从高纯高密度脂蛋白的miRNA的高通量快速分离和简化方法
2016年7月27日
微RNA起重要的调节作用，并正在成为关于各种人类疾病新的治疗目标。它已经显示，微RNA在高密度脂蛋白携带。我们已经开发出一种简化方法迅速隔离适用于从人血浆中的miRNA分析纯化HDL。
该方法的总体目标是开发一种简化的方法，从人血浆中快速分离纯化的高密度脂蛋白，用于 micro RNA 分析。这种方法可以帮助回答肝病学和心脏病学中的关键问题，例如了解高密度脂蛋白的分子机制和保护功能。该技术的一些主要优点是，纯化的 HDL micro RNA 可在短时间内从较少体积的样品中预先分离出来。
在该方案中，如方案文本中所述，通过多个离心步骤从空腹外周静脉血样本中获得血浆。将血浆转移到新管中。并按照制造商的说明，在室温下使用密度计测量等离子体的密度。
为了去除代表 micro RNA 污染源的循环外泌体，向 1 毫升血浆中加入 252 μL 外泌体沉淀溶液。并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。然后将混合物离心 30 分钟以沉淀出外泌体。
将 1 毫升所得上清液转移到聚碳酸酯厚壁超速离心管中进行进一步处理，如下一个视频片段所示。高密度脂蛋白 （HDL） 的分离是通过三步密度梯度超速离心方案完成的，该方案涉及连续分离极低密度脂蛋白 （VLDL）、低密度脂蛋白 （LDL） 和 HDL。三种不同密度的溶液 A、B 和 C 必须按照方案文本中描述的程序新鲜制备。
在 6.5 mL 聚碳酸酯厚壁超速离心管中，混合 1 mL 血浆和 200 μL 无核酸酶的 Fat Red 7B。然后，小心地将 5 毫升溶液 A 铺在混合物上。如果需要，在溶液 A 上添加额外的 Fat Red 7B，以平衡每管的重量。
将试管装入预冷的转子中。将转子放入落地式离心机中，离心 2 小时。在运行结束时，应显示两个图层。
去除 1.5 毫升顶层，代表 VLDL 分数。并将其储存在 4 摄氏度。使用移液管将 4 mL 样品从试管底部转移到新的 50 mL 试管中。
这包含 LDL 和 HDL 分数。下一步是分离 LDL。将 2 毫升溶液 B 和 100 微升不含核酸酶的 Fat Red 7B 混合到含有 LDL 和 HDL 组分的试管中。
冰敷 5 到 10 分钟。将 6.5 mL 混合样品转移到聚碳酸酯厚壁超速离心管中。将试管装入预冷的转头中，离心 3 小时。
离心完成后，去除 1.5 毫升顶层，代表 LDL 分数并保持在 4 摄氏度。从试管底部转移 4 毫升含有 HDL 馏分的试管中，放入 50 毫升无菌试管中。第三步是 HDL 的分离。
将 2 毫升溶液 C、100 微升无核酸酶的脂肪红 7B 和 15 微升 98% β 巯基乙醇混合到管中，其中含有 HDL 组分。检查混合物的密度。将试管装入预冷的转头中，离心 3 小时。
之后，去除两毫升顶层，代表 HDL 分数，并保持在 4 摄氏度。必须从脂蛋白组分中去除过量的盐分，以避免干扰随后的琼脂糖凝胶电泳和 PCR。在本视频中，将仅演示 HDL 馏分的脱盐和浓缩。
向 HDL 馏分中加入 13 毫升冷 PBS，并转移到截留分子量为 10K 的离心过滤装置中。在摆动桶式转子中以 4000 倍 g 和 4 摄氏度离心 30 分钟。使用 13 mL 冷 PBS 对 HDL 馏分进行第二次脱盐，并像以前一样离心。
离心后，除去含脂蛋白的溶质，并保持在四摄氏度。为了评估分离的脂蛋白的质量和纯度，使用人脂蛋白标准品进行琼脂糖凝胶电泳，作为大小参考。不含 β 巯基乙醇的分离结果具有代表性，结果表明 HDL 馏分不受 VLDL 的任何污染，并表现出典型的 α 迁移率。
然而，由于脂蛋白污染，HDL 组分也显示出微量的 β 迁移率。在最后的离心步骤中，向溶液 C 中添加 β 巯基乙醇可有效去除 HDL 组分中的所有污染脂蛋白。为了证明定量使用该方法纯化的人 HDL 中携带的 micro RNA 的可行性，通过实时定量 PCR 扩增了两种不同的 micro RNA。
在这些扩增图中，水平线表示检测阈值。从六个样品中获得的分离 HDL 的代表性实时 PCR 数据显示，两种 micro RNA 的检测一致。最后，熔解曲线分析清楚地显示两种 micro RNA 具有不同的单峰，这与前面的 PCR 中的特异性扩增一致。
一旦掌握，这项技术可以在 9 小时内完成，如果作得当，还可以进行脱盐程序。在尝试此过程时，请务必始终在 4 到 8 摄氏度下工作。并在超速离心前调整每个脂蛋白组分的密度。
按照这个程序，可以执行其他方法，例如电子显微镜，以回答其他问题，例如 HDL 的纯度。开发后，这项技术将使代谢综合征领域的研究人员能够在疑似脂肪肝患者的人类中探索 HDL 相关的 micro RNA 作为生物标志物。它还可用于更好地了解 HDL 的功能及其改变细胞生物学的分子机制。
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概述
本文介绍了一种简化的方法，用于快速从人类血浆中分离纯化的高密度脂蛋白（HDL），以促进microRNA分析。该技术旨在增强对HDL在健康和疾病中的分子机制和保护功能的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 心脏病学
背景
- MicroRNA是关键的调节器和潜在的治疗靶点。
- HDL被认为以高密度携带miRNA。
- 了解HDL的作用可以影响肝病学和心脏病学。
- 当前的方法可能耗时较长并需要较大的样本体积。
研究目的
- 开发一种快速从人类血浆中分离HDL的方法。
- 促进研究目的的microRNA分析。
- 提高研究HDL保护功能的效率。
使用的方法
- 收集空腹外周静脉血样本。
- 多次离心步骤以获得血浆。
- 使用密度计测量血浆密度。
- 分离适合miRNA分析的HDL。
主要结果
- 该方法允许从较小的样本体积中快速分离HDL。
- 预先分离的HDL microRNA可以有效分析。
- 有潜力回答肝病学和心脏病学中的关键问题。
- 改进对HDL分子机制的理解。
结论
- 这种简化的方法增强了对HDL和miRNA的研究。
- 它为研究人员提供了一种时间高效的方法。
- 该技术可能带来疾病机制的新见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of miRNAs from highly purified HDL enables high-throughput biomarker discovery and mechanistic studies in metabolic and cardiovascular disease pipelines. This streamlined protocol reduces sample volume and processing time, supporting scalable translational research and portfolio-wide biomarker validation. The method enhances predictive confidence in miRNA-based diagnostics and therapeutic target evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of HDL-associated miRNAs as functional biomarkers in disease-relevant pathways.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the molecular cargo of HDL in metabolic syndromes.
- Facilitates target validation by providing purified miRNA samples for downstream functional assays.
Screening & Assay Development
- Delivers high-purity HDL fractions suitable for standardized miRNA quantification workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing contamination from exosomes and other lipoproteins.
- Accelerates screening readiness for miRNA biomarker panels in clinical research settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA isolation with translational biomarker strategies for metabolic and cardiovascular indications.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by providing consistent miRNA profiles from human samples.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by generating robust, quantitative miRNA data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, high-throughput miRNA isolation from HDL, supporting both early biomarker discovery and downstream validation.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of HDL-mediated miRNA signaling and inter-organ communication.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative miRNA outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers high-quality miRNA samples for qPCR and electrophoretic purity assessment, supporting comparative analyses.
- Translational Research: Facilitates alignment of miRNA biomarker profiles with clinical phenotypes in metabolic disease cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple disease models and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in miRNA biomarker and target studies.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time, enabling higher throughput.
- Strategic Value: Supports robust go/no-go decisions for miRNA-based diagnostic and therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of miRNA targets and biomarkers across indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultracentrifugation and RNA handling to ensure purity and yield.
- Needs access to high-speed centrifuges, densitometers, and molecular biology infrastructure.
- Demands strict temperature control and density adjustment for reproducibility.
- Standardization across teams is essential for cross-study comparability.
- Sample throughput may be limited by centrifugation capacity and operator proficiency.
