至关重要。
- 天然纺丝纳米纤维可增强灵敏度，但较为脆弱。
- 自动化片上实验室系统可简化检测流程。
研究目的
- 提高ELISA检测的灵敏度。
- 演示在盘式实验室装置中使用纳米纤维的方法。
- 提供一种处理脆弱纳米纤维膜的方法。
使用的方法
- 将二氧化钛纳米纤维膜集成到塑料圆盘上。
- 利用离心力使液体在腔室间转移。
- 实现整个检测过程的自动化。
- 在全血样本中评估检测灵敏度。
主要结果
- 实现了飞摩尔级灵敏度的蛋白质检测。
- 验证了有效的混合与洗涤能力。
- 展示了脆弱纳米纤维在实际应用中使用的可行性。
- 验证了自动化流程用于快速分析的可行性。
结论
- 纳米纤维的整合显著提高了检测灵敏度。
- 碟式实验室技术为蛋白质检测提供了一种有前景的方法。
- 该方法可适用于多种诊断应用。
常见问题
行业应用价值
该技术解决了在小体积临床样本中进行超灵敏蛋白质检测的关键需求，能够利用极少量全血实现早期生物标志物的发现。通过将电纺纳米纤维集成到离心式微流控平台中，该方法可在30分钟内达到飞摩尔级别的检测灵敏度，显著优于传统ELISA的检测下限。这一进步通过降低低丰度蛋白质筛选中的假阴性率，支持靶点验证和先导分子识别，从而直接影响临床前风险评估和项目优先级决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够检测全血中低丰度的蛋白质靶标，提高靶标与疾病关联的可信度。
- 操作价值：将样本消耗量减少至 10 µL，使得珍贵的临床样本可在多个检测中进行多重分析。
- 预测价值：飞摩尔级别的检测限提高了信噪比，有助于在发现性研究流程中实现更可靠的生物标志物定量。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供标准化、自动化的免疫分析开发平台，具有可重复的流体处理和混合性能。
- 操作价值：消除手动移液步骤，降低变异性和提高抗体筛选实验的通量。
- 检测就绪性：支持多重分析且试剂消耗极少，有助于基于检测面板的目标验证。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在不同样本类型和体积中实现一致的蛋白质定量，连接发现阶段与临床前验证。
- 风险降低：高灵敏度降低了在疾病模型中遗漏早期药代动力学或药效动力学信号的可能性。
- 临床前适用性：适用于小动物血液体积，支持纵向研究而无需终末取样。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，通过在临床相关基质中进行定量蛋白质检测，支持以假设为导向的靶点验证。
- 发现生物学：通过在全血中检测通路特异性生物标志物，实现机制层面的风险降低，提高靶点可信度。
- 筛选：提供可自动化免疫分析性能，具备精确的液体计量与洗涤功能，对可重复的苗头化合物验证至关重要。
- 分析：生成跨越六个数量级的定量化学发光信号，实现不同条件下蛋白表达水平的准确比较。
- 转化研究：通过在微量处理的血液中检测具有临床意义的蛋白（如 CRP、cTnI），支持生物标志物的临床对齐。
- 企业级复用：基于“芯片实验室”设计，可在不同免疫分析间灵活适配平台，促进试剂与工作流程的标准化。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提高检测限和动态范围，增强靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：全流程自动化减少了人工操作时间和人为差异，提高了跨站点检测的重复性。
- 战略价值：基于有限样本获得的可靠生物标志物数据，支持做出推进或终止决策，降低后期研发失败的风险。
- 项目组合影响：通过在研发早期提供对低丰度靶标的可靠定量，支持基于风险评估的推进决策。
实施注意事项
- 成功制备需要具备静电纺丝、纳米纤维操作和微流控设计方面的专业知识。
- 依赖于获取CNC铣削、等离子体处理和真空设备，用于圆盘和纳米纤维膜的制备。
- 需要标准化PDMS涂层和固化方案，以确保不同批次间纳米纤维粘附的一致性。
- 针对其他蛋白质靶标的适配需重新优化表面化学修饰和孵育条件。
- 实际限制包括纳米纤维转移过程中对受控环境条件的需求，以及纤维膜均匀性可能存在的差异。
