RNA结合蛋白的检测通过体外 RNA下拉
2016年7月22日
的RNA下拉协议这里优化用于检测RNA结合蛋白（限制性商业惯例）和非编码以及编码RNA之间的相互作用。从雄激素受体（AR）的RNA片段作为例子来演示如何从初级的棕色脂肪细胞的lystate检索其RBP。
该实验的总体目标是从棕色脂肪组织中检索 RNA 转录本的 RNA 结合蛋白。该方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如，长寿命编码 RNA 和相关 RNA 蛋白的调节机制是什么。这种策略的主要优点是易于执行。
用于演示该程序的 RNA 是抗原受体 3-Prime 非翻译区的片段，以下简称 AR 3-Prime UTR。首先扩增 T7 AR 寡核苷酸和 psiCHECK-2 质粒中萤火虫荧光素酶 DNA 的部分序列。随附的文档中详细介绍了所使用的引物和参数。
扩增后，按照制造商的说明，使用 PCR 产物作为模板，使用体外转录试剂盒合成生物素化 RNA。然后，将混合物在 37 摄氏度下孵育 4 小时。体外转录后，向反应中加入 1 微升 Dnase，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟以降解模板 DNA。
然后，用水使总体积达到 60 微升。将生物素化 RNA 涂在纯化柱上，以去除盐和未掺入的核苷酸。然后，在测量 RNA 浓度后，将 RNase 储存在零下 80 摄氏度，用于后续的沉降测定。
在测定当天，在冰上解冻冷冻的生物素化 RNA。然后，为确保目标 RNA 具有适当的二级结构，在 90 摄氏度下加热 50 微升 RNA 2 分钟。在冰上冷藏 2 分钟。
接下来，加入 50 μL 2X RNA 结构缓冲液，让 RNA 在室温下折叠 30 分钟。接下来，通过短暂涡旋，将链霉亲和素包被的磁珠重悬于其原始小瓶中。然后，将 150 μL 重悬的磁珠转移到 1.5 mL 试管中。
将试管放在磁力架上 1 分钟，以分离磁珠和上清液。使用移液管去除并丢弃上清液。保留珠子颗粒。
将微珠沉淀重悬于制造商推荐的 1X 结合和洗涤缓冲液的 1 毫升中，洗涤微珠一次，然后将试管置于旋转器上，在室温下放置 5 分钟。用缓冲液 A 和缓冲液 B 洗涤两次。孵育后，弃去上清液并保留珠子沉淀。
接下来，将微珠沉淀重悬于 300 μL 的 2X 洗涤和结合缓冲液中。将珠子平均分成三个 1.5 毫升的管子，每管 100 微升的珠子。加入 100 微升不含 RNase 的水、100 微升生物素化的萤火虫荧光素酶 RNA 和 100 微升生物素化的 AR 3-Prime UTR RNA。
将每个微珠混合物在室温下旋转孵育 1 小时。然后，将试管放在磁力架上 1 分钟。取出并丢弃上清液。
保留珠子颗粒。接下来，洗涤微珠两次，每次用 400 μL 1X 洗涤和结合缓冲液重悬微珠沉淀，然后将它们在室温下放在旋转仪上 5 分钟。将试管放在磁铁上 1 分钟。
然后，去除并丢弃所有上清液。将每个珠子沉淀重悬于 50 μL 的核分离缓冲液中。在准备方案的下一部分时，确保所有缓冲液以及 dounce 玻璃均质器在冰上冷却。
细胞裂解物制备应在冰上进行。对于要进行的每种 RNA 沉降测定，准备一个 15 厘米的培养皿，其中包含来自三周龄 C57 Black Six 野生型小鼠的分化前脂肪细胞。4 到 5 天后，要收获细胞，加入 10 至 15 毫升 PBF，然后使用细胞刮刀从培养皿中取出细胞。
将它们转移到 50 毫升试管中，然后在室温下以 200 倍 G 离心 5 分钟来沉淀。旋转后，使用 1 毫升移液器吸出并丢弃上清液。然后，将细胞沉淀重悬于 2 mL 低渗缓冲液中，并在冰上孵育细胞 15 分钟。
将细胞转移到 15 毫升 dounce 玻璃匀浆器中，并在冰上以 20 次冲程机械剪切细胞。在 4 摄氏度下以 3300 倍 G 离心 15 分钟，使细胞核沉淀。离心后，将上清液转移到 1.5 毫升试管中，并将沉淀物保存在冰上以备后用。
向上清液中加入 3 摩尔氯化钾，使终浓度为 150 毫摩尔。在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 旋转 15 分钟。离心后，顶部会有一层脂质层。
使用 1 毫升移液器小心地将其取出。然后，收集 citoplasmic 细胞裂解物上清液。接下来，使用 1 毫升移液器，将细胞核沉淀重悬于 1 毫升核分离缓冲液中，并转移到 15 毫升 dounce 玻璃匀浆器中。
在冰上用 100 次冲程机械剪切细胞核。通过在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心 15 分钟来沉淀核碎片。收集上清液作为核细胞裂解物。
这些可以与之前收集的细胞质裂解物混合，或单独保存以备后用。在这里，样品以 1 比 1 的比例合并。将 RNase 抑制剂添加到未分级的细胞裂解物中，以获得 0.5 单位/μL 的最终浓度。
然后，在冰上留出 100 微升细胞裂解物作为蛋白质印迹的输入对照。将细胞裂解物分成三个等分试样，每管 1.5 mL 中加入 1 mL 细胞裂解物，并与空白萤火虫荧光素酶 RNA 偶联物和 AR 3-Prime UTR 偶联珠子分别在 4 摄氏度下旋转孵育 3 小时。孵育后，将试管放在磁力架上 1 分钟。
使用 1 毫升移液器收集上清液，然后分离 RNA 并评估 RNA 完整性，如随附文件所述。将珠子颗粒放在冰上。洗涤磁珠六次。
每次，将微珠沉淀重悬于含有 40 单位 RNase 抑制剂和 0.25% igepal 的 1 毫升核分离缓冲液中。在室温下旋转试管 2 分钟。将试管放在磁力架中，以分离磁珠和上清液。
一分钟后，吸出并丢弃上清液，然后将微珠沉淀置于冰上。要从微珠中洗脱 RNA 蛋白复合物以进行蛋白质印迹，首先，将每个微珠沉淀重悬于 75 μL 核分离缓冲液中。然后，加入 25 μL 4X western blot-loading 缓冲液。
含有 SDS，以获得 100 μL 的总体积。最后，将珠子在 100 μL 溶液中在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。如随附文件所述，执行蛋白质印迹以验证 RBP。
在本实验中，抗原受体 RNA 片段被用作诱饵来捕获其结合蛋白 HuR。与 HuR 蛋白无关的萤火虫荧光素酶 RNA 诱饵和未偶联的空白链霉亲和素珠等分试样均用作阴性对照。RNA 蛋白相互作用可以发生在细胞核或细胞质中，并且这种 pull-down 方案可应用于总或分级的细胞核或细胞质细胞裂解物。
通过蛋白质印迹分析显示，使用单克隆抗体的未分级细胞裂解物或输入物中存在 HuR 蛋白。抗原受体 RNA 逃脱分数也给出了阳性结果，表明使用抗原受体 RNA 偶联的珠子进行 RNA 沉降测定，脂肪细胞裂解物中存在 HuR 蛋白。萤火虫荧光素酶 RNA 洗脱级分和空白珠样品均给出阴性结果，表明使用这种方法无法检测到非特异性相互作用。
综上所述，这些结果表明抗原受体 RNA 片段和 HuR 蛋白之间的相互作用是特异性的。观看此视频后，您应该对如何从棕色脂肪组织中从 RNA 转录本中检索 RNA 结合蛋白有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，可以在 24 小时内完成。
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概览
本文介绍了一种优化的RNA pull-down协议，用于检测RNA结合蛋白（RBP）与非编码RNA和编码RNA之间的相互作用。该方法以雄激素受体（AR）的一个片段为例，从原代棕色脂肪细胞裂解物中提取其RBP。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- RNA结合蛋白在调节RNA功能中起关键作用。
- 了解RBP相互作用可以阐明各种生物过程中的调节机制。
- 本研究关注棕色脂肪组织，该组织对代谢调节很重要。
- AR 3'端非编码区（UTR）作为研究RBP相互作用的模型。
研究目的
- 提取与特定RNA转录物相关的RNA结合蛋白。
- 调查长寿命编码RNA和相关RNA蛋白的调节机制。
- 提供一种研究RBP相互作用的简单方法。
使用的方法
- T7 AR寡核苷酸和萤火虫荧光素酶DNA部分序列的扩增。
- 使用psiCHECK-2质粒进行RNA片段展示。
- 详细参数和引物在随附的文档中提供。
- 应用RNA pull-down技术来分离RBP。
主要结果
- 成功从棕色脂肪细胞裂解物中提取RBP。
- 使用AR 3'端UTR展示该方法的有效性。
- 关于RBP与RNA转录物之间相互作用的见解。
- 对理解代谢调节的潜在影响。
结论
- 优化的RNA pull-down协议对研究RBP相互作用有效。
- 该方法可以促进进一步研究RNA调节机制。
- 研究结果可能有助于理解棕色脂肪组织中的代谢过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
RNA-binding protein (RBP) interactions represent a critical regulatory layer in adipocyte biology, impacting gene expression and metabolic function. The optimized in vitro RNA pull-down protocol enables precise identification of RBP partners in lipid-rich adipocyte systems, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio decisions involving RNA-centric targets and pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RBP–RNA interactions to clarify regulatory mechanisms in adipocyte models.
- Supports functional target validation by confirming specific protein–RNA binding events.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and RBP targets in metabolic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated adipocyte lysates for downstream screening of RBP modulators.
- Standardizes pull-down and detection workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable assessment of compound effects on RBP–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant adipocyte systems for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of RBP targets.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-targeted programs in metabolic disease portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This RNA pull-down protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in adipocyte models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of RBP–RNA regulatory mechanisms in adipose tissue.
- Screening: Provides assay-ready lysates and standardized workflows for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative western blot outputs for comparative analysis of binding specificity.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant adipocyte biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to diverse RNA and RBP targets in metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RBP target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for RNA–protein interaction studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA and RBP targets in metabolic disease pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, adipocyte culture, and western blot analysis.
- Needs access to magnetic bead-based pull-down systems and quantitative detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to both coding and noncoding RNA targets in various adipocyte models.
- High lipid content in adipocytes necessitates optimized lysate preparation and purification steps.
