Name: 体细胞重编程的动力学测量和实时可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解利用流式细胞术和细胞表面标记物实时监测体细胞重编程为诱导多能干细胞的动力学过程。该方法可追踪成纤维细胞向iPSC的转化效率，为干细胞生物学研究提供可靠的实时分析工具。

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作者感谢 Chad MacArthur 提供的有益讨论。

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所有作者 [RHQ、JSTA、KS 和 UL] 均为赛默飞世尔科技公司的员工，该公司生产本文所用部分试剂和仪器。

本研究提供了利用流式细胞术和基于实时成像的分析方法来监测和追踪重编程过程的策略。该方案中的关键步骤包括启动重编程、根据标志物表达水平评估重编程进程以及对重编程过程进行实时监测。可采用任意选择的重编程方法，但本文重点介绍基于仙台病毒的人类成纤维细胞重编程。该方法的优势在于操作简便且重编程效率稳定且高。
为评估重编程进程，可在重编程的不同阶段分别收集细胞，并进行终点流式细胞术分析。通过对重编程培养物进行PSC阴性标志物CD44和PSC阳性标志物SSEA4的双染色，可评估重编程的进展情况6。更具体而言，通过分析在重编程各个阶段表达其中一种、两种均不表达或两种均表达的细胞分布情况，可对不同条件下的重编程动力学进行定量比较。该方法能够揭示不同重编程方法以及重编程过程中所使用的培养基和基质在动力学和效率上的差异。利用不同起始体细胞样本所得的结果证实了这些因素在重编程效率和进程中的重要性，同时也展示了该方法可用于优化重编程方案。通过流式细胞术监测重编程过程的可行性还可扩展至其他多能性与非多能性标志物组合，例如EPCAM、CD24、CD73和B2M，这些组合可与前述方法联合使...

患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）是细胞治疗和药物筛选的有力工具。它们为治疗提供了自体细胞来源。此外，这类细胞涵盖了极为广泛的遗传背景，有助于深入研究 体外 分析目前胚胎干细胞（ESC）系所允许范围之外的遗传性疾病。近期的技术进步已催生出多种诱导多能干细胞（iPSCs）的生成方法，包括利用仙台病毒、附加体型质粒或mRNA进行重编程 1,2值得注意的是，不同的重编程方法在效率和安全性方面存在差异，并且在其他方面也可能有所不同，从而影响其在各种应用中的适用性。随着多种重编程技术的出现，开发评估重编程过程的方法变得尤为重要。目前大多数现有方法依赖于对细胞形态的定性观察，或使用干细胞特异性染料和抗体进行染色检测。一种近期开发的方法利用了慢病毒荧光报告系统，该系统对多能干细胞（PSC）特异性的miRNA或分化细胞特异性的mRNA具有敏感性。 3此类监测方法有助于针对不同情况选择和优化重编程技术。例如，CDy1 已被用作早期诱导多能干细胞（iPSCs）的荧光探针，以筛选重编程调节剂 4观察和比较不同重编程实验的能力对于深入理解重编程过程本身也至关重要。例如，目前已知某些体细胞类型的重编程难度低于其他类型。 5，并且细胞在重编程过程中会经历中间状态 6-8遗憾的是，重编程过程的潜在机制尚未被完全阐明，因此不同重编程方法之间的确切差异仍有待明确。因此，用于监测、评估和比较重编程事件的方法在干细胞领域仍然至关重要。
本方案中描述的方法可用于监测和评估重编程过程，并说明了如何利用这些技术来比较不同的重编程试剂组合。第一种方法涉及使用针对多能干细胞（PSC）阳性与阴性标志物的抗体组合进行流式细胞术分析。第二种方法结合了实时成像技术，通过测量总汇合度（细胞覆盖的表面区域百分比）以及标志物信号的汇合度（荧光信号覆盖的表面区域百分比）来进行分析。

<table><tbody><tr><td>DMEM，高糖，含GlutaMAX补充剂，含丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，适用于胚胎干细胞，美国来源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>小鼠（ICR）失活胚胎成纤维细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>贴壁因子蛋白（1倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶，粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select酶（1倍浓度），无酚红&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free，适用于hESC，低生长因子基底膜基质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（氨基酸1-155），重组人源蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白V组分（7.5%溶液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai重编程试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai重编程试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II全自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess细胞计数板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC人包皮成纤维细胞，新生</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1成人人皮肤成纤维细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG细胞 变异型人胚胎干细胞 hOct4-GFP报告细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4抗体，Alexa Fluor 647标记（MC813-70）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4抗体，Alexa Fluor 488标记（eBioMC-813-70 (MC-813-70)）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4抗体（MC813-70）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60抗体（克隆A）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆IM7），PE-Cy5标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488标记试剂盒，用于活细胞成像</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44大鼠抗人/小鼠单克隆抗体（克隆IM7）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700（已停产）</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A-11029</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A-11007</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶活细胞染色试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488标记试剂盒，用于活细胞成像</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24小鼠抗人单克隆抗体（克隆SN3），FITC标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>β-2微球蛋白抗体，FITC标记（B2M-01）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326抗体，FITC标记（VU-1D9）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E抗体（7G2）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Red碱性磷酸酶（AP）底物试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo数据分析软件</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune声学聚焦流式细胞仪，蓝/红激光</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>使用Attune NXT&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e细胞分选仪（488/561 nm）</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm带细胞筛盖离心管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml高透明度圆顶密封螺旋盖离心管</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75培养瓶</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175培养瓶</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6孔板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 滚动培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>无粘性、无RNase的微量离心管，1.5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer样品混合器</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

体细胞重编程的动力学测量与实时可视化

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

体细胞重编程技术已实现将来自不同遗传背景和疾病表型的成体细胞转化为诱导性多能干细胞（iPSC）。近期进展已鉴定出更高效且安全的重编程因子导入方法。然而，目前仍缺乏用于监测和追踪重编程进程的有效工具。现有的重编程监测方法主要依赖于对细胞形态的定性观察，或使用干细胞特异性染料和抗体进行染色检测。开发能够解析iPSC生成过程动态变化的工具，有助于更深入理解在不同条件下、源自多种细胞来源的重编程过程。
本研究介绍了利用流式细胞术进行重编程进程动力学检测以及通过成像进行实时监测的关键方法。为了测量重编程的动力学过程，在不同时间点使用针对多能干细胞阳性与阴性标志物的抗体进行流式分析。实时可视化与流式分析相结合，能够对重编程在不同阶段的过程进行定量研究，并实现对不同系统和方法之间更为准确的比较。采用基于图像的实时分析方法，对成纤维细胞在无饲养层培养体系中重编程过程进行连续监测。通过活细胞碱性磷酸酶染料或针对SSEA4及TRA-1-60抗体染色后，在相差或荧光通道中根据融合度来测定克隆形成动力学。结果表明，融合度的测量可提供用于监测重编程进程的半定量指标。

使用流式细胞术监测重编程动力学
CD44 是成纤维细胞的标志物，而 SSEA4 是多能干细胞（PSC）的标志物 6,10. 根据这一表达模式，对BJ成纤维细胞进行流式细胞术分析显示SSEA4- CD44+ 群体，该群体可与未染色样本结合用于创建象限门。在利用仙台病毒对DF1成纤维细胞进行重编程的过程中，CD44逐渐丢失，而SSEA4则缓慢表达。在仙台病毒感染后第3天，已出现大量SSEA4阳性细胞群体。- CD44+ 细胞和一小部分SSEA4阳性细胞+ CD44+ 细胞在第7天变得更加明显（图1。在第13天，双阳性群体向SSEA4转变+ CD44- 状态。到第17天，培养物中已有很大比例的细胞为SSEA4阳性...

本研究中所述方案介绍了通过流式细胞术分析，对多能干细胞阳性与阴性标志物进行动力学检测，从而实时监测重编程进程的方法。该方案还包括基于成像技术对诱导性多能干细胞（iPSC）生成过程中的细胞形态、标志物或报告基因表达进行评估。

体细胞重编程已实现将来自不同遗传背景和疾病的成体细胞转化为诱导性多能干细胞（iPSC）...

这些实验方案的总体目标是可视化并追踪体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSC）的进程。该方法可用于解答iPSC领域中的关键科学问题，例如：所使用的体组织类型、应用的重编程技术，以及所采用的基质与培养基组合，如何影响重编程的动力学特征和重编程效率。该方法的主要优势在于利用细胞表面标志物来观察体细胞向iPSC转变的过程，从而能够实时监测重编程事件。转导后第七天，每孔加入两毫升 DPBS 洗涤成纤维细胞，并每孔加入 0.5 毫升 37 摄氏度的 0.5% EDTA，在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。当细胞变圆后，每孔加入两毫升 37 摄氏度的成纤维细胞培养基终止反应，并轻轻吹打每孔底部使细胞脱落。将每孔中的成纤维细胞转移至各自的 15 毫升锥形管中，通过离心收集细胞。将沉淀重悬于2毫升新鲜的37摄氏度成纤维细胞培养基中，并对每种培养条件下的细胞进行计数。随后，将1×10⁵个细胞接种至六孔组织培养板中预先准备好的无饲养层条件培养孔中，在细胞培养孵育箱中过夜培养。次日，用适用于细胞应用的适当培养基替换每个孔中的培养基。然后将培养板放入成像仪中，设置软件在接下来的14天内，每隔6至8小时对每个孔进行一次全孔程差显微和荧光图像采集。重编程实验结束时，用2毫升37摄氏度的DMEM/F12培养基将各孔洗涤一次。弃去洗涤液，随后在培养箱中，于37摄氏度条件下，每孔加入1毫升新鲜DMEM/F12培养基中含有相应一抗的溶液，对细胞进行45分钟的标记。孵育结束后，用37摄氏度的DMEM/F12培养基将细胞洗涤两次。弃去洗涤液后，在37摄氏度条件下，加入1毫升适当稀释的二抗溶于37摄氏度DMEM/F12培养基中，标记细胞30分钟。孵育结束后，再用DMEM/F12培养基洗涤细胞两次。然后将每孔中的洗涤液更换为两毫升新鲜的37摄氏度DMEM/F12培养基。将培养皿放入成像仪中，并打开成像软件。在成像系统软件中设置扫描时，首先选择要使用的托盘位置，并选择要扫描的培养皿类型。接下来，选择全孔成像模式、用于扫描目标孔板的扫描模式，以及适用于实时识别目标表面标志物的荧光通道。然后为待扫描的实验进行标记，并设置每天对样品进行扫描的时间点和时间间隔。要分析一组已扫描的实验，请选择感兴趣的实验，然后选择“启动新分析任务”。然后根据成像所用通道选择相应分析类型的适当处理定义，例如 PSC 相位克隆计数。为分析任务命名，并选择分析的时间范围以及待分析的孔。然后启动分析任务。为了从单个孔中测量所需的重编程时间点，用两毫升 DPBS 将目标孔洗涤一次。随后，弃去洗涤液，加入一毫升预热至 37 摄氏度的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。在37摄氏度孵育5分钟后，将胰蛋白酶吹打至孔底以使细胞解离成单细胞悬液，并将细胞转移至15毫升锥形管中。用3毫升DPBS洗涤孔中残留的细胞，并将其收集至15毫升管中。向细胞中再加入10毫升DPBS，通过离心沉淀细胞。将沉淀重悬于1毫升DMEM/F12培养基中用于计数。然后将细胞悬液稀释至每毫升6个细胞浓度的十分之一，并按所需样本数量每管分装1毫升细胞。接着，在室温下加入适量的一抗，于1毫升DMEM/F12培养基中避光孵育30至45分钟，期间轻轻混匀。孵育结束后，用37摄氏度的DMEM/F12培养基洗涤细胞两次。将细胞沉淀重悬于1毫升DPBS中，并将样品分别转移至各自的FACS管中。获取重编程培养板的流式细胞术图谱。然后将FCS文件转移至计算机，并将文件导入相应的分析软件中。在前向散射光与侧向散射光散点图中打开第一个对照文件，将y轴设置为对数刻度。随后在活细胞群体周围创建一个多边形门。接下来，利用活细胞绘制侧向散射面积对散射高度的散点图，并设置矩形门控以排除双联体细胞。然后应用这些门控，在相应的荧光通道中分析实验样本文件，以在各自的象限中鉴定目标细胞群体。使用仙台病毒重编程BJ成纤维细胞生成SSEA4+CD44-细胞的效率与重编程DF1成纤维细胞不同，表明通过早期比较多能干细胞样SSEA4+CD44-细胞所占百分比，可用于追踪重编程进程。在流式细胞术时间序列分析中，CD24-CD44+且EpCAM阴性的CD44+成纤维细胞会形成双阴性群体，随后分别转变为CD24+CD44-以及EpCAM阳性的CD44-多能干细胞样细胞，进一步描绘出重编程的进程。对重新接种后的重编程培养物进行实时成像，显示逐渐形成的克隆群，其汇合度呈对数增长，并在重编程完成时表现出最终的多能性标志物阳性及成纤维细胞标志物阴性表达。此外，使用报告基因可在相差显微镜下测量汇合度，观察到GFP信号的汇合度增长较总汇合度更为缓慢。事实上，在本项代表性实验中，第19天的GFP汇合度不到总汇合度的一半，对应于不完全的重编程。一旦掌握该技术，即可用于阐明重编程事件的相关信息，并追踪人类成纤维细胞重编程的动力学过程。该技术还可用于研究不同的起始体细胞组织、所采用的重编程技术以及培养基与基质组合，以揭示重编程过程中的关键事件。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用实时监测和细胞表面标志物表达来追踪人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的过程。

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我们介绍了构建闭环式共适应界面的实验方案与分析方法，该界面可实时流式传输、参数化、分析并调节人体及心脏信号。该系统将来自个体周围神经系统和中枢神经系统的信号与外部感觉输入相连接，以帮助追踪生物物理变化。...

使用闭环接口实时代理控制重新参数化的外周信号

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。...

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。...

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

了解利用流式细胞术和细胞表面标记物实时监测体细胞重编程为诱导多能干细胞的动力学过程。该方法可追踪成纤维细胞向iPSC的转化效率，为干细胞生物学研究提供可靠的实时分析工具。

体细胞重编程的动力学测量与实时可视化

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