Name: RNA结合蛋白的检测通过体外 RNA下拉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习RNA下拉技术检测RNA结合蛋白的方法，利用雄激素受体3'非翻译区片段从原代棕色脂肪细胞裂解液中捕获特异性互作蛋白HuR。该方法操作简便，可在24小时内完成实验，为研究RNA调控机制提供可靠工具。

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本工作由新加坡国家研究基金会资助（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC/CBRG/0070/2014）资助。

注意：本研究中的目标 RNA 是 AR 3'非翻译区的一个片段。
1. 生物素标记RNA的制备
<ol>
	<li>通过PCR扩增T7-AR-oligo以获得RNA，随后 体外 使用商业试剂盒并按照制造商说明进行转录11. 
	注意：PCR 引物列于 表 4T7-AR-F 和 T7-AR-R</li>
	<li>作为非特异性结合对照，从 psiCHECK-2 质粒通过 PCR 扩增萤火虫荧光素酶（FL）DNA 的部分序列，随后 体外 转录 
	注意：PCR 引物列于 表4：hluc(+)-T7-探针-F 和 hluc(+)-探针-R。 表4PCR扩增所用的模板和引物序列。</li>
	<li>对于一个50 µl的PCR反应，混合以下组分：50 ng DNA（寡核苷酸或质粒）、4 µl dNTPs（每种dNTP浓度为2.5 mM）、5 µl 10×反应缓冲液、1 µl DNA聚合酶（2.5 U/µl）、2 µl 10 µM正向引物、2 µl 10 µM反向引物，以及无核酸酶水。
	<ol>
		<li>使用以下程序在热循环仪中进行PCR扩增。第一步：95 °C预变性2分钟，1个循环；第二步：95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒（AR）或60秒（FL），共35个循环；第三步：72 °C延伸10分钟，1个循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用体外转录法合成生物素标记的RNA 体外 按照制造商说明使用转录试剂盒11在本实验中，使用PCR产物作为RNA合成的模板。对于20 µl反应体系 体外 转录反应中，混合200 ng PCR扩增的DNA、每种单个NTP各2 µl、1 µl 10 mM生物素标记的CTP、2 µl 10×反应缓冲液和2 µl T7 RNA聚合酶。37 °C孵育4小时。</li>
	<li>随后 体外 转录后，在37 °C下用1 µl 2 U/µl DNase处理反应混合物15分钟，以降解模板DNA。最后，将生物素标记的RNA稀释至终体积60 µl，用于后续纯化。</li>
	<li>使用纯化柱纯化生物素标记的RNA，以去除盐分和未掺入的核苷酸，具体操作遵循制造商说明书12测定RNA浓度，并于-80 °C保存，用于后续下拉实验。</li>
	<li>为确保RNA-蛋白质相互作用中目标RNA具有正确的二级结构，将50 µl生物素标记的RNA（50 pM）于90 °C加热2分钟，冰上冷却2分钟，然后加入50 µl 2x RNA结构缓冲液（表3），并在室温下孵育30分钟，使RNA折叠13,14.</li>
</ol>
2. RNA 偶联磁珠的制备
注意：使用磁力架分离磁珠和上清液。
<ol>
	<li>根据制造商说明，通过短暂涡旋使链霉亲和素包被的磁珠在原装小瓶中重悬。取150 µl重悬磁珠转移至1.5 ml离心管中。将离心管置于磁力架上1分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。 
	注意：在RNA pull-down实验中，从原装小瓶分装重悬磁珠时，若后续进行Western blot检测，使用50 µl磁珠；若后续进行质谱分析（MS），则使用200 µl磁珠。</li>
	<li>用1 ml制造商推荐的1× W&amp;#38;B（结合与洗涤）缓冲液（表3）重悬磁珠沉淀，于旋转仪中室温旋转5分钟，洗涤磁珠一次。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>为灭活磁珠上的RNase，使用400 µl缓冲液A重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次。缓冲液A为含0.1 M NaOH和0.05 M NaCl的碱性溶液（表3）。每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>为去除磁珠上的NaOH，使用400 µl缓冲液B（表3）重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>用300 µl 2× W&amp;#38;B缓冲液重悬磁珠沉淀，将磁珠均分为三份，分别转移至三个1.5 ml离心管中（每管100 µl磁珠）。向各含磁珠的离心管中分别加入100 µl无RNase水、100 µl生物素标记的FL RNA和100 µl生物素标记的AR 3'UTR RNA。</li>
	<li>将各管磁珠混合物在旋转仪中室温孵育1小时。将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>用400 µl 1× W&amp;#38;B缓冲液重悬各管磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转5分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液。用50 µl核分离缓冲液（表3）重悬各管磁珠沉淀。</li>
</ol>
3. 前脂肪细胞的分离与脂肪生成诱导
<ol>
	<li>如先前出版物所述5从肩胛间棕色脂肪组织中分离前脂肪细胞（C57BL6野生型小鼠，3周龄）。</li>
	<li>培养并 体外 诱导前脂肪细胞分化5细胞在开始分化后4-5天即可用于后续实验应用。</li>
</ol>
4. 原代脂肪细胞细胞裂解液的制备
注意：细胞裂解液制备的所有步骤均需在冰上进行，所有缓冲液需预先在冰上预冷。将玻璃匀浆器（Dounce 玻璃匀浆器）提前在冰上预冷。
<ol>
	<li>在15 cm培养皿中培养并诱导前脂肪细胞分化5 （参见第3.2节）。每皿细胞可满足一次RNA下拉实验所需。在分化第4天或第5天，弃去细胞培养基，用1×PBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>收集细胞时，向细胞中加入10–15 ml 1×PBS，刮取细胞并收集至50 ml离心管中，于室温下以200 × g离心5分钟收集细胞沉淀。使用1 ml移液器弃去上清液。</li>
	<li>用2 ml低渗缓冲液（表3）重悬细胞沉淀，冰上孵育15分钟。将细胞转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切20次。</li>
	<li>于4 °C下以3,300 × g离心15分钟收集细胞核沉淀。将细胞核沉淀置于冰上备用（参见第4.6节）。将上清液转移至1.5 ml离心管中，加入3 M KCl使终浓度达到150 mM，然后于4 °C下以20,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>离心后，使用1 ml移液器小心去除顶部的脂层，收集上清液作为细胞质裂解物。</li>
	<li>用1 ml核分离缓冲液重悬细胞核沉淀（参见第4.4节）。用1 ml移液器将细胞核转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切100次。于4 °C下以20,000 × g离心15分钟去除核碎片，收集上清液作为核裂解物。</li>
	<li>可将核裂解物与细胞质裂解物混合，或分别用于后续的下拉实验。在本示范实验中，这两种裂解物按1:1体积比混合。</li>
	<li>向此未分馏的细胞裂解物中加入RNase抑制剂，使其终浓度为0.5 U/µl。预留100 µl细胞裂解物作为输入对照用于Western blotting15。</li>
</ol>
5. RBP 的结合与洗脱
<ol>
	<li>将细胞裂解液均分为三等份（每份1 ml细胞裂解液置于1.5 ml离心管中），分别与空白 beads、FL RNA 偶联 beads 和 AR 3'UTR RNA 偶联 beads（参见第2.8节）在4 °C下旋转孵育3小时。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上1分钟。使用1 ml移液器收集上清液，随后从上清液中提取RNA以确认RNA完整性。按照制造商说明书，使用酸性硫氰酸胍-苯酚溶液提取RNA。表2）。通过分析核糖体RNA的28S和18S亚基评估RNA完整性。将珠粒沉淀物置于冰上保存。</li>
	<li>用含有40 U RNase抑制剂和0.25% IGEPAL的1 ml核分离缓冲液重悬磁珠沉淀，洗涤6次，每次重悬后将离心管在旋转仪上室温旋转2分钟。使用磁力架分离磁珠与上清液，弃去全部上清液。将磁珠沉淀置于冰上保存。</li>
	<li>使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于蛋白质印迹分析。首先，将每份磁珠沉淀重悬于75 µl核分离缓冲液中；然后加入25 µl 4x蛋白质印迹上样缓冲液（含SDS），使总体积达到100 µl。最后，将磁珠在此100 µl溶液中于95 °C煮沸5分钟。 
	注意：使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于质谱分析。步骤1：将每份磁珠沉淀重悬于100 µl洗脱缓冲液中表3）；步骤2：室温下旋转孵育珠子样品2-3小时；步骤3：离心并收集含蛋白质的上清液；步骤4：在提交质谱分析前将蛋白质溶液浓缩至20-30 µl。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将每份 100 µl 珠子样品以 12,000 × g 离心 30 秒，收集上清液。取 15 µl 上清液用于蛋白质印迹分析（见第 6.1 和 6.2 节）。用稀释的 HuR 小鼠单克隆抗体（1:1,000 稀释）对所得膜进行杂交，孵育过夜。</li>
</ol>
6. 用于验证 RBP 的蛋白质印迹法
<ol>
	<li>使用标准技术通过SDS-PAGE分离RNA结合蛋白。</li>
	<li>使用标准技术进行蛋白质印迹实验，检测与目标RNA相关的RNA结合蛋白。 
	注意：在此演示实验中，使用了HuR小鼠单克隆抗体用于HuR蛋白的免疫检测。</li>
	<li>将所得膜置于含稀释后HuR抗体（1:1,000稀释度）的5% w/v脱脂奶粉、1×TBS溶液中孵育， 0.1% Tween-20，4℃ 在室温下轻柔振荡孵育过夜。用1×TBST缓冲液洗涤膜三次。将膜与二抗（山羊抗小鼠IgG-HRP）在室温下孵育1小时。洗涤膜。显影并记录信号。</li>
</ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

长链非编码RNA（lncRNA）和RNA结合蛋白（RBP）在健康与疾病中具有重要作用，但这些分子的分子机制尚不明确。鉴定与lncRNA分子相互作用的蛋白质是阐明其调控机制的关键步骤。RNA下拉实验系统通过在溶液中捕获相互作用复合物来富集RBP，从而利用结合在链霉亲和素磁珠上的生物素化RNA探针从细胞裂解液中选择性地提取目标蛋白。其他一些方法如ChIRP、CHART和RAP也可实现相同目的，但相比RNA下拉技术，这些方法的建立更为复杂16,17,18。
RNA 沉淀法的主要优势在于其操作相对简单且易于实施。CHIRP 和 RAP 均包含交联步骤，可保留天然存在的 RNA-蛋白质复合物，并需要设计覆盖整个目标 RNA 的反向互补寡核苷酸探针组（RAP 中为 90 个核苷酸长度，ChIRP 中为 20 个核苷酸长度）16,17,18RNA 折叠是 RNA 拉下实验中的关键步骤。该方案的主要局限性在于目标 RNA 是体外合成的 体外 且可能无法正确折叠成天然结构，从而无法与其RNA结合蛋白（RBP）正常结合。错误折叠的非天然RN...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA结合蛋白（RBPs）是一类能够与细胞内的双链或单链RNA结合并参与形成RNA-蛋白质复合物的蛋白质。RBPs可结合多种RNA分子，包括mRNA和长链非编码RNA（lncRNA），并在转录后水平发挥调控作用。目前，RBPs和lncRNA正被逐步揭示为脂肪组织发育与功能中的新型调控因子1,2,3。为了理解RBPs和lncRNA介导的细胞通路调控机制，通常需要检测特定RNA分子与一个或多个RBPs之间的相互作用，有时还需鉴定某一RNA转录本所结合的全部蛋白质伙伴。然而，由于脂肪细胞中含有大量脂质，此类实验往往具有挑战性。本文所述的RNA下拉（pull-down）实验方案可用于从原代培养的脂肪细胞裂解液中富集特定RNA的蛋白质结合伙伴4,5。
本方案的原理总结如下。一种RNA诱饵 体外 从DNA模板转录而来，经生物素标记后与链霉亲和素包被的磁珠偶联4将RNA诱饵与细胞裂解液共同孵育，以形成RNA-蛋白质复合物，随后在磁力架上进行下拉。具体而言，下述RNA下拉实验方案采用来自AR 3'非翻译区（3'UTR）的RNA片段作为诱饵，用于富集HuR蛋白——一种广泛表达的RNA结合蛋白，可结合mRNA的3'UTR区域。6,7，来自原代培养的脂肪细胞裂解液。为检测该实验的结合特异性，设置无关RNA以及链霉亲和素磁珠阴性对照。本方案可与蛋白质印迹（western blotting）或质谱分析（MS）联用，分别用于验证特定RNA结合蛋白（RBP）的捕获，或鉴定所捕获RBP的完整谱系8.
研究 RNA-蛋白质相互作用有多种技术可供选择。为了揭示特定 RNA 结合蛋白（RBP）所结合的 RNA，可采用 RIP（RNA 免疫沉淀）和 CLIP（紫外线交联与免疫沉淀）。相反，若要鉴定特定 RNA 的蛋白互作伙伴，则可应用 RNA pull-down、ChIRP（通过 RNA 纯化进行染色质分离）、CHART（RNA 靶标捕获杂交分析）和 RAP（RNA 反义纯化）。与后几种方法相比，RNA pull-down 技术的实验建立更为简便。该技术可用于在体外（in vitro）和体内（in vivo）捕获蛋白质。in vivo 的 RNA pull-down 方法在技术上比其 in vitro 版本更具挑战性，它通过在细胞内进行交联以保留 RNA-蛋白质相互作用，从细胞中捕获带有适配体标签的目标 RNA，进而检测与其结合的 RNA 结合蛋白（RBP）。RNA pull-down 可用于富集丰度较低的 RBP，并分离和鉴定在调控细胞功能中具有多种作用的 RNA-蛋白质复合物9,10。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;本研究使用的主要材料。&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript 试剂盒</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway 离心柱&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) 小鼠单克隆抗体 (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure 分子生物学级水（无核酸酶）&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本研究使用的主要设备。&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 梯度PCR仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO 多管旋转混合仪 Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白质凝胶电泳及转膜装置&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的rna下拉实验

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA结合蛋白（RBPs）在脂肪组织的发育和功能中正逐渐被视为一种重要的调控层次。RBPs通过影响靶标mRNA的稳定性和翻译效率，在转录后水平上对基因表达起关键调控作用。RNA pull-down技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这对于阐明RBPs以及长链非编码RNA（lncRNAs）功能的分子机制至关重要。然而，脂肪细胞中富含脂质，为该实验的实施带来了技术上的挑战。本文提供了一种针对原代脂肪细胞培养体系优化的详细RNA pull-down实验方案。以雄激素受体（AR）3'非翻译区（3'UTR）中包含腺苷酸-尿苷酸富集元件的一段RNA片段为例，展示了如何从脂肪细胞裂解液中富集其RBP结合蛋白HuR。本方法可广泛应用于检测RBPs与非编码RNA之间，以及RBPs与编码RNA之间的相互作用。

在本演示实验中，使用AR RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。同时设置与HuR蛋白无关的全长RNA（FL RNA）诱饵以及未偶联的空白链霉亲和素磁珠等分试样作为阴性对照。RNA-蛋白质相互作用可能发生在细胞核或细胞质中，本沉淀实验方案可适用于全细胞裂解液或分馏后的（核或胞质）细胞裂解液。通过蛋白质印迹分析显示，15 µl未分馏细胞裂解液样品（见第4.8节）作为无磁珠输入对照呈阳性结果，表明利用单克隆抗体可在小鼠原代培养脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。AR RNA洗脱组分也呈阳性结果，表明在RNA沉淀实验中，使用AR RNA偶联磁珠可从脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。而FL RNA洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明FL RNA片段与HuR蛋白之间以及空白磁珠与HuR蛋白之间的非特异性相互作用在本RNA沉淀方法中无法被检测到。这两个阴性对照的结果也表明，本研究所述的RNA沉淀实验方案成功检测到了AR RNA片段与HuR蛋白之间的特异性相互作用。
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本文优化了一种RNA下拉实验方案，用于检测RNA结合蛋白（RBPs）与非编码RNA以及编码RNA之间的相互作用。以雄激素受体（AR）的RNA片段为例，展示了如何从原代棕色脂肪细胞的裂解液中富集与其结合的RNA结合蛋白。

RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

RNA结合蛋白（RBPs）作为脂肪组织发育与功能调控层面的重要性日益凸显。RBPs在基因表达中发挥关键作用……

本实验的总体目标是从棕色脂肪组织中分离特定RNA转录本的RNA结合蛋白。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如，长寿命编码RNA的调控机制是什么，以及与其相关的RNA结合蛋白有哪些。该策略的主要优势在于操作简便。本实验所用的 RNA 为抗原受体 3' 非翻译区（3-Prime Untranslated Region）的一个片段，下文简称为 AR 3' UTR。首先，以 T7 AR 寡核苷酸和 psiCHECK-2 质粒中的萤火虫荧光素酶部分序列为模板进行扩增。所用引物及扩增参数详见随附文档。扩增后，按照生产商说明书，使用体外转录试剂盒将PCR产物作为模板合成生物素标记的RNA。然后在37摄氏度孵育混合物4小时。体外转录后，向反应体系中加入1 µL DNase，在37摄氏度孵育15分钟，以降解模板DNA。然后，加水将总体积调至60微升。将生物素标记的RNA上样到纯化柱中，以去除盐分和未掺入的核苷酸。随后，测定RNA浓度，并将RNase在-80摄氏度保存，用于后续的pull-down实验。在检测当天，将冻存的生物素标记RNA置于冰上解冻。随后，为确保目标RNA具有正确的二级结构，将其50微升在90摄氏度加热2分钟，然后在冰上冷却2分钟。接着，加入 50 µL 的 2× RNA 结构缓冲液，使 RNA 在室温下折叠 30 分钟。随后，通过短暂涡旋在原管中重悬链霉亲和素包被的磁珠。然后，将 150 µL 重悬的磁珠转移至一个 1.5 mL 离心管中。将试管置于磁力架上静置1分钟，使磁珠与上清液分离。用移液器吸除并弃去上清液，保留磁珠沉淀。用1毫升生产商推荐的1×结合与洗涤缓冲液重悬磁珠沉淀，混匀，然后将离心管置于旋转仪上，室温孵育5分钟，洗涤一次。随后用缓冲液A和缓冲液B各洗涤两次。孵育结束后，弃去上清液，保留磁珠沉淀。接下来，将磁珠沉淀重悬于 300 微升的 2 倍洗涤与结合缓冲液中。将磁珠均分为三份，每份 100 微升，分别加入三个 1.5 毫升离心管中。每管中加入 100 微升无 RNase 水、100 微升生物素标记的萤火虫荧光素酶 RNA 以及 100 微升生物素标记的 AR 3'非翻译区 RNA。将每种磁珠混合物在室温下旋转孵育一小时。然后将离心管置于磁力架上一分钟，移除并弃去上清液。保留珠粒沉淀。接下来，用400 µL的1×洗涤与结合缓冲液将珠粒沉淀重悬，重复洗涤两次，每次重悬后于室温下在旋转仪上孵育5分钟。将离心管置于磁力架上静置1分钟。然后，移除并弃去所有上清液。将每份珠粒沉淀重悬于 50 µL 核分离缓冲液中。为准备后续步骤，请确保所有缓冲液以及 Dounce 玻璃匀浆器均已预冷并置于冰上。细胞裂解液的制备应在冰上进行。对于每项待进行的RNA下拉实验，准备一皿来自三周龄C57 Black Six野生型小鼠的分化前脂肪细胞。四到五天后，为收集细

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生物学

RNA结合蛋白的检测通过<em&gt;体外</em在脂肪细胞培养&gt; RNA下拉

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一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

学习RNA下拉技术检测RNA结合蛋白的方法，利用雄激素受体3'非翻译区片段从原代棕色脂肪细胞裂解液中捕获特异性互作蛋白HuR。该方法操作简便，可在24小时内完成实验，为研究RNA调控机制提供可靠工具。

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