通过胶体颗粒自组装工艺在PDMS微流控芯片中制备亚50 nm纳米流体结

本方案展示了一种新颖且简单的胶体二氧化硅纳米颗粒自组装技术，用于在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中的两个微通道之间构建纳米流体结。该微珠膜的孔径约为45纳米，具有阳离子选择性，可用于DNA和蛋白质样品的电动浓缩。概述：第一步，通过双重 molding 工艺制备带有纳米陷阱的PDMS器件。

将器件通过等离子体键合至玻璃基底后，将表面功能化的二氧化硅微球注入微通道中，以形成自组装胶体膜。最后，使用源表和分压器在膜两侧施加电压。利用倒置落射荧光显微镜结合CCD相机观察离子耗尽和浓度增加现象。

二氧化硅胶体颗粒悬浮液的制备：从300纳米的二氧化硅微球开始；涡旋振荡微球原液30秒；取600微升悬浮液转入离心管中，在2,600×g条件下离心1分钟。离心后，小心移除上清液。用400微升1毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬微球，得到15%的工作浓度。

涡旋振荡以获得均匀悬浮液。重复相同步骤制备500纳米二氧化硅微球。对于500纳米羧基化二氧化硅微球，称取100毫克置于15毫升Falcon管中。

然后加入9.8毫升1摩尔的氯化钠溶液以重悬磁珠。剧烈涡旋振荡管子。反复倒置管子数次，使沉积在管底的磁珠重新悬浮。

为了改变微珠表面电荷，我们制备两种聚电解质：PAH 和 PSS。0.9% PSS 溶液的制备方法是将 180 毫克 PSS 溶解于 200 毫升 1 摩尔/升氯化钠溶液中。0.4% PAH 溶液的制备方法是将 300 微升储备液稀释至 15 毫升 1 摩尔/升氯化钠溶液中。

涡旋两种溶液以确保其完全溶解。加入200 µL PAH溶液至珠子悬浮液中，以沉积带正电荷的PAH层。涡旋1分钟，然后将悬浮液在室温下于旋转仪中孵育1小时。

为了去除未结合的PAH，将悬浮液在1,801g下离心一分钟，使珠粒沉淀。移去上清液。用移液器向管中加入一到两毫升水，以破坏珠粒。

加入剩余的8 mL水，然后涡旋振荡。重复洗涤步骤四次。第五次洗涤并离心后，弃去上清液，并用9.8 mL 1摩尔氯化钠溶液重悬磁珠。

为了沉积带负电荷的PSS层，向珠子悬浮液中加入200微升PSS溶液。涡旋混匀1分钟，并在室温下于旋转仪中孵育1小时。用去离子水洗涤珠子5次，方法与PAH包被时相同。

最后一次洗涤后，弃去上清液，并用650微升含0.05% Tween 20的1毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬珠子。将珠子悬液转移至一个Eppendorf管中。对于500纳米氨基二氧化硅珠子的制备，重复相同步骤以沉积单层带负电荷的PSS。

PDMS微流控芯片的制备：首先，在硅片上以4,000 RPM的转速旋涂一层一微米厚的光刻胶，用于制备硅模板。然后采用投影光刻和反应离子刻蚀技术，制备出深度为700纳米、宽度为两微米的平面纳米通道，作为微珠的纳米捕获结构。接着，以2,000 RPM的转速旋涂第二层光刻胶，并与先前图案化的纳米捕获结构进行对准。

通过接触光刻和硅的深反应离子刻蚀在微通道中进行加工。制备释放层时，在真空罐中使用50微升三氯硅烷对硅模板进行硅烷化处理，过夜。浇铸PDMS模具时，按10:1的比例将PDMS基体与固化剂混合。

将混合物倒入硅胶母模上方。将带有PDMS的母模放入真空罐中以去除气泡，并在70°C的烘箱中加热固化，使PDMS交联。烘烤两小时后，小心地从硅胶母模上取下PDMS块。

通过等离子体处理表面，使其与空白硅片形成永久性键合。沿边缘粘贴胶带，以标记后续PDMS浇铸步骤的分界线。为形成脱模层，将PDMS模具置于真空罐中进行硅烷化处理，过夜。

将PDMS浇铸在PDMS模具上方，转移至真空罐中脱气，随后放入烘箱中固化。沿胶带标记的分界线，将固化的PDMS块从PDMS模具上剥离。

小心地切下装置，并使用1.5毫米活检打孔器在储液池中打孔。用胶带和异丙醇（IPA）清洁表面后，将PDMS装置与一块25毫米×75毫米的显微镜玻璃载片进行等离子体键合。等离子体键合后立即向微珠输送通道的第4和第6入口各注入10 µL悬浮液。

填充微珠输送通道后，除微珠输送通道的出口一和出口九外，覆盖所有储液池。室温下将装置风干三小时，使用前于 4 摄氏度保存。装置的显微图像显示胶体颗粒在上、下微珠输送通道内自组装。

扫描电镜图像显示，在样品与缓冲液通道之间，自组装的300纳米二氧化硅胶体颗粒被纳米捕获阵列捕获。用10微升1毫摩尔磷酸钠缓冲液填充缓冲液通道的3号和7号入口。用10微升10纳摩尔的DNA样品填充样品通道的5号入口。

使用倒置的移液枪头在所有出口处施加轻柔的负压，以使溶液充满通道且无气泡。向储液池2和储液池8中各加入10微升磷酸钠缓冲液，向储液池10中加入10微升DNA样品，平衡压力5分钟。DNA电动力学浓缩实验：将微流控芯片与连接至源表的分压器相连。

将PT导线插入3号、7号、5号和10号储液池中。在纳米流体结两端施加电压。首先在5号和10号储液池施加30伏电压，将3号和7号储液池接地。

约30秒后，将储液池10的电压降至25伏。电动力学预浓缩结果：微流控通道中充满DNA，初始浓度为10纳摩尔。延时显微图像显示离子耗尽区域的形成，或为纳米流体胶体结。

离子耗尽区域在10秒内形成。当电压施加到样品通道而缓冲通道接地时，会形成浓缩的DNA条带。虚线用于突出显示通道壁。

使用300纳米胶体膜在15分钟内实现了约1,700倍的浓缩倍数。DNA的平均荧光强度随时间在纳米多孔膜中逐渐增加。虚线代表10纳摩尔、17微摩尔、2微摩尔和10微摩尔DNA的信号水平。

浓缩区在300纳米二氧化硅微球、500纳米二氧化硅微球、涂覆单层PSS的500纳米氨基化二氧化硅微球，以及涂覆两层PAH和PSS的500纳米羧基化二氧化硅微球的纳米多孔膜处形成。结论：利用自组装胶体二氧化硅膜（孔径约为45纳米），我们在纳米流体结附近实现了离子浓差极化，并在15分钟内将DNA样品浓缩了1700倍。与基于硅的纳米通道相比，自组装胶体膜的主要优势在于，可在密封的微流控装置外部的独立小瓶中完成表面功能化修饰。

我们认为，通过控制微珠尺寸、缓冲溶液的离子强度或pH值，该方法有望快速构建具有可调孔径的微纳流控平台，用于研究10至100纳米范围内的离子和分子传输。