Name: 在参与宿主因素的高通量筛选基于显微镜的检测方法布鲁氏菌 Hela细胞感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学习基于显微镜的高通量筛选方法，用于鉴定布鲁氏菌感染HeLa细胞中的宿主因子。该半自动化流程结合siRNA筛选与图像分析，可高效识别促进或抑制病原体定植的宿主蛋白。

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本工作得到了瑞士系统生物学计划 SystemsX.ch 框架下研究与技术开发（RTD）项目 InfectX 和 TargetInfectX 的资助，项目编号分别为 51RT 0_126008 和 51RTP0_151029。我们感谢瑞士国家科学基金会（SNSF）提供的资助 310030B_149886。S.H.L 和 A.C. 的工作得到了巴塞尔生物中心“卓越奖学金”国际博士生项目的资助。感谢 Simone Muntwiler 提供的技术支持。我们感谢 Dirk Bumann 提供质粒 pNF106，以及 Jean Celli 提供质粒 pJC43 和 pJC44。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

细菌病原体已进化出多种策略，以操纵真核宿主细胞为其自身利益服务。引起急性感染的病原体通常表现出快速增殖，这往往伴随着免疫系统的显著激活以及感染细胞活力的丧失。相比之下，引起慢性感染的Brucella及其他病原体则能够在宿主细胞内建立长期的相互作用。因此，这些细菌需要在不破坏细胞稳态的前提下，精细调控宿主细胞的功能以利于自身生存。一种在基因组水平上鉴定参与感染过程的宿主细胞因子的常用策略，是利用系统性基因敲低（例如通过siRNA）并结合感染的功能性检测读出结果。本文介绍了适用于基于荧光细菌检测的高内涵、高通量筛选的实验方案。
成功进行大规模筛选的一个重要方面是稳健的自动化图像分析和感染评分。本文所述方法依赖于通过DAPI染色检测细胞核，该方法通常非常可靠，并定义一个感兴趣区域用于测量病原体信号。终点检测利用在核周、细胞核以及Voronoi细胞体中增殖细菌的检测，从而能够可靠地识别被感染的细胞。此外，该方法允许为各个区室设定不同的阈值。虽然在细胞核和核周区域可以设置相对较低的阈值，但在Voronoi细胞体中应采用较高的阈值。这有助于避免检测到来自邻近细胞的GFP信号，...

Brucella 属细菌是革兰氏阴性、兼性胞内寄生的病原菌，属于α-变形菌纲。它们在其自然宿主（如牛、山羊或绵羊）中可引起流产和不育，导致疫区严重的经济损失。布鲁氏菌病是全球最重要的人畜共患病之一，每年导致超过50万例新发人类感染1。人类感染通常通过与受感染动物直接接触或摄入受污染的食物（如未经巴氏消毒的牛奶）而传播。该发热性疾病的症状缺乏特异性，给布鲁氏菌病的诊断带来困难。若未及时治疗，患者可能发展为慢性感染，并出现更严重的症状，如关节炎、心内膜炎和神经病变2。
在细胞水平上 布鲁氏菌 能够侵入吞噬细胞和非吞噬细胞，并在一种称为细胞内区室的结构中进行复制 布鲁氏菌含细菌空泡（BCV）。细菌的内化需要Rac、Rho介导的肌动蛋白细胞骨架重排以及Cdc42的直接激活3在真核宿主细胞内，细菌容纳泡（BCV）沿内吞途径运输，尽管与溶酶体相互作用，细菌仍能避免被降解4液泡ATP酶对BCV的酸化作用是诱导细菌IV型分泌系统（T4SS）表达所必需的5. 研究认为，由 IV 型分泌系统（T4SS）分泌的细菌效应蛋白对于 布鲁氏菌 以建立其复制生态位，因为T4SS的缺失6 或抑制囊泡ATP酶会导致细胞内生态位建立的缺陷7细菌在转运阶段不会进行复制，直到它们 到达内质网来源的液泡区室8一旦发生细胞内增殖，BCV便会与内质网标志物（如calnexin和glucose-6-phosphatase）紧密共定位。6.
分子机制 布鲁氏菌 进入细胞、逃避溶酶体降解并最终在类似内质网的区室中复制的具体机制仍 largely 未知。参与感染不同阶段的宿主因子主要通过靶向性方法或小规模的小干扰RNA（siRNA）筛选实验得以鉴定 黑腹果蝇 细胞9这些研究揭示了各个宿主因素在过程中的作用 布鲁氏菌 感染，但我们对整个过程仍缺乏全面的理解。
本文介绍了利用大规模RNA干扰（RNAi）筛选结合自动化的宽场荧光显微镜和自动化图像分析技术来鉴定人类宿主因子的实验方案。HeLa细胞的反向siRNA转染操作按照先前所述方法10,11进行，仅作轻微修改。该终点检测涵盖了布鲁氏菌（Brucella）胞内生命周期的大部分阶段，但不包括细菌的逸出及对邻近细胞的感染。为了进一步表征在终点检测中鉴定出的候选因子，采用了一种改进的实验方案，用于鉴定参与感染早期阶段的相关因子。
Brucella abortus 菌株可组成型表达 GFP，可用于终点检测，其中允许细菌感染细胞两天。在此期间，细菌进入细胞，迁移至内质网来源的复制生态位，并在核周区域进行复制。高水平的 GFP 信号可用于可靠地检测含有复制细菌的单个细胞。
为了在高通量实验中研究Brucella的侵入过程，必须能够区分细胞内和细胞外的细菌。本文所介绍的方法避免了对细胞内和细胞外细菌进行差异性抗体染色。该方法基于一种表达四环素诱导型GFP并同时组成型表达dsRed的Brucella菌株。组成型dsRed标记物的存在可识别样本中所有存在的细菌。通过在加入无毒性的四环素类似物脱水四环素（aTc）的同时使用庆大霉素（Gm）灭活细胞外细菌，从而诱导GFP表达。细胞膜不通透的抗生素Gm可杀死细胞外细菌，而aTc能够进入宿主细胞，选择性地诱导细胞内细菌表达GFP。利用宽场显微镜，该双报告系统可有效区分单个细胞内细菌（GFP与dsRed信号）和细胞外细菌（仅dsRed信号）。为使细胞内Brucella的GFP表达达到可检测水平，我们发现aTc诱导4小时即可获得可靠的信号。类似的选择性诱导GFP表达策略此前已被用于研究细胞内Shigella12。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 螺口瓶</td><td>康宁</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%）</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10倍浓度储存液，用PBS按1:10稀释</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 细胞计数仪</td><td>默克密理博</td><td>PHCC20060</td><td>可使用其他细胞计数设备</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>可剥离铝箔</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>试剂分配器： &quot;Multidrop 384 试剂分配器&quot;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5840150</td><td>可使用其他试剂分配器。</td></tr><tr><td>转染试剂： &quot;Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>自动酶标洗板机 &quot;ELx50-16型洗板机&quot;</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>该洗板机配备适用于384孔板的16通道歧管，可置于生物安全柜内使用，且带有覆盖板孔的盖子，可在洗涤过程中减少气溶胶的产生。也可使用具有类似功能的其他洗板机。</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>盐酸无水四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &amp;#956;g/ml 溶液溶于 100% 乙醇中，保存于 -20 &amp;deg;C 避光保存于铝箔中</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>溶于0.2 M HEPES缓冲液，pH 7.4。储存于-20 &amp;deg;C，在使用前一天新鲜解冻。注意：PFA 通过吸入、皮肤接触或吞咽具有毒性。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>罗氏</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>随机对照siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;布鲁氏菌 2308&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43（&lt;em&gt;apHT::GFP&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td>Celli &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>pAC042.08 (&lt;em&gt;apht::dsRed, tetO::tetR-GFP&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td>构建：pJC44 &lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; 用EcoRI进行消化，随后使用Klenow酶生成平末端，再用SalI进行消化。使用引物prAC090和prAC092从pNF106中扩增出TetR-GFP。经SalI消化后，将TetR-GFP产物连接至已消化的pJC44载体中。</td></tr><tr><td>引物 prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>引物 prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>IXM 成像 MSCOPE</td><td>配备精密电动Z轴载物台的自动化细胞成像显微镜。可根据需要选用以下指定的自动化显微成像系统的替代设备，以及硬件和软件的替代组件。</td></tr><tr><td>高速激光自动对焦</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X 物镜</td><td>尼康&amp;nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>数值孔径 0.50，工作距离 1.20 mm，微分干涉差（DIC）棱镜：10倍，弹簧加载</td></tr><tr><td>Photometrics CoolSNAP HQ 单色 CCD 相机</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 × 1,040 成像像素，6.45 × 6.45 &amp;micro;m 像素，12 位数字化</td></tr><tr><td>MetaXpress 软件</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>光源引擎。使用的光源如下：紫色（DAPI）、青色（GFP）、绿色/黄色（RFP）</td></tr><tr><td>DAPI单波段激发器</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>单波段DAPI发射器</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>单波段二向色镜用于 DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>用于GFP的单波段激发器</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>单波段GFP发射器</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>用于GFP的单波段二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>RFP单波段激发器</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>单一带通发射滤光片用于RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>用于RFP的单波段二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 hela细胞感染

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella 属细菌是兼性胞内病原体，可感染动物这一自然宿主。人类感染通常由直接接触受感染动物或摄入被污染的食物引起，可导致严重的慢性感染。
布鲁氏菌 可侵入专业和非专业的吞噬细胞，并在内质网（ER）来源的液泡内复制。宿主细胞中支持该过程所必需的因子包括 布鲁氏菌 进入宿主细胞、逃避溶酶体降解以及在类似内质网的区室中复制的机制在很大程度上仍不清楚。本文描述了两种用于鉴定参与这些过程的宿主因子的检测方法 布鲁氏菌 在HeLa细胞中的侵入与复制。本实验方案描述了RNA干扰技术的应用，但也可采用其他筛选方法。该检测基于使用自动化宽场显微镜，对荧光标记的细菌在荧光标记的宿主细胞中的定位进行检测。荧光图像通过CellProfiler中标准化的图像分析流程进行分析，可实现基于单细胞的感染评分。
在终点检测实验中，于感染后两天测定细胞内复制情况。这使得细菌有足够时间转运至其复制生态位，并在细菌进入宿主细胞约12小时后启动增殖。因此，成功建立细胞内生态位的布鲁氏菌（Brucella）将在宿主细胞内大量增殖。由于细胞内复制的细菌数量远超过单个细胞外或非复制性的细胞内细菌，因此可使用持续表达GFP的菌株，通过强烈的GFP信号来识别被感染的细胞。
相比之下，在侵入实验中，区分细胞内和细胞外细菌至关重要。此处使用一种编码四环素诱导型GFP的菌株。通过添加庆大霉素灭活细胞外细菌的同时诱导GFP表达，可根据GFP信号区分细胞内与细胞外细菌，仅细胞内细菌能够表达GFP。这使得在细胞内增殖启动之前，即可稳定地检测单个细胞内细菌。

图1A展示了在终点检测中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。通过DAPI染色识别HeLa细胞的细胞核，计算出围绕细胞核、宽度为8个像素的核周区域，以及通过将细胞核扩展25个像素得到的Voronoi细胞体。由于细菌主要在核周区域增殖，因此该区域内的GFP荧光强度是区分感染与非感染细胞最可靠的指标。在某些情况下，细菌被发现可在核周区域外增殖，或与细胞核存在较大程度的重叠。因此，这两个额外的区域也被纳入感染细胞的识别考量。图像分割及GFP荧光强度的测量均使用图像分析软件CellProfiler 2完成。
Brucella 成功侵入宿主细胞需要肌动蛋白的重排3。因此，敲低肌动蛋白重塑相关组分可作为siRNA筛选的合适阳性对照。我们发现，通过siRNA介导敲低参与肌动蛋白聚合的Arp2/3复合物组分，可显著抑制Brucella对HeLa细...

本文介绍了两种基于显微镜的高通量筛选方法，用于研究参与Brucella感染的宿主因子。Brucella入侵检测法用于鉴定宿主细胞中支持其入侵的关键因子，而终点检测法则用于鉴定支持其胞内复制的宿主因子。尽管这些方法可适用于其他实验体系，本文以HeLa细胞中的siRNA筛选为例，详细说明实验方案的操作流程。

基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染

布鲁氏菌属（Brucella）是兼性胞内病原体，其自然宿主为动物。人类感染通常由……引起。

本高通量显微镜检测方法的总体目标是鉴定参与布鲁氏菌感染 HeLa 细胞的宿主因子。该方法有助于解答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如鉴定促进或抑制胞内病原体布鲁氏菌定植的宿主蛋白。该技术的主要优势在于，从兽医实验室到图像分析的半自动化工作流程可利用机器人实现高效、高通量的实验构建。因此，该方法可利用siRNA筛选来深入研究布鲁氏菌与宿主的相互作用。大部分实验方案也可应用于其他筛选策略，例如siRNA文库。按照文本方案培养HeLa细胞，并用siRNA制备筛选板后，通过在室温下以300 × g离心20分钟，使一块黑色384孔板解冻。使用不含FCS的室温DMEM制备转染培养基，将转染试剂按1:200稀释，并在使用前轻轻混匀。使用试剂分配器向384孔板的每个孔中加入25微升转染培养基，并通过前后移动平板混合溶液。将平板在室温下孵育1小时，以使siRNA转染试剂复合物形成。在此期间，通过吸除培养基，并向75平方厘米培养瓶中半融合的细胞加入2.5毫升含0.05%胰蛋白酶EDTA的PBS溶液，洗涤细胞一次，以制备HeLa细胞。然后加入 1.5 毫升新鲜胰蛋白酶，将培养瓶转移至 37 摄氏度孵育 2 到 3 分钟，直至细胞变圆。使用 10 毫升预热的含 60% FCS 的 DMEM 重悬细胞。接着，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并在含 16% FCS 的 DMEM 中制备每毫升 10,000 个细胞的细胞悬液。向每孔转染试剂中加入 50 微升细胞悬液，使每孔含有 500 个细胞。轻轻前后移动培养板，使细胞均匀分布。然后，将培养板置于室温下静置5至10分钟，使细胞沉降。用封口膜密封培养板，并将其置于加湿培养箱中，在预热的铝板上于37摄氏度、5% CO₂条件下孵育72小时。操作三类病原体布鲁氏菌（B. abortus）具有危险性，必须遵守当地的生物安全规定，包括穿戴防护连体服、防护手套、口罩和护目镜。感染前一天，将先前确定数量的布鲁氏菌起始培养物接种于50毫升TSB KM培养基中，置于250毫升带螺口盖的瓶内。用封口膜密封瓶子，在摇床中于 37 摄氏度、100 转/分钟条件下培养细菌过夜，使光密度达到 600 nm 处的 OD 值为 0.8 至 1.1。测定细菌培养物在 600 nm 处的光密度值，并通过将细菌培养物用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基稀释，制备感染用培养基，以达到所需的感染复数。或者，使用自动酶标洗板机将转染培养基更换为50 µL感染培养基。在生物安全柜内将培养板转移至离心机转子中，于400 ×g、4 °C条件下离心20分钟。然后，用封口膜密封培养板，将其置于预热的铝板上，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育4小时。孵育结束后，使用自动洗板机，以含10% FCS并添加100微克/毫升链霉素或GM的DMEM洗涤细胞，以灭活细胞外细菌。随后，再次用封口膜密封培养板，放回孵育箱内预热的铝板上，继续孵育40小时，用于终点检测。为了固定细胞，首先使用 PBS 清洗孔板。然后将 PBS 更换为 50 微升的 3.7% PFA，pH 值为 7.4。在室温下孵育细胞20分钟。孵育结束后，使用50微升PBS更换固定液。使用自动化板式洗板机对样品进行染色时，首先加入50微升含1% Triton X-100的PBS溶液，作用10分钟，以通透细胞。使用 PBS 洗涤细胞三次后，加入 50 µL 含 1 µg/mL DAPI 的 PBS，室温避光孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞三次，并避免光照。将培养板转移至自动显微镜下进行观察。设置显微镜参数。选择10倍物镜，然后选择与384孔板相对应的板型格式。每孔采集九个位点。选择启用基于激光的聚焦，并对焦于培养板和孔底。然后，将首次获取的孔设为寻找样本和多点自动对焦的初始孔。接着，针对DAPI通道手动调整Z轴偏移以实现聚焦。然后，按下“寻找样本”以将焦点设定在孔底。使用自动曝光功能获取曝光时间的良好估计值。手动调整DAPI通道的曝光时间，以确保具有较宽的动态范围且过曝程度较低。使用此曝光时间对整个孔板中的多个位点进行成像。手动调整曝光时间，直至最亮像素的亮度达到各位点最大亮度的约80%。针对所有其他通道，重复上述步骤，相应地设置焦距和曝光时间。然后开始全板图像的采集。对于终点检测，使用 DAPI 和 GFP 通道对整块板进行成像。若需对终点检测中染色的细胞进行图像分析，在根据文本方案计算出明场校正模型后，于“查看输出设置”下选择包含图像的输入文件夹和存储结果的输出文件夹。随后，定义图像名称中共同包含的文本，并加载明场校正模型。单击“开始测试模式”，并确保所有模块的暂停和显示设置均已禁用。仅启用第九模块 ImageMath 的暂停和显示设置。启用后，暂停符号将显示为黄色。启用的显示功能将显示为睁开的眼睛。接下来，单击“运行”以执行至第九模块的分析。在第九模块中，调整参数“将第二幅图像乘以”的数值，以抑制布鲁氏菌中的DAPI信号，同时不抑制细胞核信号。要测试模块的数值，请点击“Step”。右键单击新打开的图像，并将图像对比度设置为对数归一化。然后反复返回至第九个模块。调整参数以乘以第二张图像，并再次逐步执行该模块，直至布鲁氏菌信号被完全抑制，同时尽量减少显示过度减除的黑色区域。为特定模块寻找合适的参数需要逐步优化参数。务必反复执行这些模块，尝试不同的参数值，并观察其对显示结果的影响。启用模块10的暂停和显示功能。识别主要物体。设置阈值的参数下限，使其足够高，以实现细胞核的分割并忽略背景。为了确定一个合适的阈值，可先在模块中逐步调整，然后右键单击输入图像并显示直方图，其中峰值通常代表背景。从背景强度开始，逐步增加参数，直至输出图像中实现良好的细胞核分割效果。图像分析流程的目标是识别出含有正在复制的细菌的细胞。通过为病原体信号在细胞核、核周区域和Voronoi细胞体中设置不同的阈值来实现此步骤。启用模块15的暂停和显示功能。如前所述，对对象进行过滤，然后点击运行。将参数最小值设置得足够高，以确保仅保留细胞核内布鲁氏菌清晰可见的细胞，其余细胞均被过滤掉。为确定合适的数值，可逐步调整该模块并显示输出图像，逐步提高该值，直至仅保留细胞核位置布鲁氏菌清晰可见的细胞。根据文本方案，筛选出第16和第17模块中细胞核周含有细菌且具有Voronoi细胞体的细胞后，退出测试模式，并取消勾选各模块旁的所有眼睛符号，以确保在运行完整分析之前，没有任何模块显示其图像。最后，点击“Analyze Images”以开始分析。分析完成后，检查生成的PNG图像以及CSV表格文件，确保整块板的分析结果可靠。根据文本方案进行侵入实验和感染评分。该图展示了在终点实验中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。使用DAPI染色的HeLa细胞细胞核已被识别。计算围绕细胞核、宽度为8像素的核周区域，以及通过将细胞核延伸25像素获得的Voronoi细胞区域。若病原体信号在至少一个区室中超过相应阈值，则判定该细胞被感染。布鲁氏菌成功侵入宿主细胞需要肌动蛋白的重排。因此，ARP2/3复合物的耗竭可作为siRNA筛选的合适阳性对照。感染两天后，ARPC3的耗竭减少了含有增殖细菌的细胞数量。与经乱序序列处理的对照细胞相比。通过自动图像分析可定量观察到，ARPC3 耗竭的 HeLa 细胞感染率较对照细胞降低，如本图所示。在入侵实验中，ARPC3 耗竭同样显示出布鲁氏菌感染率较对照细胞下降。如图中显示的黄色细胞内布鲁氏菌数量减少所示。最后，通过自动图像分析对感染情况进行定量，结果证实，ARPC3 耗竭可降低感染细胞的数量以及感染细胞内细菌的数量。掌握本方案后，实验开始约一周半内即可获得图像分析结果。在尝试该实验流程时，重要的是要仔细审查图像分析结果，以确保所选参数在整个培养板范围内均能良好地发挥作用。完成该流程后，可进一步开展其他方法，如活细胞成像，以回答更多科学问题，例如在细菌易位过程中，特定宿主因子是否与布鲁氏菌发生相互作用。或者基因的耗竭如何影响细胞内感染的动态过程。该技术建立后，为感染生物学领域的研究人员探索布鲁氏菌在HeLa细胞感染中所需的宿主因子提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定促进或抑制胞内病原体流产布鲁氏菌成功定植HeLa细胞的宿主因子。请注意，操作布氏杆菌（Brucella abortus）可能具有极高危险性，必须严格遵守当地的生物安全法规。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在参与宿主因素的高通量筛选基于显微镜的检测方法<em&gt;布鲁氏菌</em&gt; Hela细胞感染

来源： 卡萨诺瓦，A. 等基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染 视频实验杂志 (2016)本视频展示了利用siRNA介导的STING基因敲低技术，对上皮细胞中布鲁氏菌（Brucella...

高通量细胞内成像 布鲁氏菌 abortus 宿主上皮细胞感染

我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

由胞内病原体引起的液泡破裂的单细胞测量

该技术提供了一种方法，用于收获、标准化并定量在感染哺乳动物细胞之前，经天然原生动物宿主细胞预培养的细菌病原体的胞内生长情况。该方法可进行修改，以适用于多种不同的宿主细胞作为启动阶段的培养系统，以及不同类型的靶细胞。...

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我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

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一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

Coxiella burnetii 转座子突变体的构建及多表型高内涵筛选

开发了一种高通量、实时的检测方法，可同时实现：（1）筛选靶向胞内细菌病原体的真核细胞穿透性抗菌剂；（2）评估抗菌剂对真核细胞的细胞毒性。随后，该技术经过改进，并结合数字分配技术，从而能够便捷地开展高分辨率的剂量-反应以及二维和三维协同作用研究。...

高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。...

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我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

本研究建立了一种用于高通量筛选的检测方法 脓肿分枝杆菌...

抗分枝杆菌高通量药物筛选的检测方法开发

学习基于显微镜的高通量筛选方法，用于鉴定布鲁氏菌感染HeLa细胞中的宿主因子。该半自动化流程结合siRNA筛选与图像分析，可高效识别促进或抑制病原体定植的宿主蛋白。

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