Name: 抑制接枝反应性免疫的调节性巨噬细胞的功能表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解如何通过体外技术表征移植心脏中的调节性巨噬细胞功能，使用流式细胞术分离和分析CD11b阳性巨噬细胞亚群。该方法有助于研究免疫耐受机制并提高移植物存活率。

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我们感谢西奈山研究卓越中心的流式细胞术、显微外科以及生物样本库/病理学中心提供的技术贡献。本工作得到COST行动BM1305“聚焦与加速耐受性细胞治疗行动”（A FACTT）、西奈山雷卡纳蒂/米勒移植研究所发展基金、西班牙科学与创新部项目SAF2013-48834-R和SAF2016-80031-R（J.O.）的资助。

本研究中，小鼠的饲养遵循美国农业部指南以及《公共卫生服务实验动物护理与使用指南》的建议。所有涉及动物使用的实验技术均按照西奈山医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>使用 2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸、5 mM HEPES 和 0.05 mM 2-巯基乙醇，配制含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）的完全 RPMI 1640 培养基。</li>
</ol>
2. 异体移植物分离与单细胞悬液制备
注意：肺动脉和下腔静脉的移植与吻合技术最初由 Corry 及其同事描述，可在 Liu &amp;#38; Kang10,11 中查看示意图（图 1A）。
<ol>
	<li>在诱导室中使用4-5%异氟烷麻醉移植小鼠，通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>使用标准剪刀进行腹正中切口，移除腹腔内容物以暴露腹主动脉。 
	注意：移植的心脏将位于受体腹主动脉的右侧（图1B）。</li>
	<li>使用精细的尖齿镊子轻轻拉出移植物，并立即放入冰上预冷的RPMI培养基中。 
	注意：使用手术剪刀分离移植物与主动脉可能会损伤移植物，并导致部分组织残留在受体主动脉上。</li>
	<li>收集所有移植物后，将其转移至无菌超净台进行组织处理。将移植物置于培养皿中，使用无菌钝头显微手术剪将其剪切成约1 mm的小块。</li>
	<li>用尖齿镊子将组织块转移至含有5 mL胶原酶A（0.1 mg/mL胶原酶溶于无菌1x PBS）的50 mL离心管中，在37 °C水浴中孵育1小时。</li>
	<li>加入5 mL RPMI培养基以中和胶原酶活性，并借助1 mL注射器的推杆将悬液通过100 µm细胞筛过滤。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL ACK裂解缓冲液中，充分混匀后在4 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入1 mL RPMI培养基以中和裂解缓冲液，然后在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 µL RPMI培养基中，转移至5 mL聚丙烯圆底管。 
	注意：聚丙烯管表面吸附性较低。此外，将细胞维持在低温（如4 °C）可减少细胞黏附。</li>
</ol>
3. 使用荧光激活细胞分选法分离移植物浸润性巨噬细胞
<ol>
	<li>使用Fc受体阻断单克隆抗体（大鼠抗小鼠CD16/32）阻断髓系细胞上的非特异性结合。每份样本加入1–2 µL，于表面染色前15分钟孵育。</li>
	<li>使用抗小鼠 CD11b Percp/Cy5.5（终浓度 0.6 µg/µL，溶于 RPMI 培养基）、抗小鼠 CD45 APC/eFluor780（0.6 µg/µL）、抗小鼠 Ly6C APC（2 µg/µL）和抗小鼠 Ly6G Pe/Cy7（2 µg/µL）进行染色。用铝箔包裹管子以避光，防止荧光抗体降解，于 4 °C 冰箱中孵育 45 分钟。 
	注意：对于单染补偿，需准备一个阴性对照管（不加染料）以及分别用每种荧光染料单独标记细胞的管。为帮助设定门控，可使用同型对照，尤其是针对 Ly6C（IgG2a）和 Ly6G（IgG2b）。</li>
	<li>用 RPMI 培养基洗涤细胞两次，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数，并将每 1 × 10⁶ 个细胞重悬于 1 mL RPMI 培养基中。6 细胞。分选前，将样品通过5 mL、70 µm细胞滤筛管帽过滤。加入DAPI（1 µg/mL）作为细胞活力标记，随后进行分选。</li>
	<li>由于巨噬细胞是敏感且脆弱的细胞，分选时应设置压力为20 psi，使用100 µm喷嘴，并采用四路纯度模式以分离巨噬细胞。</li>
	<li>在5 mL聚丙烯管中加入1 mL RPMI培养基，准备收集管。</li>
	<li>使用分选仪软件打开新实验，选择带有空白面板的空白实验以定义设置。</li>
	<li>设置一个点图，显示前向散射光（FSC）与与侧向散射（SSC），并对所有白细胞设门，排除前向散射和侧向散射最低的碎片和细胞团块。在此父门基础上，创建一个新的点图，显示SSC 与 DAPI染色并圈选DAPI阳性细胞。
	<ol>
		<li>在这一新设门控的细胞群上，创建一个显示 CD11b 的散点图 与 CD45 及双阳性（CD11b+ CD45+巨噬细胞和中性粒细胞。</li>
		<li>由此创建最终的点图，显示 Ly6C 与 Ly6G 和门控目标细胞群：Ly6C你好 Ly6G-, Ly6CloLy6G-，以及 Ly6C整数Ly6G+ (图2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选后，检查纯度和细胞活力（&#62;90%）后，在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬至所需浓度（例如， 1 × 106 巨噬细胞/mL）于完全RPMI培养基中。</li>
	<li>50 x 10 培养板3 每孔加入巨噬细胞，置于96孔圆底培养板中，每孔终体积为100 µL完全RPMI培养基。37 °C、5% CO₂条件下静置培养至少24 h。2.</li>
</ol>
4. 使用荧光激活细胞分选法分离T细胞
注意：C57BL/6-Foxp3tm1Flv/Jn 是一种X连锁的靶向敲入小鼠品系，可利用单体红色荧光蛋白（mRFP）共标记表达 Foxp3（forkhead box P3）基因的细胞。
<ol>
	<li>按照步骤2.1所述方法麻醉并处死C57BL/6和C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J（H-2b）小鼠。取出脾脏和淋巴结（LN：腹股沟、腰部、腋窝、臂部和颈部），并迅速置于冰上预冷的RPMI培养基中。</li>
	<li>为分离淋巴结，将小鼠仰卧放置，从下至上沿中线切开皮肤，小心切开腹膜并轻轻分开皮肤。收集所有腹股沟、腰部、腋窝、臂部和颈部淋巴结（图1C，以红色标示）后，剪开腹膜，在肠道左上方取出脾脏。</li>
	<li>使用置于50 mL离心管上的100 µm细胞筛对脾脏和淋巴结组织进行机械分散。用1 mL注射器的推杆轻轻按压组织，并用RPMI培养基冲洗细胞筛，直至筛网清洁。 
	注意：每只小鼠的淋巴结和脾脏组织可合并至同一离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于2 mL ACK裂解缓冲液中，充分混匀，并在4 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入2 mL RPMI培养基以中和裂解缓冲液，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 µL RPMI培养基中，并转移至5 mL聚苯乙烯圆底流式管中。</li>
	<li>使用抗小鼠CD4 APC抗体（0.6 µg/µL）和/或抗小鼠CD8 PeCy7抗体（2 µg/µL）进行染色。用铝箔包裹流式管以避光，于4 °C冰箱中避光孵育45分钟。 
	注意：为进行单染色补偿，需准备阴性对照管（不加染料）以及分别单独标记每种荧光染料的细胞管。</li>
	<li>用RPMI培养基洗涤细胞两次，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数。 
	注意：CFSE染料通常以50 µg的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯粉末形式提供。向CFSE小瓶中加入18 µL DMSO，配制成5 mM的储存液，可于-20 °C保存数月。</li>
	<li>进行CFSE标记时，将CD8染色后的细胞以最高106个细胞/mL的浓度重悬于PBS中，并从储存液中加入CFSE至终工作浓度为5 µM。如前所述6，在20 °C水浴中孵育5分钟。 
	注意：（关键步骤）对于低浓度细胞（≤106个/mL），必须在添加蛋白质的条件下进行标记，以缓冲CFSE的细胞毒性作用。因此，PBS中可含5% FBS。需注意，若使用培养基，其中的游离氨基酸可能与CFSE竞争，从而降低标记效率。</li>
	<li>加入2 mL RPMI培养基以中和CFSE，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。每1 × 106个CD8 T细胞加入1 mL RPMI培养基。</li>
	<li>分选前，将样品通过置于5 mL流式管盖上的70 µm细胞筛。加入50 µL 1x DAPI（1 µg/mL）作为细胞活力标记物，随后进行分选。 
	注意：1x表示试剂与其他组分按1:1比例混合。</li>
	<li>设置分选条件为20 psi压力和100 µm喷嘴，以分离CD8+CFSE+双阳性T细胞（图3A）。</li>
	<li>在5 mL聚丙烯管中预先加入1 mL RPMI培养基作为收集管，开始分选。</li>
	<li>在分选仪软件中新建实验，选择空白实验模板和空白面板以设定参数。</li>
	<li>对于CD4+ T细胞的分离，设置FSC与SSC的散点图，并圈选淋巴细胞门，排除碎片及树突状细胞等大颗粒细胞。
	<ol>
		<li>在此父代门内，新建SSC与DAPI的散点图，并圈选DAPI阴性细胞。</li>
		<li>在新圈选的细胞群中，建立SSC与CD4的散点图，以分离所有CD4+细胞（图3B）。也可使用抗CD3单克隆抗体，以确保获得纯度较高的T细胞群体。 
		注意：所有CD4+ T细胞中应有少量比例（5–10%）为Foxp3+mRFP+细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选完成后，检测细胞纯度和活力（&#62;90%），并在4 °C条件下以400 × g离心收集管5分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板计数细胞，按每2×106个T细胞加入1 mL完全RPMI培养基进行重悬。</li>
	<li>通过将T细胞与先前分选的巨噬细胞共培养，建立抑制实验。在同一孔中接种10 × 104个CD4+ T细胞和10 × 104个CD8+CFSE+ T细胞，终体积为100 µL完全RPMI培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育96小时。 
	注意：巨噬细胞与T细胞的共培养比例为1:4。</li>
	<li>为刺激T细胞增殖，使用前需将T细胞激活磁珠（CD3/CD28）用2 mL PBS洗涤，以去除含叠氮化钠的缓冲液。每孔加入5 µL小鼠T细胞激活磁珠（CD3/CD28）。 
	注意：磁珠大小与抗原呈递细胞相似，偶联有抗CD3和抗CD28单克隆抗体，可简便地实现T细胞的激活与扩增。</li>
</ol>

<ol><li>Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+act+as+effectors+of+tissue+damage+in+acute+renal+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection.</a> Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).</li>
<li>Oberbarnscheidt, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self+recognition+by+monocytes+initiates+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection.</a> J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).</li>
<li>Garcia, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+suppressive+cells+mediate+cardiovascular+transplantation+tolerance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).</li>
<li>Conde, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%28%2B%29+Macrophages+Control+the+Induction+of+Transplantation+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance.</a> Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> J Vis Exp. (70), e4287(2012).</li>
<li>Poujol, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+evaluation+of+lymphocyte+transformation+test+based+on+5-ethynyl-2%27deoxyuridine+incorporation+as+a+clinical+alternative+to+tritiated+thymidine+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement.</a> J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238(2007).</li>
<li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Transplant+Rep%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li>
<li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr-1%2BCD115%2B+immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li>
<li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4%28%2B%29+Foxp3%28%2B%29+Treg+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了我们在小鼠心脏移植实验模型中用于免疫表征移植物浸润性髓系细胞亚群的方法，该方法也可适用于其他小鼠实验模型中的不同组织。我们优先采用20 psi低压细胞分选方法，以获得较高产量的纯细胞亚群。保持各髓系细胞亚群的纯度，对于明确不同髓系细胞群体之间抑制能力的结论至关重要。然而，也可使用其他方法分离各类白细胞群体，例如 commercially enrichment kits（商品化富集试剂盒）。无论目标细胞群体为何，均需从移植组织中获得 viable 单细胞悬液，以确保表面染色和流式细胞术结果的最佳效果。不正确的组织处理可能导致细胞丢失，从而造成髓系细胞亚群产量降低。为提高产量，务必使用预冷缓冲液处理样本，并将细胞置于低细胞黏附性容器（如聚丙烯管）中保存。在本方案中，我们使用了来自 C. histolyticum 的胶原酶A，该酶广泛用于多种组织的解离（例如：肺、心脏、肌肉、骨骼、脂肪、肝脏、肾脏、软骨、乳腺、胎盘、血管、脑组织及肿瘤）。为防止分选过程中细胞丢失，强烈建议优化抗体组合并建立高效的设门策略。在本方案中，我们采用CD11b-Percp/Cy5.5、CD45-APC/eFluor780...

本方案描述了 体外 研究心脏同种异体移植物中浸润性巨噬细胞功能的技术，依据其调节T细胞反应的能力。文献中广泛描述的荧光细胞示踪染料结合流式细胞术，是研究特定细胞类型抑制功能的强大工具 体外 和 体内 我们的方案采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）法来监测淋巴细胞增殖 体外.
当用CFSE标记的细胞分裂时，其子代细胞获得的羧基荧光素标记分子数量减半6。通过流式细胞术检测细胞荧光强度相应降低，可用于评估细胞分裂情况，监测具有抑制功能的巨噬细胞对T细胞免疫应答的调节能力。由于CFSE是一种基于荧光素的染料，可与多种其他荧光染料兼容，因此适用于多色流式细胞术分析。在进行表型鉴定时，合理选择荧光染料也至关重要，以避免过大的光谱重叠，导致难以识别抗体阳性细胞，尤其是在使用CFSE等可见光蛋白染料时尤为明显7。
与测量细胞增殖的其他替代技术（如胸苷掺入法，该方法使用放射性标记的胸苷（TdR）8）相比，荧光染料具有多种优势。胸苷掺入法利用氚标记的胸苷（3H-TdR），在有丝分裂过程中将其掺入染色体DNA的新链中。该方法的一个安全问题是涉及放射性同位素的使用，因为需要使用闪烁计数仪检测从细胞中提取的DNA的放射性，以确定细胞分裂的程度。在方法学上，氚标记胸苷掺入法灵活性不足，难以满足临床实验室的一些重要限制条件，例如细胞数量较少或染色后延迟分析等。相反，CFSE染色已被证明会抑制细胞增殖，并干扰关键的活化标志物（如CD69、HLA-DR和CD25）9。因此，在多色实验中（需使用多种染料追踪不同类型的细胞），了解每种方法的优势与局限性对于获得准确且可重复的结果至关重要。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1,000倍稀释的2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100倍青霉素-链霉素溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100倍非必需氨基酸</td><td>康宁</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES缓冲液&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>罗氏</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（不含钙）&amp;镁</td><td>康宁</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 孔&amp;nbsp; U型底板</td><td>康宁</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>抗体：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>抗-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>抗CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD8-P/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII 流式细胞仪</td><td>BD生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 软件</td><td>BD生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&amp;nbsp;</td><td>杰克逊实验室</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>杰克逊实验室</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

功能鉴定抑制移植物反应性免疫的调节性巨噬细胞

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

移植器官中巨噬细胞的积聚长期以来被认为是同种异体移植物排斥反应的一个特征1免疫原性单核细胞在移植后早期浸润移植物，对移植器官产生移植物反应性应答，并启动器官排斥反应2最新数据表明，抑制性巨噬细胞有助于实现成功的长期移植3 并且是诱导移植耐受所必需的4这表明巨噬细胞的本体发生、活化和功能具有多维特性，因此需要制定新的研究路线图，以分离和分析巨噬细胞功能5由于巨噬细胞具有可塑性，因此有必要根据组织微环境提供一种分离和表征巨噬细胞的方法，并根据不同情境定义其功能。本文描述了一种用于免疫表征移植物浸润性巨噬细胞的实验方案，以及我们用于功能性评估其抑制CD8⁺ T细胞能力的方法+ T细胞增殖并促进CD4+Foxp3+ Treg 扩增 体外.

代表性结果展示了上述方案中描述的设门策略。结果还显示了T细胞与移植物浸润性巨噬细胞共培养后的增殖活性分析。体外巨噬细胞亚群的抑制能力在图4中进行了分析。结果表明，来自耐受受体的Ly6CloLy6G-巨噬细胞具有抑制功能。结果还显示，Ly6CintLy6G+细胞表现出较弱的抑制能力。只有Ly6CloLy6G-细胞能够在体外促进CD4+Foxp3+调节性T细胞（Treg）的扩增。综上所述，这些数据支持以下结论：移植物浸润的CD11b+Ly6CloLy6G-巨噬细胞具有许多已被报道与单核细胞来源的抑制性细胞相关的特性12，包括其抑制CD8 T细胞增殖的能力13以及促进CD4<s...

巨噬细胞是造血系统中具有可塑性的细胞，在保护性免疫和内环境稳态中发挥关键作用。在本报告中，我们描述了优化的 体外 在耐受性条件下，用于表型和功能表征移植器官中积聚的移植物浸润性调节性巨噬细胞的技术。

巨噬细胞在移植器官中的积聚长期以来一直被视为同种异体移植物排斥的特征之一1。具有免疫原性的单核细胞会浸润……

本体外实验的总体目标是在大规模移植模型中，对从同种异体移植心脏中分离出的巨噬细胞群体进行表型和功能特征分析。这些方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如如何提高同种异体移植物存活率及诱导免疫耐受。该技术的主要优势在于，能够研究特定组织浸润的、从心脏同种异体移植物中分离出的巨噬细胞亚群如何调节宿主组织的免疫应答。从移植物制备单细胞悬液后，加入一至两微升 FC 受体阻断单克隆抗体，室温孵育 15 分钟，以封闭髓系细胞上的非特异性结合位点。孵育结束后，在避光条件下，使用适当荧光标记的髓系细胞表面抗体于 4°C 对细胞染色 45 分钟。随后通过离心，用 RPMI 培养基洗涤细胞两次。将沉淀物重悬于台盼蓝溶液中进行计数。接着，用新鲜培养基将细胞稀释至浓度为每毫升1×10⁶个细胞。然后将细胞通过70微米细胞筛过滤至5毫升圆底试管中。分选前，使用 DAPI 对细胞进行染色，作为活力标记，并将流式细胞仪设置为适当的巨噬细胞分选参数。准备含有 1 毫升 RPMI 培养基的 5 毫升锥形管，用于收集分选后的细胞，并将样品管装载到细胞仪上。在流式细胞仪软件中，选择一个空白实验和空白面板，设置前向散射与侧向散射的点图。根据前向散射和侧向散射的最低信号对白细胞设门，排除细胞碎片和聚集体。在此父代设门基础上，创建一个新的点图，显示侧向散射与DAPI的信号关系，并对DAPI阴性细胞设门。在新设门的细胞群中，创建一个显示CD11b与CD45的点图，对CD11b和CD45双阳性细胞设门，以获取巨噬细胞和中性粒细胞。然后创建最终的点图，显示 Ly6C 与 Ly6G 的关系，以便圈选目标细胞群体并进行分选。分选结束后，确认样品的纯度和活力。通过离心收集分选后的细胞，并将沉淀重悬于新鲜 RPMI 培养基中进行计数。将巨噬细胞群体稀释至适当浓度，以每孔100微升完全培养基中接种5 × 10⁴个巨噬细胞的密度，接种于96孔圆底培养板中。随后将细胞置于37°C、5%CO₂的细胞培养孵箱中培养至少24小时。为分离T细胞，将基因敲入小鼠置于仰卧位。首先沿中线做皮肤切口，小心剪开腹膜并轻轻分开皮肤。收集外周淋巴结和脾脏，将组织置于置于50毫升锥形管上方的100微米滤膜上。用1毫升注射器的推杆轻轻将淋巴组织压过滤膜，并用新鲜的RPMI培养基冲洗滤膜，直至滤网清洁。通过离心收集单细胞悬液，并将沉淀重悬于2 mL ACK裂解缓冲液中。在4°C孵育5分钟后，加入2 mL新鲜RPMI培养基中和裂解缓冲液，随后离心细胞。将沉淀重悬于200 µL新鲜培养基中，并将细胞转移至5 mL圆底试管，用于与相应的T细胞表面染色抗体进行染色。在避光、4摄氏度条件下孵育45分钟后，用新鲜RPMI培养基洗涤细胞两次，并通过台盼蓝排斥法计数细胞。接着，将CD8染色的细胞用CFSE稀释至每毫升1×10⁶个细胞的浓度，在20摄氏度水浴中孵育5分钟。孵育结束后，加入2毫升RPMI培养基中和CFSE，并通过离心收集细胞。将细胞重新悬浮于RPMI培养基中，浓度为每毫升含1 × 10⁶个CD8染色的T细胞，并将所有细胞样品通过70 µm细胞滤网过滤至5 mL圆底管中。随后用DAPI对细胞进行标记，并按照前述方法准备流式细胞仪进行分选。对于CD4阳性T细胞的分离，设置前向散射光与侧向散射光的点图，用于圈选淋巴细胞群，排除碎片以及大型颗粒性髓系细胞。从该亲本门控中，创建一个散点图，显示侧向散射光（SSC）相对于 DAPI 的分布，并圈选 DAPI 阴性细胞。在新圈选的细胞群体上，创建一个显示侧向散射光（SSC）相对于 CD4 的散点图，以及另一个显示 CD8 相对于 CFSE 的散点图。随后分选已圈选的 T 细胞群体。分选结束后，确认样品的纯度和细胞活力，并通过离心收集细胞用于计数。将细胞稀释至每毫升RPMI培养基中含有2×10⁶个T细胞的浓度，并向每孔巨噬细胞中加入100 µL完全RPMI培养基中的T细胞，在37°C、5%CO₂条件下共培养96小时。最后，向每孔中加入5 µL PBS洗涤过的T细胞激活剂CD3/CD28磁珠，以激活并扩增T细胞。来自耐受受体的Ly6Clo Ly6G-巨噬细胞对CD8阳性T细胞具有抑制作用，而Ly6C中等表达的Ly6G阳性细胞也表现出较弱的抑制活性。然而，仅Ly6Clo Ly6G-细胞能够促进体外CD4阳性Foxp3阳性调节性T细胞（Treg）的扩增。综上所述，这些数据支持以下结论：移植物浸润的CD11B阳性、Ly6Clo、Ly6G阴性巨噬细胞具备许多单核细胞来源的抑制性细胞所报道的特性，包括抑制CD8 T细胞增殖以及促进CD4阳性Foxp3阳性调节性T细胞扩增的能力。在进行该实验操作时，保持细胞纯度至关重要，以获得关于每种巨噬细胞亚群抑制能力的明确数据。完成该操作后，还可采用其他方法，例如使用商业化的富集门控策略，来分离其他感兴趣的白细胞群体。巨噬细胞分选是本实验流程中最耗时的部分，但一旦掌握熟练，若操作得当，可在八小时内完成该步骤。该技术建立后，为免疫学领域的研究人员探索实体器官移植模拟模型中浸润性巨噬细胞的抑制能力奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对从小鼠心脏同种异体移植物中分离的不同巨噬细胞群体进行表征。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

抑制接枝反应性免疫的调节性巨噬细胞的功能表征

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

本文介绍一种分离小鼠腹腔巨噬细胞的简单方案。该操作随后进行RNA提取，以在Toll样受体刺激后开展基因表达分析。...

从小鼠腹腔巨噬细胞分离以进行Toll样受体刺激后的基因表达分析

我们描述了一种小鼠主动脉移植术的实验方案。该方案的目的是提供一种可用于研究动脉中与同种免疫反应相关的病理过程及治疗策略的模型，以及由此引发的动脉改变，这些改变是导致器官移植失败的重要因素。...

异体免疫诱导的血管排斥反应与移植性动脉硬化的鼠类模型

本文介绍了一种分析从未经处理及慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的调节性T（Treg）细胞表型的实验方案。此外，我们还提供了一种评估Treg细胞抑制活性的方法。...

从慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的活化调节性T细胞的表型与功能分析

在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内...

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

基于抗体的药物已彻底改变了炎症性疾病的治疗方法。除了对特定靶点产生直接作用外，抗体还可激活巨噬细胞，使其转化为抗炎表型。本实验方案描述了如何评估抗炎巨噬细胞的活化状态。 体外 使用小鼠骨髓来源巨噬细胞，以及 体内...

抗体类药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化影响的评估

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本方案阐述了如何利用组织病理学检查和免疫组织化学方法，对巨细胞动脉炎患者颞动脉活检标本中叶酸受体β巨噬细胞进行表征，并分析其与总免疫细胞浸润之间的关系。...

一项免疫组织病理学研究：描绘巨细胞动脉炎中叶酸受体β巨噬细胞及血管免疫微环境

本文介绍了一种定量分析并生成间充质干细胞（MSC）介导的巨噬细胞（MΦ）对非调理酵母（酵母聚糖）颗粒吞噬作用动态图像的实验方案，其中酵母聚糖颗粒与一种pH敏感型荧光分子偶联。...

间充质干细胞对巨噬细胞吞噬作用的调控；定量与成像

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

了解如何通过体外技术表征移植心脏中的调节性巨噬细胞功能，使用流式细胞术分离和分析CD11b阳性巨噬细胞亚群。该方法有助于研究免疫耐受机制并提高移植物存活率。

功能鉴定抑制移植物反应性免疫的调节性巨噬细胞

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