用于RNA和DNA提取的福尔马林固定石蜡包埋组织芯的制备

本实验的总体目标是从存档的福尔马林固定石蜡包埋组织芯中依次提取 RNA 和 DNA。这是一种用于获取组织芯的方案，在获得的组织芯中可同时提取 RNA 和 DNA。该方案的主要优势在于，能够从组织块中精确定位的区域显著提高 RNA 和 DNA 的得率。

该操作流程主要在存档的前列腺癌组织中开发完成，也可应用于其他类型的存档组织。本方法的可视化演示至关重要，因为组织打孔步骤在研究实验室中并不常用。

大多数研究实验室采用切片方式，这会更快地消耗组织，并为样本引入显著的异质性。首先，检查显微镜载玻片，并使用细头永久性记号笔标出感兴趣区域。接着，裁剪一块足够大的石蜡膜，以覆盖显微镜载玻片上的感兴趣区域。

然后，将薄膜牢固地贴在载玻片上，将薄膜边缘包裹在载玻片四周，以防止其滑动。使用细头永久性记号笔，在薄膜上勾画出整个组织以及组织内感兴趣区域的轮廓。接着，将薄膜从载玻片上取下，并转移至对应的组织块上。

通过翻转或旋转薄膜，使其上整个组织的轮廓与组织块中观察到的组织形状相匹配。将薄膜部分牢固地按压在组织块表面，以防止滑动。使用永久性记号笔的笔尖，在感兴趣区域的轮廓沿线轻轻按压形成浅但可见的凹痕，然后取下薄膜。

接下来，将0.6毫米打孔器组中的受体打孔针尖浸入含有1毫升次氯酸钠溶液的1.5毫升微量离心管中，上下移动数次以清洗针尖。随后用含有70%乙醇的离心管重复清洗，再用清水冲洗。然后将清洗后的打孔针插入目标区域，深度达3毫米，再抽出。

使用触控笔将核心推出打孔器，释放到低吸附的微量离心管中。向含有组织核心的微量离心管中加入1毫升二甲苯，剧烈涡旋10秒。然后置于50°C的加热块中3分钟。

孵育结束后，在室温下以最大速度离心两分钟。离心完成后，将组织芯置于冰上放置五分钟，使蜡质残留物凝固。随后，使用移液枪头小心移除在弯月面周围积聚的石蜡以及上清液。

然后，重复二甲苯处理步骤。去除石蜡与二甲苯混合液后，加入1 mL 100%乙醇，并剧烈涡旋振荡10秒。以最大转速离心2分钟后，小心弃去乙醇。

在开始均质化之前，再重复进行一次乙醇洗涤。均质化前，将脱蜡的组织芯重悬于700 µL的100%乙醇中。使用电动组织匀浆器调至中等速度，将组织芯研磨成细小颗粒。

为了获得最佳的 DNA 和 RNA 产量，需要对组织芯进行充分的匀浆。接下来，分别在多个 15 毫升离心管中加入约十毫升漂白剂、RNase 去活化溶液和 70% 乙醇。样品匀浆完成后，按顺序将匀浆探针在每种清洗溶液中进行清洗。

在洗涤阶段，以最高转速运行匀浆器。用纸巾擦拭探头，并在处理下一个样品前确保探头完全干燥。目视检查探头刀片上是否有残留的组织碎片，如果发现残留物，需再次清洁探头。

匀浆后，用100%乙醇将样品体积调至1毫升，然后以最大速度离心15分钟。小心吸除乙醇，并将沉淀物在空气中干燥约15至20分钟，随后开始蛋白酶K提取。将沉淀物重悬于150 µL蛋白酶K消化缓冲液中，并轻轻弹动离心管以松散沉淀物。

建议过夜蛋白酶K消化以获得更高的DNA回收率。加入10 µL耐高温蛋白酶K，通过轻弹管壁混匀。在56 °C条件下孵育15分钟，并轻微振荡。

将离心管置于冰上孵育 3 分钟。冷却后，在最大转速下离心 15 分钟。随后，不扰动沉淀物，小心地将每份上清液转移至新的微量离心管中，用于 RNA 纯化。

采用书面方案中优化的流程提取RNA和DNA，该流程包括延长组织消化时间以用于DNA提取。利用此方法可从较陈旧的甲醛固定石蜡包埋组织样本中回收RNA和DNA。核酸从样本保存时间为3至14年的前列腺癌样本中实现了共提取。

平均产量为 2,270 纳克 RNA 和 820 纳克 DNA。有趣的是，组织样本的年龄与核酸回收量之间没有显著相关性。总体而言，不同样本中的 RNA 和 DNA 产量呈正相关，尽管在大多数情况下，回收的 RNA 量超过 DNA 量的两倍以上。

为了验证采用本方案提取的基因组DNA的性能，对来自存档前列腺癌样本的亚硫酸氢盐转化DNA提取物进行了甲基化特异性PCR扩增。ALU重复元件被用作甲基化对照，在各样本间显示出极小的差异。GSTP1是已知在前列腺癌中呈高甲基化的基因，当使用从良性样本中提取的DNA进行甲基化特异性PCR时，未检测到可扩增信号。

侵袭性前列腺癌患者的DNA样本显示出可检测到的QPCR循环阈值，低于惰性前列腺癌细胞的样本，表明GSTP1在侵袭性前列腺癌中甲基化程度升高。一旦掌握该技术，若操作得当，RNA检测可在三到四小时内完成；而对于DNA，在经过过夜消化后，可在四小时内完成。该技术应能帮助分子病理学领域的研究人员探索多种癌症中的诊断性DNA和RNA生物标志物。

观看本视频后，您应能充分掌握如何制备组织芯样，以从存档组织块中精确定位的感兴趣区域提取 DNA 和 RNA。