通过整株植物热烫或提取物热处理比较烟草宿主细胞蛋白去除方法

本组实验的总体目标是利用加热沉淀植物宿主细胞蛋白，从而促进重组生物制药蛋白的后续层析纯化。该方法有助于简化工艺开发并提高产物稳定性，例如通过激活宿主蛋白酶实现。

该技术的主要优势在于易于整合到现有的蛋白酶体系中，并可快速适用于不同的靶蛋白。演示该实验步骤的是我实验室的硕士生Hannah Gruchow。加热沉淀宿主细胞蛋白。

例如从烟草叶片中提取。按照文本方案培养烟草植株后，将一个八升工作体积的水浴装置置于隔热的聚苯乙烯泡沫桶中。将整个装置转移到磁力搅拌器上，并将磁力搅拌子放入水浴中。

然后用非磁性支撑垫片包围搅拌子，使垫片高出搅拌子约一厘米，后续实验步骤中将在此上方放置聚丙烯篮。向水浴中加入八升缓冲液。

然后将一个 23 × 23 × 23 厘米的聚丙烯篮子放在支撑瓷砖上。确保支撑物不会妨碍搅拌子的旋转，并且篮子完全浸没在液体中。随后取出篮子。

使用可调恒温器将水浴加热至70摄氏度。达到目标温度后，至少等待15分钟，以确保整个装置达到热平衡。接下来，从烟草叶片中制备150克的等分样品。

将一份等分试样放入篮中，避免对叶片造成不可逆的压缩或损伤（例如撕裂）。小心而迅速地将篮子浸入热液中，并置于支撑瓷砖上。

然后在篮子上方放置一块不锈钢块以防止其上浮。将叶片在烫漂液中孵育5分钟，或根据实验设计选择合适的时间。

在整个孵育期间监测液体温度。孵育结束后，小心地将篮子从烫漂液中取出，让叶片沥干30秒。然后将植物叶片从篮中取出，转移至均质机中，并立即按照文本中的实验方案开始提取。

在搅拌容器中加热沉淀宿主细胞蛋白（HCPs）。将水浴锅放置于磁力搅拌器上，并将一个两升的不锈钢容器放入水浴锅中，使容器中心与搅拌器中心对齐。将磁力搅拌子放入不锈钢容器中。

用提取缓冲液填充容器，然后加入去离子水。将水浴加水至不锈钢容器上边缘以下五厘米处。

使用聚苯乙烯泡沫盖覆盖。接着，通过盖子上的一个缓冲孔将温度计插入不锈钢容器中。然后将水浴温度设定为78摄氏度，将整个装置孵育15分钟以达到热平衡。

当组装体系达到平衡后，倒空容器，并在容器仍处于水浴中时，倒入300毫升提取液，同时启动计时器。以150 rpm的速度搅拌提取液，孵育5分钟。在孵育期间，确保提取液温度达到70摄氏度并维持至少2分钟。

孵育结束后，将热水浴从磁力搅拌器上取下。取出不锈钢容器，放入装有冰水的桶中，然后将桶放在搅拌板上。

确保植物匀浆以150 rpm充分振荡。将温度计插入提取液中，并孵育至温度达到20摄氏度或指定温度。根据文本方案设置两个工作体积为八升的水浴后，使用去离子水注满第一个水浴。

将恒温器设定为74.5摄氏度，使组装体系孵育15分钟以达到热平衡。通过将一个0.5升的塑料烧杯放入一个1升的塑料烧杯中，制备隔热储存容器，并使用棉花等隔热材料填充间隙。

使用 LS24 管路，将一端连接至热交换器，另一端连接至蠕动泵，并将另一端连接至出水软管。将管路两端连同温度计一起放入保温储存容器中，并加入 300 毫米的提取缓冲液将其充满。

接下来，将热交换器放入热水浴中，并以每分钟300毫升的流速启动蠕动泵。三分钟后，确保容器内的温度达到70摄氏度，约低于水浴设定温度4.5摄氏度。

弃去绝缘容器中的提取缓冲液，制备300毫升的植物提取物等分试样。取其中一份等分试样加入绝缘容器中。然后以每分钟300毫升的流速将植物提取物通过热交换器循环5分钟。

然后确保提取物在三分钟后温度达到70摄氏度，或等于实验设计中设定的温度。五分钟后，将换热器转移至冰水浴中。在继续下一步操作前，确保提取物的温度低于30摄氏度。

将连接至蠕动泵的进液管从保温容器中取出，并继续泵送以收集热交换器内残留的受热析出的植物提取物，随后停止泵送。

为进行植物提取物的袋式过滤，将袋式滤器安装到已装入过滤器外壳的相应支撑篮中。在支撑篮下方放置一个一升容量的容器，并以每分钟150毫升的速度将提取物分装液加入滤袋中。过滤完成后，使用浊度计测定滤液与提取缓冲液按1:10稀释后的浊度。

取1毫升样品，处理滤袋滤液。例如，通过深层过滤和色谱法。随后根据文中方案进一步分析样品。

通过热沉淀宿主细胞蛋白的漂烫处理，可使总可溶性蛋白（TSP）降低96±1%。漂烫处理可回收高达83±1%的DsRed和51%的Vax8目标蛋白，使其在层析分离前的纯度从0.1%提高至1.2%。

当漂烫温度高于63摄氏度时，过滤能力下降。可通过在蛋白质提取后添加絮凝剂以及在袋式过滤后添加助滤剂来解决此问题。使用搅拌式容器进行热沉淀最多可去除84±1%的宿主细胞蛋白（HCPs）。

获得Vax8的纯度为0.33 ± 0.02%，DsRed的纯度为20.2 ± 1.4%。与漂烫法及换热器装置相比，容器内HCP沉淀使下游深层过滤能力提高了2.5倍，这反映了容器内的剪切力低于通过换热器泵送提取物或漂烫后均质化的剪切力。

使用换热器在60至70摄氏度条件下， consistently 从提取物中去除了约88.3 ± 0.7%的HCP含量。Vax8的纯度达到0.31 ± 0.01%，DsRed的纯度为27.6 ± 2.0%。

最后，该换热器在下游深度过滤器容量方面也达到了最低值，在堵塞前仅能澄清 13.5 ± 6.0 升/平方米。一旦掌握该技术，若操作得当，每次处理加上样品时间可在 50 分钟内完成。

在尝试该方法时，需注意确保目标蛋白具有热稳定性。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如色谱法）对产物进行更高程度的纯化。该技术在建立后，为植物学领域的研究人员提供了一种探索疫苗候选蛋白及烟草属物种蛋白纯化的新途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用焯水、搅拌容器或换热器对植物宿主细胞蛋白进行沉淀。