Name: RNA结合蛋白的检测通过体外 RNA下拉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习RNA下拉技术检测RNA结合蛋白的方法，利用雄激素受体3'非翻译区片段从原代棕色脂肪细胞裂解液中捕获特异性互作蛋白HuR。该方法操作简便，可在24小时内完成实验，为研究RNA调控机制提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由新加坡国家研究基金会资助（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC/CBRG/0070/2014）资助。

注意：本研究中的目标 RNA 是 AR 3'非翻译区的一个片段。
1. 生物素标记RNA的制备
<ol>
	<li>通过PCR扩增T7-AR-oligo以获得RNA，随后 体外 使用商业试剂盒并按照制造商说明进行转录11. 
	注意：PCR 引物列于 表 4T7-AR-F 和 T7-AR-R</li>
	<li>作为非特异性结合对照，从 psiCHECK-2 质粒通过 PCR 扩增萤火虫荧光素酶（FL）DNA 的部分序列，随后 体外 转录 
	注意：PCR 引物列于 表4：hluc(+)-T7-探针-F 和 hluc(+)-探针-R。 表4PCR扩增所用的模板和引物序列。</li>
	<li>对于一个50 µl的PCR反应，混合以下组分：50 ng DNA（寡核苷酸或质粒）、4 µl dNTPs（每种dNTP浓度为2.5 mM）、5 µl 10×反应缓冲液、1 µl DNA聚合酶（2.5 U/µl）、2 µl 10 µM正向引物、2 µl 10 µM反向引物，以及无核酸酶水。
	<ol>
		<li>使用以下程序在热循环仪中进行PCR扩增。第一步：95 °C预变性2分钟，1个循环；第二步：95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒（AR）或60秒（FL），共35个循环；第三步：72 °C延伸10分钟，1个循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用体外转录法合成生物素标记的RNA 体外 按照制造商说明使用转录试剂盒11在本实验中，使用PCR产物作为RNA合成的模板。对于20 µl反应体系 体外 转录反应中，混合200 ng PCR扩增的DNA、每种单个NTP各2 µl、1 µl 10 mM生物素标记的CTP、2 µl 10×反应缓冲液和2 µl T7 RNA聚合酶。37 °C孵育4小时。</li>
	<li>随后 体外 转录后，在37 °C下用1 µl 2 U/µl DNase处理反应混合物15分钟，以降解模板DNA。最后，将生物素标记的RNA稀释至终体积60 µl，用于后续纯化。</li>
	<li>使用纯化柱纯化生物素标记的RNA，以去除盐分和未掺入的核苷酸，具体操作遵循制造商说明书12测定RNA浓度，并于-80 °C保存，用于后续下拉实验。</li>
	<li>为确保RNA-蛋白质相互作用中目标RNA具有正确的二级结构，将50 µl生物素标记的RNA（50 pM）于90 °C加热2分钟，冰上冷却2分钟，然后加入50 µl 2x RNA结构缓冲液（表3），并在室温下孵育30分钟，使RNA折叠13,14.</li>
</ol>
2. RNA 偶联磁珠的制备
注意：使用磁力架分离磁珠和上清液。
<ol>
	<li>根据制造商说明，通过短暂涡旋使链霉亲和素包被的磁珠在原装小瓶中重悬。取150 µl重悬磁珠转移至1.5 ml离心管中。将离心管置于磁力架上1分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。 
	注意：在RNA pull-down实验中，从原装小瓶分装重悬磁珠时，若后续进行Western blot检测，使用50 µl磁珠；若后续进行质谱分析（MS），则使用200 µl磁珠。</li>
	<li>用1 ml制造商推荐的1× W&amp;#38;B（结合与洗涤）缓冲液（表3）重悬磁珠沉淀，于旋转仪中室温旋转5分钟，洗涤磁珠一次。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>为灭活磁珠上的RNase，使用400 µl缓冲液A重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次。缓冲液A为含0.1 M NaOH和0.05 M NaCl的碱性溶液（表3）。每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>为去除磁珠上的NaOH，使用400 µl缓冲液B（表3）重悬磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转2分钟。弃去上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>用300 µl 2× W&amp;#38;B缓冲液重悬磁珠沉淀，将磁珠均分为三份，分别转移至三个1.5 ml离心管中（每管100 µl磁珠）。向各含磁珠的离心管中分别加入100 µl无RNase水、100 µl生物素标记的FL RNA和100 µl生物素标记的AR 3'UTR RNA。</li>
	<li>将各管磁珠混合物在旋转仪中室温孵育1小时。将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液，保留磁珠沉淀。</li>
	<li>用400 µl 1× W&amp;#38;B缓冲液重悬各管磁珠沉淀，重复洗涤两次，每次在旋转仪中室温旋转5分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上1分钟，弃去全部上清液。用50 µl核分离缓冲液（表3）重悬各管磁珠沉淀。</li>
</ol>
3. 前脂肪细胞的分离与脂肪生成诱导
<ol>
	<li>如先前出版物所述5从肩胛间棕色脂肪组织中分离前脂肪细胞（C57BL6野生型小鼠，3周龄）。</li>
	<li>培养并 体外 诱导前脂肪细胞分化5细胞在开始分化后4-5天即可用于后续实验应用。</li>
</ol>
4. 原代脂肪细胞细胞裂解液的制备
注意：细胞裂解液制备的所有步骤均需在冰上进行，所有缓冲液需预先在冰上预冷。将玻璃匀浆器（Dounce 玻璃匀浆器）提前在冰上预冷。
<ol>
	<li>在15 cm培养皿中培养并诱导前脂肪细胞分化5 （参见第3.2节）。每皿细胞可满足一次RNA下拉实验所需。在分化第4天或第5天，弃去细胞培养基，用1×PBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>收集细胞时，向细胞中加入10–15 ml 1×PBS，刮取细胞并收集至50 ml离心管中，于室温下以200 × g离心5分钟收集细胞沉淀。使用1 ml移液器弃去上清液。</li>
	<li>用2 ml低渗缓冲液（表3）重悬细胞沉淀，冰上孵育15分钟。将细胞转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切20次。</li>
	<li>于4 °C下以3,300 × g离心15分钟收集细胞核沉淀。将细胞核沉淀置于冰上备用（参见第4.6节）。将上清液转移至1.5 ml离心管中，加入3 M KCl使终浓度达到150 mM，然后于4 °C下以20,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>离心后，使用1 ml移液器小心去除顶部的脂层，收集上清液作为细胞质裂解物。</li>
	<li>用1 ml核分离缓冲液重悬细胞核沉淀（参见第4.4节）。用1 ml移液器将细胞核转移至15 ml玻璃Dounce匀浆器中，冰上机械剪切100次。于4 °C下以20,000 × g离心15分钟去除核碎片，收集上清液作为核裂解物。</li>
	<li>可将核裂解物与细胞质裂解物混合，或分别用于后续的下拉实验。在本示范实验中，这两种裂解物按1:1体积比混合。</li>
	<li>向此未分馏的细胞裂解物中加入RNase抑制剂，使其终浓度为0.5 U/µl。预留100 µl细胞裂解物作为输入对照用于Western blotting15。</li>
</ol>
5. RBP 的结合与洗脱
<ol>
	<li>将细胞裂解液均分为三等份（每份1 ml细胞裂解液置于1.5 ml离心管中），分别与空白 beads、FL RNA 偶联 beads 和 AR 3'UTR RNA 偶联 beads（参见第2.8节）在4 °C下旋转孵育3小时。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上1分钟。使用1 ml移液器收集上清液，随后从上清液中提取RNA以确认RNA完整性。按照制造商说明书，使用酸性硫氰酸胍-苯酚溶液提取RNA。表2）。通过分析核糖体RNA的28S和18S亚基评估RNA完整性。将珠粒沉淀物置于冰上保存。</li>
	<li>用含有40 U RNase抑制剂和0.25% IGEPAL的1 ml核分离缓冲液重悬磁珠沉淀，洗涤6次，每次重悬后将离心管在旋转仪上室温旋转2分钟。使用磁力架分离磁珠与上清液，弃去全部上清液。将磁珠沉淀置于冰上保存。</li>
	<li>使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于蛋白质印迹分析。首先，将每份磁珠沉淀重悬于75 µl核分离缓冲液中；然后加入25 µl 4x蛋白质印迹上样缓冲液（含SDS），使总体积达到100 µl。最后，将磁珠在此100 µl溶液中于95 °C煮沸5分钟。 
	注意：使用以下步骤从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于质谱分析。步骤1：将每份磁珠沉淀重悬于100 µl洗脱缓冲液中表3）；步骤2：室温下旋转孵育珠子样品2-3小时；步骤3：离心并收集含蛋白质的上清液；步骤4：在提交质谱分析前将蛋白质溶液浓缩至20-30 µl。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将每份 100 µl 珠子样品以 12,000 × g 离心 30 秒，收集上清液。取 15 µl 上清液用于蛋白质印迹分析（见第 6.1 和 6.2 节）。用稀释的 HuR 小鼠单克隆抗体（1:1,000 稀释）对所得膜进行杂交，孵育过夜。</li>
</ol>
6. 用于验证 RBP 的蛋白质印迹法
<ol>
	<li>使用标准技术通过SDS-PAGE分离RNA结合蛋白。</li>
	<li>使用标准技术进行蛋白质印迹实验，检测与目标RNA相关的RNA结合蛋白。 
	注意：在此演示实验中，使用了HuR小鼠单克隆抗体用于HuR蛋白的免疫检测。</li>
	<li>将所得膜置于含稀释后HuR抗体（1:1,000稀释度）的5% w/v脱脂奶粉、1×TBS溶液中孵育， 0.1% Tween-20，4℃ 在室温下轻柔振荡孵育过夜。用1×TBST缓冲液洗涤膜三次。将膜与二抗（山羊抗小鼠IgG-HRP）在室温下孵育1小时。洗涤膜。显影并记录信号。</li>
</ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

长链非编码RNA（lncRNA）和RNA结合蛋白（RBP）在健康与疾病中具有重要作用，但这些分子的分子机制尚不明确。鉴定与lncRNA分子相互作用的蛋白质是阐明其调控机制的关键步骤。RNA下拉实验系统通过在溶液中捕获相互作用复合物来富集RBP，从而利用结合在链霉亲和素磁珠上的生物素化RNA探针从细胞裂解液中选择性地提取目标蛋白。其他一些方法如ChIRP、CHART和RAP也可实现相同目的，但相比RNA下拉技术，这些方法的建立更为复杂16,17,18。
RNA 沉淀法的主要优势在于其操作相对简单且易于实施。CHIRP 和 RAP 均包含交联步骤，可保留天然存在的 RNA-蛋白质复合物，并需要设计覆盖整个目标 RNA 的反向互补寡核苷酸探针组（RAP 中为 90 个核苷酸长度，ChIRP 中为 20 个核苷酸长度）16,17,18RNA 折叠是 RNA 拉下实验中的关键步骤。该方案的主要局限性在于目标 RNA 是体外合成的 体外 且可能无法正确折叠成天然结构，从而无法与其RNA结合蛋白（RBP）正常结合。错误折叠的非天然RN...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA结合蛋白（RBPs）是一类能够与细胞内的双链或单链RNA结合并参与形成RNA-蛋白质复合物的蛋白质。RBPs可结合多种RNA分子，包括mRNA和长链非编码RNA（lncRNA），并在转录后水平发挥调控作用。目前，RBPs和lncRNA正被逐步揭示为脂肪组织发育与功能中的新型调控因子1,2,3。为了理解RBPs和lncRNA介导的细胞通路调控机制，通常需要检测特定RNA分子与一个或多个RBPs之间的相互作用，有时还需鉴定某一RNA转录本所结合的全部蛋白质伙伴。然而，由于脂肪细胞中含有大量脂质，此类实验往往具有挑战性。本文所述的RNA下拉（pull-down）实验方案可用于从原代培养的脂肪细胞裂解液中富集特定RNA的蛋白质结合伙伴4,5。
本方案的原理总结如下。一种RNA诱饵 体外 从DNA模板转录而来，经生物素标记后与链霉亲和素包被的磁珠偶联4将RNA诱饵与细胞裂解液共同孵育，以形成RNA-蛋白质复合物，随后在磁力架上进行下拉。具体而言，下述RNA下拉实验方案采用来自AR 3'非翻译区（3'UTR）的RNA片段作为诱饵，用于富集HuR蛋白——一种广泛表达的RNA结合蛋白，可结合mRNA的3'UTR区域。6,7，来自原代培养的脂肪细胞裂解液。为检测该实验的结合特异性，设置无关RNA以及链霉亲和素磁珠阴性对照。本方案可与蛋白质印迹（western blotting）或质谱分析（MS）联用，分别用于验证特定RNA结合蛋白（RBP）的捕获，或鉴定所捕获RBP的完整谱系8.
研究 RNA-蛋白质相互作用有多种技术可供选择。为了揭示特定 RNA 结合蛋白（RBP）所结合的 RNA，可采用 RIP（RNA 免疫沉淀）和 CLIP（紫外线交联与免疫沉淀）。相反，若要鉴定特定 RNA 的蛋白互作伙伴，则可应用 RNA pull-down、ChIRP（通过 RNA 纯化进行染色质分离）、CHART（RNA 靶标捕获杂交分析）和 RAP（RNA 反义纯化）。与后几种方法相比，RNA pull-down 技术的实验建立更为简便。该技术可用于在体外（in vitro）和体内（in vivo）捕获蛋白质。in vivo 的 RNA pull-down 方法在技术上比其 in vitro 版本更具挑战性，它通过在细胞内进行交联以保留 RNA-蛋白质相互作用，从细胞中捕获带有适配体标签的目标 RNA，进而检测与其结合的 RNA 结合蛋白（RBP）。RNA pull-down 可用于富集丰度较低的 RBP，并分离和鉴定在调控细胞功能中具有多种作用的 RNA-蛋白质复合物9,10。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;本研究使用的主要材料。&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript 试剂盒</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway 离心柱&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) 小鼠单克隆抗体 (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure 分子生物学级水（无核酸酶）&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本研究使用的主要设备。&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 梯度PCR仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO 多管旋转混合仪 Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白质凝胶电泳及转膜装置&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的rna下拉实验

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA结合蛋白（RBPs）在脂肪组织的发育和功能中正逐渐被视为一种重要的调控层次。RBPs通过影响靶标mRNA的稳定性和翻译效率，在转录后水平上对基因表达起关键调控作用。RNA pull-down技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这对于阐明RBPs以及长链非编码RNA（lncRNAs）功能的分子机制至关重要。然而，脂肪细胞中富含脂质，为该实验的实施带来了技术上的挑战。本文提供了一种针对原代脂肪细胞培养体系优化的详细RNA pull-down实验方案。以雄激素受体（AR）3'非翻译区（3'UTR）中包含腺苷酸-尿苷酸富集元件的一段RNA片段为例，展示了如何从脂肪细胞裂解液中富集其RBP结合蛋白HuR。本方法可广泛应用于检测RBPs与非编码RNA之间，以及RBPs与编码RNA之间的相互作用。

在本演示实验中，使用AR RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。同时设置与HuR蛋白无关的全长RNA（FL RNA）诱饵以及未偶联的空白链霉亲和素磁珠等分试样作为阴性对照。RNA-蛋白质相互作用可能发生在细胞核或细胞质中，本沉淀实验方案可适用于全细胞裂解液或分馏后的（核或胞质）细胞裂解液。通过蛋白质印迹分析显示，15 µl未分馏细胞裂解液样品（见第4.8节）作为无磁珠输入对照呈阳性结果，表明利用单克隆抗体可在小鼠原代培养脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。AR RNA洗脱组分也呈阳性结果，表明在RNA沉淀实验中，使用AR RNA偶联磁珠可从脂肪细胞裂解液中检测到HuR蛋白。而FL RNA洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明FL RNA片段与HuR蛋白之间以及空白磁珠与HuR蛋白之间的非特异性相互作用在本RNA沉淀方法中无法被检测到。这两个阴性对照的结果也表明，本研究所述的RNA沉淀实验方案成功检测到了AR RNA片段与HuR蛋白之间的特异性相互作用。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

本文优化了一种RNA下拉实验方案，用于检测RNA结合蛋白（RBPs）与非编码RNA以及编码RNA之间的相互作用。以雄激素受体（AR）的RNA片段为例，展示了如何从原代棕色脂肪细胞的裂解液中富集与其结合的RNA结合蛋白。

RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

RNA结合蛋白（RBPs）作为脂肪组织发育与功能调控层面的重要性日益凸显。RBPs在基因表达中发挥关键作用……

本实验的总体目标是从棕色脂肪组织中分离特定RNA转录本的RNA结合蛋白。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如，长寿命编码RNA的调控机制是什么，以及与其相关的RNA结合蛋白有哪些。该策略的主要优势在于操作简便。本实验所用的 RNA 为抗原受体 3' 非翻译区（3-Prime Untranslated Region）的一个片段，下文简称为 AR 3' UTR。首先，以 T7 AR 寡核苷酸和 psiCHECK-2 质粒中的萤火虫荧光素酶部分序列为模板进行扩增。所用引物及扩增参数详见随附文档。扩增后，按照生产商说明书，使用体外转录试剂盒将PCR产物作为模板合成生物素标记的RNA。然后在37摄氏度孵育混合物4小时。体外转录后，向反应体系中加入1 µL DNase，在37摄氏度孵育15分钟，以降解模板DNA。然后，加水将总体积调至60微升。将生物素标记的RNA上样到纯化柱中，以去除盐分和未掺入的核苷酸。随后，测定RNA浓度，并将RNase在-80摄氏度保存，用于后续的pull-down实验。在检测当天，将冻存的生物素标记RNA置于冰上解冻。随后，为确保目标RNA具有正确的二级结构，将其50微升在90摄氏度加热2分钟，然后在冰上冷却2分钟。接着，加入 50 µL 的 2× RNA 结构缓冲液，使 RNA 在室温下折叠 30 分钟。随后，通过短暂涡旋在原管中重悬链霉亲和素包被的磁珠。然后，将 150 µL 重悬的磁珠转移至一个 1.5 mL 离心管中。将试管置于磁力架上静置1分钟，使磁珠与上清液分离。用移液器吸除并弃去上清液，保留磁珠沉淀。用1毫升生产商推荐的1×结合与洗涤缓冲液重悬磁珠沉淀，混匀，然后将离心管置于旋转仪上，室温孵育5分钟，洗涤一次。随后用缓冲液A和缓冲液B各洗涤两次。孵育结束后，弃去上清液，保留磁珠沉淀。接下来，将磁珠沉淀重悬于 300 微升的 2 倍洗涤与结合缓冲液中。将磁珠均分为三份，每份 100 微升，分别加入三个 1.5 毫升离心管中。每管中加入 100 微升无 RNase 水、100 微升生物素标记的萤火虫荧光素酶 RNA 以及 100 微升生物素标记的 AR 3'非翻译区 RNA。将每种磁珠混合物在室温下旋转孵育一小时。然后将离心管置于磁力架上一分钟，移除并弃去上清液。保留珠粒沉淀。接下来，用400 µL的1×洗涤与结合缓冲液将珠粒沉淀重悬，重复洗涤两次，每次重悬后于室温下在旋转仪上孵育5分钟。将离心管置于磁力架上静置1分钟。然后，移除并弃去所有上清液。将每份珠粒沉淀重悬于 50 µL 核分离缓冲液中。为准备后续步骤，请确保所有缓冲液以及 Dounce 玻璃匀浆器均已预冷并置于冰上。细胞裂解液的制备应在冰上进行。对于每项待进行的RNA下拉实验，准备一皿来自三周龄C57 Black Six野生型小鼠的分化前脂肪细胞。四到五天后，为收集细胞，加入10至15毫升PBF，然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将它们转移至一个50毫升的离心管中，然后在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。离心结束后，用1毫升移液器吸除并弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于2毫升低渗缓冲液中，并将细胞置于冰上孵育15分钟。将细胞转移至15毫升Dounce玻璃匀浆器中，在冰上用20次抽吸进行机械剪切。在4摄氏度下以3300 × g离心15分钟，沉淀细胞核。离心后，将上清液转移至1.5毫升离心管中，将沉淀物置于冰上以备后续使用。向 supernatant 中加入 3 摩尔的氯化钾，使终浓度达到 150 毫摩尔。在 4 摄氏度下以 20,000 × g 离心 15 分钟。离心后，顶部会出现一层脂质层。使用1毫升移液器小心吸除上清。然后收集细胞质裂解液上清。接着，用1毫升移液器将核沉淀物重悬于1毫升核分离缓冲液中，并转移至15毫升Dounce玻璃匀浆器中。在冰上进行100次机械剪切以破碎细胞核。在4°C条件下，以20,000 × g离心15分钟，沉淀核碎片。收集上清液作为核细胞裂解物。这些样品可与之前收集的细胞质裂解液混合，也可保持分离以用于后续实验。此处，样品按1:1的比例混合。向未分级的细胞裂解液中加入RNase抑制剂，使其终浓度达到每微升0.5单位。然后，将100微升细胞裂解液置于冰上留作蛋白印迹实验的输入对照。将细胞裂解液均分为三份，每份1毫升，分别加入1.5毫升离心管中，并分别与空白萤光素酶RNA偶联磁珠及AR 3′非翻译区（UTR）偶联磁珠在4°C条件下旋转孵育3小时。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟。使用1毫升移液器收集上清液，然后按照随附文件中的描述提取RNA并评估RNA的完整性。将磁珠沉淀物置于冰上。洗涤磁珠六次。每次将珠粒沉淀重悬于1毫升含40单位RNase抑制剂和0.25% Igepal的细胞核分离缓冲液中，室温旋转孵育2分钟。将离心管置于磁力架上，分离磁珠与上清液。一分钟后，吸除并弃去上清液，将磁珠沉淀置于冰上。为从磁珠中洗脱RNA蛋白复合物用于蛋白质印迹，首先将每份磁珠沉淀重悬于75 µL核分离缓冲液中，然后加入25 µL 4×蛋白质印迹上样缓冲液。加入SDS，使总体积达到100微升。最后，将珠子在此100微升溶液中于95摄氏度煮沸5分钟。按照随附文件所述进行Western印迹，以验证RBP。在本实验中，使用抗原受体RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。与HuR蛋白无关的萤光素酶RNA诱饵以及未结合的空白链霉亲和素磁珠 aliquot 作为阴性对照。RNA与蛋白质的相互作用可发生在细胞核或细胞质中，该沉淀实验方案可应用于全细胞裂解液，也可用于分馏后的细胞核或细胞质裂解液。通过蛋白质印迹分析，使用单克隆抗体在未分级的细胞裂解液（即上样样品）中检测到 HuR 蛋白。抗原受体 RNA 洗脱组分也呈阳性结果，表明在使用抗原受体 RNA 偶联磁珠进行 RNA 拉下实验时，脂肪细胞裂解液中存在 HuR 蛋白。而萤光素酶 RNA 洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明该方法未检测到非特异性相互作用。综上所述，这些结果表明抗原受体RNA片段与HuR蛋白之间的相互作用具有特异性。观看本视频后，您应能充分理解如何从小鼠棕色脂肪组织的RNA转录本中回收RNA结合蛋白。一旦掌握该技术，操作得当的情况下可在24小时内完成。

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

RNA结合蛋白的检测通过<em&gt;体外</em在脂肪细胞培养&gt; RNA下拉

通过RIP-Chip分离和鉴定RNA相关复合物的逐步实验方案。...

从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

本视频演示了一种 体外 RNA下拉实验用于鉴定与mRNA中腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）序列相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。将细胞裂解液中的目标RBPs与RNA探针混合，形成RNA-蛋白质复合物，随后分离这些复合物 通过...

RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。...

研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

RNA-蛋白质相互作用是许多细胞过程的核心。本文介绍一种在活体（in...

通过RaPID方法分离新型RNA结合蛋白

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

对含有富含腺嘌呤元件（ARE）基序的合成25核苷酸RNA寡核苷酸进行脱硫生物素标记，可实现细胞质ARE结合蛋白的特异性结合。...

胸膜瘤细胞中通过脱硫生物素-链霉亲和素亲和介导的RNA相互作用蛋白纯化

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

本方法通过一种简单的活体报告基因检测法，在细菌细胞中定量分析RNA结合蛋白（RBPs）与其同源及非同源结合位点的结合亲和力。该检测基于报告基因的表达抑制作用。...

一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

本文介绍了一种将寡核苷酸（如小干扰RNA（siRNA）、microRNA模拟物（miRs）或抗microRNA（anti-miR））导入成熟脂肪细胞以调控蛋白质和microRNA表达的实验方案。...

一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

学习RNA下拉技术检测RNA结合蛋白的方法，利用雄激素受体3'非翻译区片段从原代棕色脂肪细胞裂解液中捕获特异性互作蛋白HuR。该方法操作简便，可在24小时内完成实验，为研究RNA调控机制提供可靠工具。

RNA结合蛋白的检测方法体外脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

探索更多视频

RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

探索更多视频

RNA结合蛋白的检测方法体外脂肪细胞培养中的RNA下拉实验