在参与宿主因素的高通量筛选基于显微镜的检测方法布鲁氏菌 Hela细胞感染
2016年8月5日
描述了两种基于显微镜的高通量筛选布鲁氏菌感染相关宿主因子的测定法。进入检测检测布鲁氏菌进入所需的宿主因子，终点检测检测细胞内复制所需的宿主因子。虽然适用于替代方法，但 HeLa 细胞中的 siRNA 筛选用于说明实验步骤。
这种基于显微镜的高通量检测的总体目标是鉴定与 HeLa 细胞布鲁氏菌感染有关的宿主因子。该方法可以帮助回答宿主病原体相互作用领域的关键问题，例如识别促进或阻止细胞内病原体布鲁氏菌定植的宿主蛋白。该技术的主要优点是，从兽医实验室到图像分析的半自动化工作流程允许机器人和高效的高通量创建实验。
因此，这种方法可以使用 siRNA 筛选深入了解布鲁氏菌宿主相互作用。大多数方案可应用于其他筛选策略。例如，或 siRNA 文库。
根据文本方案培养 HeLa 细胞并制备带有 siRNA 的筛选板后，通过在 300 倍 G 和室温下离心 20 分钟来解冻黑色 384 孔板。使用不含 FCS 的室温 dmem 制备转染培养基。将转染试剂稀释 1 至 200，并在使用前仔细混合。
使用试剂分配器向 384 孔板的每个孔中加入 25 μL 转染培养基，并通过来回移动板来混合溶液。将板在室温下孵育 1 小时，以形成 siRNA 转染试剂复合物。同时，通过吸出培养基并在 PBS 中加入 2.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 来制备 HeLa 细胞，以洗涤 75 平方厘米烧瓶的亚汇合细胞一次。
然后加入 1.5 毫升新鲜胰蛋白酶，将培养瓶转移至 37 摄氏度 2 至 3 分钟，直至细胞变圆。使用 10 毫升预热的 dmem 60%FCS 重悬细胞。然后，使用自动细胞计数器对细胞进行计数，然后在含 16%FCS 的 dmem 中制备每毫升 10， 000 个细胞的细胞悬液。
向每个转染试剂孔中加入 50 μL 细胞悬液。每孔产生 500 个细胞。来回移动板以均匀分布细胞。
然后，将板在室温下放置 5 到 10 分钟，让细胞沉淀。使用封口膜密封板。并在潮湿的培养箱中，在 37 摄氏度和 5%C02 的预热铝板上孵育 72 小时。
与三类病原体 B.abortus 一起工作是危险的，需要遵守当地的生物安全法规，包括穿着防护服、防护手套、口罩和护目镜。一天，在感染前，将先前确定量的流产芽孢杆菌发酵剂接种在 50 毫升 TSB KM 培养基中。在 250 毫升螺旋盖瓶中。
使用封口膜密封瓶子，并在 37 摄氏度和 100 RPM 的振荡器上培养细菌过夜，光密度为 600.8 至 1.1。测量细菌培养物的光密度 600。并通过在 dmem 10%FCS 中稀释细菌培养物来制备感染培养基，以达到所需的感染复数。
或者，MOI。使用自动洗板机将转染培养基与 50 μL 感染培养基交换。在通风橱内，将板转移到离心笼中，并以 400 倍 G 和 4 摄氏度离心 384 孔板 20 分钟。
然后，使用封口膜密封板，并在 37 摄氏度和 5%C02 的预热铝板上孵育 4 小时。与自动洗板机孵育后，使用含 10% FCS 的 dmem（每毫升含有 100 微克树突菌）或 GM 来洗涤细胞以灭活细胞外细菌。然后，使用封口膜密封板并将其放回培养箱中预热的铝板上再放置 40 小时以进行终点测定。
要固定细胞，首先使用 PBS 洗涤孔。然后，用 50 微升 3.7% PFA 交换 PBS。在 pH 7.4 时 2 中。
并将细胞在室温下孵育 20 分钟。孵育后，使用 50 微升 PBS 更换固定培养基。要使用自动洗板机对样品进行染色，首先使用 50 微升 1% Triton X-100 的 PBS 溶液 10 分钟以透化细胞。
使用 PBS 洗涤细胞 3 次后，加入 50 μL PBS 和每毫升 1 μg DAPI，并在室温下孵育 30 分钟。然后，使用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后保护它们避光。将板转移到自动显微镜中。
设置显微镜参数。选择 10-X 主观。然后选择与 384 孔板相对应的板格式。
每孔获取 9 个站点。选择 Enable laser-based focusing（启用基于激光的对焦）。并且，专注于板和孔底。
然后，将第一个获取的井设置为初始井，用于查找样本和所有站点以进行站点自动对焦。接下来，对于 DAPI 通道，手动调整焦点的 Z 偏移量。然后，按 Find Sample 将焦点设置在井底。
使用 AutoExposure 功能可以很好地估计曝光时间。手动校正 DAPI 通道的曝光时间，以确保宽动态范围和低过度曝光。利用这个曝光时间对整个板中的多个位点进行成像。
并手动调整曝光时间，直到最亮的像素达到网站上最大亮度的 80% 左右。重复这些步骤，为所有其他通道相应地设置焦点和曝光时间。然后，开始采集整个板。
对于终点测定，使用 DAPI 和 GFP 通道对整个板进行成像。要在终点测定中对染色细胞进行图像分析，在计算阴影模型后，根据文本协议在"查看输出设置"下选择包含图像的输入文件夹和包含结果的输出文件夹。然后，定义图像共有的文本，并加载着色模型。
单击 Start test mode 并确保所有模块的 pause and displays （暂停和显示） 设置均已禁用。启用模块 9 ImageMath 的暂停和显示设置。启用的暂停符号将显示为黄色。
启用的显示功能将显示为睁开的眼睛。接下来，单击 Run （运行） 以运行分析，直到模块 9。在模块 9 中，调整参数，将第二个图像乘以一个值，该值将抑制布鲁氏菌中的 DAPI 信号而不抑制细胞核。
要测试模块的值，请按 Step。右键单击新打开的图像，并将图像对比度设置为 log normalized。反复返回模块 9。
调整参数，将第二个图像乘以，然后再次单步执行模块，直到完全抑制布鲁氏菌信号，同时最小化表示过度减法的黑色区域。为某些模块找到好的参数需要逐步优化参数。反复遍历模块，尝试不同的值并观察对显示结果的影响绝对很重要。
为模块 10 启用 pause 和 display。标识主对象。将参数 Lower bound on threshold 设置得足够高，以便分割 nuclei 并忽略 background。
要确定模块上的好值，请右键单击输入图像并显示直方图，其中峰值通常表示背景。从背景强度开始，增加参数，直到实现输出图像中所示的细胞核的良好分割。图像分析管道的目标是识别包含复制细菌的细胞。
这是通过为细胞核、核周和 Voronoi 细胞体中的病原体信号设置不同的阈值来实现的。为模块 15 启用 pause and display。筛选对象，如前所述，然后按 Run。
将参数 minimum 值设置得足够高，以便仅保留细胞核中具有清晰可见布鲁氏菌的细胞，并过滤掉所有其他细胞。要识别一个好的值，请单步执行模块并显示输出图像。逐步增加该值，直到仅保留细胞核处具有清晰可见布鲁氏菌的细胞。
根据文本协议过滤模块 16 和 17 中细胞核周围有细菌的细胞和 Voronoi 细胞体后，退出测试模式并取消选中模块旁边的所有眼睛符号，以确保在运行完整分析之前没有任何模块显示其显示。最后，按 Analyze Images 开始分析。分析完成后，检查生成的 PNG 图像以及 CSV 电子表格，以确保分析在整个板中可靠运行。
根据文本协议进行入境检测和感染评分。该图显示了在终点检测中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。鉴定了 DAPI 染色的 HeLa 细胞核。
围绕细胞核的 8 像素宽的细胞核周围。并计算了通过细胞核延伸 25 像素的 Voronoi 细胞体。如果病原体信号在至少一个区室中超过相应的阈值，则认为细胞已感染。
布鲁氏菌需要作用重排才能成功参与宿主细胞。因此，ARP23 的耗竭是 siRNA 筛选的合适阳性对照。ARPC3 的耗竭减少了感染后 2 天细菌增殖的细胞数量。
与加扰处理的对照细胞相比。与此图中的对照细胞相比，可量化观察到自动图像分析减少了 ARPC3 耗尽的 HeLa 细胞的感染。与对照细胞相比，ARPC3 的耗竭也显示进入试验中布鲁氏菌感染减少。
从黄色描绘的细胞内布鲁氏菌数量减少中可以看出。最后，通过自动图像分析对感染进行定量证实，由于 ARPC3 的耗竭，感染细胞的数量以及感染细胞中的细胞内细菌数量减少。一旦掌握，该协议可以在实验开始后的一周半内给出图像分析结果。
在尝试此过程时，请务必仔细查看图像分析结果，以确保所选参数在整个板中表现良好。按照这个程序，可以执行其他方法，如生命细胞成像，以回答其他问题。就像当您贩卖时，某个宿主因素会与 Brucella 相互作用。
或者基因的耗竭如何影响感染的细胞内动力学。开发后，这项技术为感染生物学领域的研究人员在 HeLa 细胞测定中探索布鲁氏菌感染所需的宿主因子铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何识别促进或阻止细胞内病原体流产布鲁氏菌成功定植 HeLa 细胞的宿主因素有很好的了解。
不要忘记，与流产布鲁氏菌一起工作可能非常危险，必须严格遵守当地的生物安全法规。
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概述
本文描述了两种基于显微镜的高通量筛选分析，用于识别与HeLa细胞中布鲁氏菌感染相关的宿主因子。入口分析专注于布鲁氏菌进入所需的因子，而终点分析评估那些对细胞内复制必需的因子。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 病原体-宿主相互作用
背景
- 布鲁氏菌是一种可逃避宿主免疫反应的细胞内病原体。
- 了解宿主因子可以帮助开发治疗策略。
- 高通量筛选允许高效地识别这些因子。
- HeLa细胞作为研究布鲁氏菌感染的模型。
研究目的
- 识别促进或抑制布鲁氏菌定植的宿主蛋白。
- 提供对宿主-病原体相互作用的洞察。
- 说明在这种情况下使用siRNA筛选的方法。
使用的方法
- 基于显微镜的高通量筛选分析。
- HeLa细胞中的siRNA筛选。
- 用于高效数据收集的自动化工作流程。
- 图像分析以评估宿主因子的参与。
主要结果
- 识别布鲁氏菌入口和复制中涉及的关键宿主因子。
- 证明siRNA筛选的有效性。
- 方法可能应用于其他筛选策略的潜在应用。
- 对布鲁氏菌-宿主相互作用机制的洞察。
结论
- 这些分析提供了一个研究布鲁氏菌感染的强大框架。
- 高通量方法可以加速宿主因子的发现。
- 研究结果可能为对抗布鲁氏菌的未来治疗方法提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microscopy-based high-throughput screening approach enables systematic identification of host factors that modulate Brucella infection in HeLa cells, providing a scalable platform for target validation in intracellular pathogen research. By combining siRNA screening with automated image analysis, the method supports mechanistic de-risking of host-directed therapeutic strategies and improves predictive confidence in early discovery workflows. The assay outputs quantitative infection phenotypes that can inform go/no-go decisions in antimicrobial target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host pathways that promote or prevent Brucella entry and replication, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Uses siRNA-mediated knockdown to functionally validate host factors involved in pathogen colonization.
- Scientific Value: Provides phenotypic readouts that clarify mechanisms of intracellular trafficking and niche establishment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, single-cell infection scoring via fluorescent pathogen detection in labeled host cells.
- Operational Value: Employs automated wide-field microscopy and CellProfiler pipeline for reproducible, high-throughput data acquisition.
- Scientific Value: Distinguishes intracellular from extracellular bacteria using tetracycline-inducible GFP and gentamicin protection for accurate entry assay quantification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Identifies host factors required for Brucella avoidance of lysosomal degradation and ER-derived vacuole replication, informing mechanistic de-risking.
- Operational Value: Supports continuity from hit identification to pathway validation in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Enables assessment of genetic perturbations on intracellular bacterial load, supporting target confidence scoring.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, linking target validation through phenotypic screening to preclinical follow-up by providing quantitative, replication-competent infection readouts in a scalable format.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening for host proteins that modulate Brucella internalization and intracellular survival.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized infection scoring and Z’-compatible dynamic range in 384-well format.
- Analytics: Produces quantitative output metrics including infected cell count and intracellular bacterial burden per cell for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase host factor hits to preclinical validation via defined infection phenotypes in ER-replicative niches.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular microscopy-based platform adaptable to other intracellular pathogens via pathogen labeling and host cell substitution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies through direct visualization of infection compartments.
- Operational Value: Enables semi-automated workflow from transfection to image analysis, increasing throughput and reducing manual variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing reproducible, phenotype-based target validation data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of host-directed targets by quantifying impact on bacterial entry and replication.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, siRNA transfection, and biosafety level 3 practices for Brucella abortus handling.
- Dependent on automated microscopy infrastructure, image analysis software (CellProfiler), and plate handling robotics.
- Necessitates standardization of infection parameters (MOI, incubation times) and fluorescence compensation across channels.
- Involves optimization of segmentation thresholds for nuclei, pathogen signal, and subcellular compartments to ensure accurate single-cell scoring.
- Limited by the need for fluorescent pathogen strains and potential signal interference in high-density infection conditions.
