从人类心脏组织血管周围多能前体细胞群的分离
2016年10月8日
人体心脏组织窝藏多能血管周围的前体细胞群可能适合于心肌再生。这里描述的技术允许与天然血管， 即 CD146 + CD34相关联的两个多能基质干细胞群的同时分离和纯化-周细胞和CD34 + CD146 -外膜细胞，从人的心肌。
该程序的总体目标是从人类心脏组织中分离两个离散的多能血管周围前体细胞群。这种方法可能有助于回答心脏再生领域的关键问题，例如血管周围细胞群的子集对这一过程的贡献。该技术的主要优点是它导致祖细胞群的异质性降低，并提高了所选主要的 ex 粘附技术的活力。
这项技术对缺血性心脏病的治疗具有意义，因为血管周围干细胞亚型已被证明具有心肌生成潜力。虽然这种方法可以深入了解血管周围细胞在心脏再生中的作用，但它也可以应用于心脏病其他方面的研究，例如心肌纤维化。一般来说，刚接触这种方法的个体会因为组织新鲜度而使用活细胞而感到挣扎。
要开始此过程，在去除心包、主要血管和心房后，将样品放入培养皿中的洗涤介质中。接下来，将心室心肌切成约 1 立方毫米的小块并立即处理以获得最高的细胞产量。然后，制作新鲜的消化液，在水浴中加热至 37 摄氏度。
之后，通过 100 微米过滤器过滤悬浮的组织块，并用 PBS 洗涤两次。将组织块转移到带有密封盖子的 30 毫升无菌容器中。加入消化液，将容器放入密封塑料袋中，置于设置为 120 RPM 的 37 摄氏度振荡水浴中。
15 分钟后，将容器倒置 3 次。然后，将其放回水浴中再放置 15 分钟。然后，用 5 毫升补充有 20% FBS 的 DMEM 去除并淬灭胶原酶。
随后，用 10 毫升血清移液管轻轻移液 10 至 20 次，以研磨消化的组织，以分解任何组织团块。接下来，依次通过 100 微米、70 微米和 40 微米的细胞过滤器过滤悬浮液，以获得单细胞悬浮液。然后，将细胞悬液以 200 x g 离心 4 分钟。
小心倒出上清液，在室温下将沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液中 2 分钟，然后用 4 mL 洗涤介质稀释。重复离心步骤，将沉淀重悬于 1 毫升洗涤培养基中。用 90 μL 洗涤培养基稀释 10 μL 细胞悬液，制成 1 至 10 稀释的细胞悬液。
将 10 微升稀释的细胞悬液与 10 微升台盼蓝染色剂混合，并将 10 微升混合物置于标准血球计数器上进行细胞计数。在此程序中，向细胞悬液中加入 50 μL 小鼠血清，并在 4 摄氏度下孵育 20 分钟，以阻断非特异性抗体结合。接下来，将细胞悬液以 200 x g 离心 4 分钟。
去除上清液并将其重悬于洗涤介质中。接下来，将 50 μL 细胞悬液分装到两个聚苯乙烯圆底流式细胞术管中，分别用于同种型和未染色对照，并将剩余体积放入第三个管中进行多色染色。向单细胞悬液中加入 5 种抗体进行多色染色。
轻轻移液，将抗体与细胞混合，并在 4 摄氏度下将所有试管在黑暗中孵育 20 分钟。通过在 5 个流式细胞术管中将 1 滴阳性珠子添加到 100 μL 洗涤培养基中来制备补偿对照珠子。将抗体分别添加到五个试管中。
然后，将所有试管在 4 摄氏度下避光孵育 20 分钟。同时，准备细胞收集管，每个收集管含有 500 微升 EGM-2 培养基，并将它们置于 4 摄氏度。抗体孵育后，加入 5 mL 洗涤培养基以洗涤细胞和微珠，以去除任何未结合的抗体。
将所有试管以 200 x g 离心 4 分钟。重复洗涤和离心步骤，小心倒出上清液。然后，将细胞重悬于洗涤培养基中，浓度为 1 倍 10 至第 6 个细胞/250 μL。
之后，将珠子重悬于 100 微升洗涤介质中。将细胞和微珠悬浮液转移到黑暗中放在冰上的细胞分选仪中。向阳性微珠补偿对照管中加入一滴阴性微珠，并使用它们设置荧光补偿。
然后，运行未染色的对照细胞以建立背景荧光并设置电压。随后，运行对照同种型以建立与非特异性结合相关的背景荧光阈值。运行多色染色样品，并将周细胞和外膜细胞群收集到收集管中。
在此过程中，每平方厘米生长区域加入 100 微升无菌 0.2% 明胶溶液，并手动搅拌以涂覆整个孔。之后，将板在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。然后，完全去除明胶溶液。
在准备培养板时，将收集的细胞放在冰上。接下来，将新鲜采集的细胞以 200 x g 离心 4 分钟，然后轻轻地将细胞沉淀重悬于适量的 EGM-2 中。之后，将细胞接种在明胶包被的板上。
在该图中，对活细胞进行门控，首先排除 CD45 阳性细胞，然后排除 CD56 阳性细胞。然后从 CD56 阴性组分中去除 CD144 阳性内皮细胞。从这个最终群体中，选择 CD146 阳性、CD34 阴性的周细胞和 CD146 阴性、CD34 阳性的外膜细胞，随后收集。
FACS 纯化的心肌周细胞和外膜细胞的两种培养物都表现出纺锤体到星状细胞形态。一旦掌握，如果执行得当，这项技术大约需要五个小时。在尝试此过程时，请务必记住，最新鲜的样品将提供最佳活细胞产量。
在此程序之后，可以进行其他方法，例如细胞心肌成形术，以回答其他问题，例如这些细胞在治疗缺血性心脏病中的适用性。
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概述
本文介绍了一种从人心脏组织中分离出两种不同的多能周血管前体细胞群的方法。该技术旨在增强对心脏再生以及周血管细胞在此过程中的作用的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏再生
- 干细胞生物学
- 周血管细胞群
背景
- 人心脏组织中含有多能周血管前体细胞。
- 这些细胞可能有助于心肌再生。
- 研究集中在CD146 + CD34 - 周细胞和CD34 + CD146 - 外膜细胞上。
- 了解这些群体可以为缺血性心脏病的治疗提供信息。
研究目的
- 分离和纯化特定的周血管细胞群。
- 研究它们对心脏再生的贡献。
- 减少异质性并提高分离细胞的活力。
使用的方法
- 分离CD146 + CD34 - 周细胞和CD34 + CD146 - 外膜细胞。
- 应用主要的去附着技术。
- 评估细胞活力和异质性。
- 可能应用于心肌纤维化研究。
主要结果
- 成功分离出两种不同的周血管细胞群。
- 与传统方法相比，祖细胞的活力得到改善。
- 对周血管细胞在心脏再生中的作用的见解。
- 该方法可应用于其他心脏疾病的研究。
结论
- 该技术增强了对心脏再生机制的理解。
- 它可能导致缺血性心脏病治疗的进展。
- 未来的研究可以探索对心脏健康的更广泛影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating defined perivascular precursor cell populations from human myocardium enables mechanistic de-risking in cardiac regeneration research by reducing cellular heterogeneity and improving viability. This approach supports target validation and phenotypic screening for ischemic heart disease therapies by providing reproducible, disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models through standardized isolation of CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding perivascular cell contributions to cardiac regeneration.
- Operational Value: Reduces biological noise through prospective isolation of homogeneous multipotent precursor subpopulations.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying functional roles of specific perivascular subsets in myocardial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined surface marker profiles for consistent compound screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via FACS-based purification of pericyte and adventitial cell populations.
- Strategic Value: Facilitates scalable platform reuse for evaluating drug effects on cardiac progenitor cell function and viability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human cardiac cell models for investigating myocardial fibrosis and ischemic injury mechanisms.
- Operational Value: Enables translational continuity from discovery to preclinical validation using clinically relevant perivascular subsets.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving predictive value of preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying purified perivascular precursor cells for hypothesis testing in early discovery, assay-ready cells for screening applications, and translationally relevant models for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through isolation of defined perivascular cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell suspensions with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of cell viability, purity, and functional readouts following isolation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human-derived, disease-relevant cardiac progenitor cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FACS-based isolation platform applicable across cardiac disease models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in perivascular cell function.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cardiac progenitor cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac regeneration programs based on validated precursor cell activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell sorting, and primary tissue handling.
- Dependent on access to FACS instrumentation, antibody panels, and sterile cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue sources or disease models.
- Limited by tissue freshness requirements, as viable cell yield declines with sample degradation.
