体细胞重编程的动力学测量和实时可视化

这些程序的总体目标是可视化和跟踪体细胞重编程为诱导多能干细胞或 iPSC 的进展。该方法可用于回答 iPSC 领域的关键问题，例如所使用的体细胞组织、应用的重编程技术以及与之一起使用的基质和培养基组合如何改变重编程动力学和重编程效率。这种方法的主要优点是它利用细胞表面标志物来观察体细胞向 iPSC 的转变，以便您可以使用该技术实时监测重编程事件。

转导后第 7 天，用每孔 2 毫升 DPBS 洗涤成纤维细胞，并向每个孔中加入 0.5 毫升 37 摄氏度 05% EDTA，在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。当细胞变圆后，用每孔 2 毫升 37 摄氏度成纤维细胞培养基终止反应，然后轻轻地将培养基移过每个孔的底部以去除细胞。将成纤维细胞从每个孔转移到单独的 15 ml 锥形管中，并通过离心收集它们。

将沉淀重悬于两毫升新鲜的 37 摄氏度成纤维细胞培养基中，并对每种培养条件的细胞进行计数。接下来，将 1 乘以 10 至第 5 个细胞接种到 6 孔组织培养板中预先制备的不依赖饲养层的条件孔中，并在细胞培养箱中孵育转导的细胞过夜。第二天，将每个孔中的培养基更换为适合细胞应用的培养基。

然后将板放入成像仪中，并设置软件，在接下来的 14 天内每 6 到 8 小时捕获一次每个孔的连续全孔相差和荧光图像。在重编程实验结束时，用两毫升 37 摄氏度 DMEM/F12 培养基洗涤孔一次。弃去洗涤液，并在培养箱中用每孔 1 毫升适当的一抗在新鲜 DMEM/F12 培养基中标记细胞 45 分钟。

孵育结束时，用 37 摄氏度的 DMEM/F12 培养基洗涤细胞两次。然后弃去洗涤液，并在 37 摄氏度 DMEM/F12 培养基中用 1 毫升适当的二抗标记细胞，在 37 摄氏度下放置 30 分钟。孵育结束时，用 DMEM/F12 培养基再洗涤细胞两次。

然后用 2 毫升新鲜的 37 摄氏度 DMEM/F12 培养基替换每个孔中的洗涤液。将培养皿放入成像仪中并打开成像软件。要在成像系统软件上设置扫描，请首先选择要使用的托盘位置，然后选择要扫描的培养皿类型。

接下来，选择 Whole Well Imaging、用于扫描所需孔的模式以及用于实时识别目标表面标志物的适当荧光通道。然后给需要扫描的实验贴上标签，并设置每天需要扫描的样本的时间点和间隔。要分析一组扫描的实验，请选择感兴趣的实验，然后选择 Launch New Analysis Job （启动新的分析作业）。

然后根据用于成像的通道为分析类型选择适当的处理定义，例如 PSC 期菌落计数。为分析作业命名。并选择分析的时间范围和要分析的井。

然后启动分析作业。为了测量来自单个孔的所需重编程时间点，请用 2 毫升 DPBS 洗涤目标孔一次。然后用 1 毫升预热的 37 摄氏度 05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液替换洗涤液。

在 37 摄氏度下 5 分钟后，将胰蛋白酶冲洗到孔底，将细胞解离成单细胞悬液，并将细胞转移到 15 mL 锥形管中。使用 3 mL DPBS，从孔中洗涤任何剩余的细胞，然后将它们拉入 15 mL试管中。向细胞中再加入 10 毫升 DPBS，并通过离心将其离心。

沉淀重悬于 1 毫升 DMEM/F12 培养基中进行计数。然后将细胞悬液稀释至每毫升浓度 6 个细胞的十分之一，并为适当数量的样品分装每管 1 毫升细胞。接下来，在室温下，用 1 mL DMEM/F12 培养基中的目标一抗标记细胞 30 至 45 分钟，并混合。

孵育结束时，在 37 摄氏度的 DMEM/F12 培养基中洗涤细胞两次。将沉淀重悬于一毫升 DPBS 中，并将样品转移到单独的 FACS 管中。获取重编程板的流式细胞术曲线。

然后将 FCS 文件传输到计算机并将文件导入相应的分析软件。在正向并排散点图中打开第一个控制文件，并将 y 轴设置为对数刻度。然后在活人口周围创建一个多边形门。

接下来，使用活细胞通过散点高度图创建一个侧向散射区，并设置一个矩形门以排除双峰。然后使用这些门在适当的荧光通道下分析实验样品文件，以识别各自象限中的目标群体。用仙台病毒重编程 BJ 成纤维细胞产生 SSEA4 + CD44 细胞的速率与重编程 DF1 成纤维细胞的速率不同，这表明多能干细胞样 SSEA4 + CD44 细胞百分比的早期比较可用于跟踪重编程进程。

在流式细胞术时间过程中，CD24-CD44 + 和 EpCAM 阴性 CD44 + 成纤维细胞形成双阴性群体，随后分别转化为 CD24 + CD44 和 EpCAM 阳性 CD44 多能干细胞样细胞，进一步概述了重编程进程。重新接种后重编程培养物的实时成像表明，与其汇合度的对数增加相对应，形成逐渐的集落，并证明在重编程完成时最终的多能阳性和成纤维细胞阴性标志物表达。此外，使用报告基因可以在相差下测量汇合度，与总汇合度相比，观察到的 GFP 汇合度更缓慢地增加。

事实上，在这个代表性实验中，第 19 天的 GFP 汇合度不到对应于完全重编程的总汇合度的一半。一旦掌握，该技术可用于阐明有关重编程事件的信息并跟踪人类成纤维细胞重编程的动力学。该技术还可用于观察不同的起始体细胞组织、使用的重编程技术以及用于阐明重编程事件的培养基基质组合。

观看此视频后，您应该对如何利用实时监测和细胞表面标志物表达有很好的了解，以便能够追踪人成纤维细胞向 iPSC 的重编程。