Name: 通过热烫完整植株或提取物热处理烟草宿主细胞蛋白去除方法的比较 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解利用热沉淀法去除烟草宿主细胞蛋白的技术，该方法可去除超过90%的宿主细胞蛋白，有效简化重组生物制药蛋白的下游纯化流程并提高产品稳定性。

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我们感谢 Thomas Rademacher 博士、Alexander Boes 和 Veronique Beiß 提供转基因烟草种子，以及 Ibrahim Al Amedi 在烟草植株培养方面的协助。作者谨此感谢 Richard M. Twyman 博士在编辑方面提供的帮助，以及 Güven Edgü 提供的 MSP1-19 参考样品。本工作部分由欧洲研究理事会高级资助项目“Future-Pharma”（项目编号 269110）、弗劳恩霍夫未来基金会（Fraunhofer-Zukunftsstiftung）以及弗劳恩霍夫协会内部项目（资助编号 Attract 125-600164）提供资金支持。

1. 培养烟草植株
<ol>
	<li>用 1 至 2 升去离子水冲洗每个岩棉块，随后用 1 升 0.1% [w/v] 营养液冲洗。在每个岩棉块中放入一粒烟草种子，并轻轻加入 0.25 升营养液冲洗，注意不要将种子冲走16。</li>
	<li>在温室中培养烟草植株 7 周，环境条件为 70% 相对湿度，16 小时光照周期（180 µmol sec−1 m−2；λ = 400 - 700 nm），昼夜温度设定为 25/22 °C。</li>
	<li>收获所有叶片，仅保留位于茎基部的四片子叶。</li>
</ol>
2. 可选：通过焯烫进行热沉淀
注意：请按顺序执行步骤 2.1 至 2.12，以通过热烫法沉淀烟草宿主细胞蛋白（HCP）。如果将使用加热容器（第 4 节）或换热器（第 5 节）进行 HCP 沉淀，则跳过整个第 2 节。
<ol>
	<li>留出 50 g 植物材料，不进行焯烫直接进行提取（第 3 节）。在后续分析中（第 7 节）取此提取物样品作为内参对照。</li>
	<li>准备一个 8 L 工作体积的水浴装置，例如，50 × 40 × 40 cm，置于隔热的聚苯乙烯泡沫桶或类似容器中。将可调恒温器安装在水浴装置上，用于后续的温度控制（步骤 2.7）。</li>
	<li>将整个装置转移至磁力搅拌器上，并在水浴中放入一个磁力搅拌子。确保磁场足够强，能够带动搅拌子旋转。</li>
	<li>在搅拌子周围放置至少四个支撑垫块，用于在后续焯烫过程中承载聚丙烯篮（步骤 2.6）。确保支撑垫块由非磁性材料制成（例如，含镍的不锈钢合金），且其高度高于搅拌子（图 2）。</li>
	<li>向水浴中加入 8 L 去离子水。 
	注：若低 pH 沉淀是问题，使用缓冲液（例如，50 mM 磷酸钠，pH 7.5）可提高目标蛋白的得率。</li>
	<li>将一个 23 × 23 × 23 cm 的聚丙烯篮放置在支撑垫块上，确保篮子不妨碍搅拌子的旋转，并完全浸没于液体中。如有必要，添加额外的水或缓冲液直至篮子完全浸没，然后再次取出篮子。 
	注意：从本步骤至步骤 2.12 的所有后续操作均涉及高温液体处理。请佩戴适当的个人防护装备，包括隔热手套。</li>
	<li>使用可调恒温器将水浴加热至 70 °C（或实验所需的其他温度）。在达到目标温度后，至少等待 15 分钟，以确保整个装置达到热平衡。</li>
	<li>从收获的烟草叶片中称取 150 g 为一份。将其中一份放入篮子中，避免对叶片造成不可逆的压缩或损伤（例如，撕裂）。避免篮子中植物材料过多或堆积过密。</li>
	<li>小心但迅速地将篮子浸入热液中，并放置在支撑垫块上。在篮子上方放置一块不锈钢块，以防止其上浮。</li>
	<li>将叶片在焯烫液中孵育 5 分钟，或根据实验设计选择合适的时间。在整个孵育过程中监测液体温度。</li>
	<li>小心地将篮子从焯烫液中取出，让叶片上残留的液体滴落 30 秒。然后将植物叶片从篮子中取出，转移至均质器中，并立即开始提取（第 3 节）。 
	注：焯烫后的植物材料可在提取前长时间保存，例如，在冰上保存超过 30 分钟，或在 -20 °C 冷冻数周，已成功验证。然而，产物稳定性可能随储存时间延长而下降，因此建议立即处理。</li>
	<li>使用新鲜叶片材料重复步骤 2.8 至 2.11，直至全部收获的生物量处理完毕。</li>
</ol>
3. 从烟草叶片中提取蛋白质
注意：接下来的步骤涉及带有旋转刀片的搅拌机。当搅拌机桶安装在搅拌机电机上时，切勿在其中进行操作。
<ol>
	<li>将150 g（湿重）采收的（步骤1.3）或焯烫过的（步骤2.11）叶片放入搅拌机中，加入450 ml提取缓冲液（50 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，10 mM 亚硫酸钠，pH 8.0）。 
	注意：提取缓冲液的成分取决于待提取的蛋白质，因此可能需要进行调整， 例如，使用其他pH值或缓冲液组分（如Tris）。</li>
	<li>以3次30秒脉冲进行匀浆，每次间隔30秒。确保叶片充分匀浆，避免堵塞搅拌器容器。若必要，可暂停搅拌并提起叶片以防止堵塞，随后继续匀浆操作。</li>
	<li>取1 ml各提取物样品用于后续分析（第7节）。若植物材料经过焯水处理，则继续进行第6节操作；否则根据所选实验方案，采用容器（第4节）或换热器（第5节）进行热沉淀处理。</li>
</ol>
4. 可选：在搅拌容器中进行热沉淀
注意：请按顺序执行第4.2至4.11节所述步骤，以在搅拌容器中沉淀烟草HCP。如果HCP已通过烫漂（第2节）沉淀，或计划使用换热器进行沉淀（第5节），则跳过整个第4节。
<ol>
	<li>设置两个8 L工作体积的水浴装置， 例如， 50 cm × 40 cm × 40 cm，采用隔热用聚苯乙烯泡沫箱或类似容器。在第一个水浴箱中安装可调恒温器，用于后续温度控制（步骤 4.6）。在第二个水浴箱中加入 5 L 去离子水和 2 kg 冰，用于后续冷却（步骤 4.9）。</li>
	<li>将第一个水浴转移至磁力搅拌器上，并将2-L不锈钢容器放入水浴中，使容器中心与搅拌器中心对齐。</li>
	<li>在不锈钢容器中放入一个磁力搅拌子。确保磁场强度足以使搅拌子旋转。</li>
	<li>将去离子水加入水浴锅中，水位至不锈钢容器上缘下方5 cm处。然后向容器中加入提取缓冲液。在容器上放置一个聚苯乙烯泡沫盖。 
	警告： 从第4步到第4.9步的所有后续操作均涉及高温液体处理。请穿戴适当的个人防护装备，包括隔热手套。</li>
	<li>将温度计插入聚苯乙烯泡沫盖上的适配孔中，使其进入不锈钢容器内。将水浴温度设定为78 °C，将整个装置孵育15分钟以达到热平衡。确保容器内的温度为70 °C，约比水浴设定温度低8 °C。</li>
	<li>如果不锈钢容器内的温度与70 °C不同，则相应调节水浴温度，并让系统再平衡15分钟。重复此步骤，直至容器内温度达到70 °C或实验所需的温度，然后排空不锈钢容器。</li>
	<li>将300 ml提取物（步骤3.2）倒入不锈钢容器中，此时容器仍置于水浴中，并启动计时器。以150 rpm的速度搅拌提取物，孵育5分钟。在此孵育期间，确保提取物温度至少有2分钟达到70 °C。</li>
	<li>将热水浴从磁力搅拌器上取下，取出不锈钢容器并放入装有冰水的桶中。将冰水桶置于磁力搅拌器上，移去聚苯乙烯泡沫盖。</li>
	<li>确保植物匀浆在150 rpm下充分振荡，将温度计插入提取液中，并孵育至温度达到20 °C或实验设计规定的温度。</li>
	<li>重复步骤 4.7 至 4.9，处理所有等份样品。每份热沉淀提取物达到最终温度后，各取 1 ml 样品，然后进入第 6 部分操作。</li>
</ol>
5. 可选：在热交换器中进行热沉淀
注意：按照 5.2 至 5.12 节所述步骤，使用换热器沉淀烟草宿主细胞蛋白（HCP）。如果宿主细胞蛋白已通过焯烫法（第 2 节）或在加热容器中（第 4 节）完成沉淀，则跳过整个第 5 节。
<ol>
	<li>设置两个8 L工作体积的水浴装置， 例如， 50 × 40 × 40 cm，使用带保温层的聚苯乙烯泡沫桶或类似容器。在第一个水浴中安装可调恒温器，用于后续温度控制（步骤 5.3）。在第二个水浴中加入 5 L 去离子水和 2 kg 冰，用于后续冷却（步骤 5.10）。 
	警告： 从第5步到第5.9步的所有后续操作均涉及高温液体处理。请佩戴适当的个人防护装备，包括隔热手套。</li>
	<li>在第一个水浴锅中加入8 L去离子水，使用恒温器将温度设定为74.5 °C。将组件放入水浴中孵育15分钟，以达到热平衡。</li>
	<li>准备一个隔热储存容器，将一个0.5 L的塑料烧杯放入一个1 L的塑料烧杯中，并用脱脂棉填满间隙。或者，使用专用于0.5 L工作体积的隔热容器。</li>
	<li>将L/S 24管的一端连接至热交换器，并将另一端连接至蠕动泵，热交换器另一端连接至出液软管。将两根管路末端连同温度计一同放入保温储存容器中，并加入300 ml提取缓冲液（图2).</li>
	<li>将换热器放入热水浴中，并以 300 ml/min 的流速启动蠕动泵-1确保3分钟后容器内的温度为70 °C，约低于水浴设定温度4.5 °C。</li>
	<li>如果保温容器内的温度与70 °C不同，则相应调节水浴温度，并让系统再平衡15分钟。重复此步骤，直至提取缓冲液的温度在不到3分钟内从室温升至70 °C，或达到实验所需温度，然后排空不锈钢容器。</li>
	<li>弃去保温容器中的提取缓冲液，准备300 ml的植物提取液分装样品。将其中一份分装样品加入保温容器中。</li>
	<li>将植物提取物（第 3.3 节）以 300 ml/min 的流速泵入热交换器-1 5分钟。确保提取物在3分钟后温度达到70 °C，或等于实验设计中规定的温度。</li>
	<li>5分钟后，在继续泵送提取物的同时，将热交换器放入冰水浴中。在此条件下孵育，直至温度恰好降至20 °C，或降至实验设计中规定的温度。</li>
	<li>将连接至蠕动泵的进液管从保温容器中取出，继续泵送以收集热交换器内残留的热沉淀植物提取物，随后停止蠕动泵。</li>
	<li>重复步骤 5.7 至 5.10，处理所有等份样品。每份热沉淀提取物达到最终温度后，取 1 ml 样品，随后将提取物转入袋式过滤（第 6 节）。 
	注意：在完成第 5.7 至 5.10 步的首个循环后，第 5.7 步中将无萃取缓冲液可弃去。</li>
</ol>
6. 植物提取物的袋式过滤
<ol>
	<li>将袋式过滤器安装到已装入过滤器外壳的相应支撑篮中，支撑篮为柔性过滤材料提供机械支撑。在支撑篮下方放置一个1 L的容器，并以150 ml min-1的流速将提取液分装样品（根据所选的热处理方式，参见第3.3、4.10或5.11节）加入袋中。</li>
	<li>过滤完成后，使用浊度计测定滤液在提取缓冲液中1:10稀释后的浊度。</li>
	<li>取1 ml样品，并根据实验设计对袋式滤液进行后续处理，例如深层过滤和层析7,10。</li>
</ol>
7. 样品分析
<ol>
	<li>使用 Bradford 法测定总可溶性蛋白（TSP）含量24,25。
	<ol>
		<li>将每个样品各 2.5 µl 以三份重复加入 96 孔板的单个孔中。设置八份牛血清白蛋白（BSA）标准品，每份设三个重复，浓度范围为 0 - 2,000 µg ml-1。</li>
		<li>向每孔加入 200 µl Bradford 试剂，通过反复吹打充分混匀，操作需轻柔以避免产生气泡。</li>
		<li>在 22 °C 下孵育 10 分钟，使用分光光度计在 595 nm 处测定吸光度。根据 BSA 参考点绘制的标准曲线计算样品中的 TSP 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过表面等离子共振光谱法定量 Vax826。
	<ol>
		<li>使用 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）运行缓冲液（10 mM HEPES、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1,500 mM 氯化钠、0.05% v/v 吐温-20，pH 7.4）配置表面等离子共振仪，并将羧甲基化葡聚糖表面芯片装入仪器。使用“prime”功能冲洗系统，并以 30 µl min-1 的流速对第 1 和第 2 流通池启动手动运行。注入 30 mM 盐酸两次，每次 60 秒，中间间隔注入 25 mM 氢氧化钠 60 秒。</li>
		<li>在 10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）中配制 200 µl 浓度为 500 µg ml-1 的 mAb 5.2 溶液。解冻 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）小瓶，并在 16,000 × g 下离心 1 分钟。将 70 µl EDC 与 70 µl NHS 混合后转移至一个 7 mm 塑料小瓶中。</li>
		<li>以 10 µl min-1 的流速将 EDC/NHS 混合液注入第 1 和第 2 流通池，持续 10 分钟，以活化羧甲基化葡聚糖表面芯片。</li>
		<li>将流路切换至仅第 2 流通池。以 10 µl min-1 的流速注入 mAb 5.2，持续 15 分钟，实现偶联。</li>
		<li>将流路切换回第 1 和第 2 流通池，以 5 µl min-1 的流速注入乙醇胺 7 分钟，以封闭未反应位点。随后注入 30 mM 盐酸两次，每次 60 秒，中间间隔注入 25 mM 氢氧化钠 60 秒。</li>
		<li>以 30 µl min-1 的流速注入样品及 MSP1-19 标准品，持续 180 秒。确保 Vax8 浓度在 50 - 1,000 ng ml-1 范围内。如需，可在含 EDTA 和吐温-20 的 HEPES 缓冲盐水（HBSEP）中进行预稀释。</li>
		<li>用第 2 流通池的信号峰值减去第 1 流通池的信号峰值，利用差值根据已知蛋白浓度为 500 ng ml-1 的 MSP1-19 注入信号计算样品中 Vax8 的浓度。</li>
		<li>每次样品或 MSP1-19 注入后，以 30 µl min-1 的流速注入 30 mM 盐酸 60 秒，以再生芯片表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光光谱法定量 DsRed
	<ol>
		<li>将每个样品各 50 µl 以三份重复加入黑色半面积 96 孔板的单个孔中。设置六份 DsRed 标准品，浓度范围为 0 - 225 µg ml-1。</li>
		<li>使用分光光度计，以 530 ± 30 nm 激发滤光片和 590 ± 35 nm 发射滤光片，每个样品测定两次荧光值。根据 DsRed 参考点绘制的标准曲线计算样品中 DsRed 的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颗粒粒径分布测定
	<ol>
		<li>用 1 ml 异丙醇清洗比色皿，再用 2 ml 去离子水冲洗，以去除灰尘颗粒。将 850 µl 样品加入比色皿中。</li>
		<li>将比色皿放入 zeta 电位及粒径分析仪中。打开 &#34;Software&#34; 软件，选择 &#34;Protein&#34; 作为材料，&#34;PBS&#34; 作为分散剂，启动手动测量。设定温度为 25 °C，平衡时间为 180 秒。</li>
		<li>选择 &#34;DTS0012&#34; 比色皿，以 173° 反向散射模式进行测量。勾选 &#34;auto&#34; 选项以自动确定测量时长，并选择连续进行三次测量，中间无延迟。</li>
		<li>测量完成后，在实验界面中选择该样品的三次测量结果，查看粒径分布峰形。点击 &#34;Volume PSD&#34; 选项卡进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

上述三种热沉淀方法可在任何色谱纯化步骤之前有效去除烟草宿主细胞蛋白（HCPs） 16,17它们补充了旨在提高初始产物纯度的其他策略， 例如， 吐水现象 29，根系分泌物 30 或离心萃取 31,32，这些方法均仅限于分泌蛋白。然而，基于加热的方法只有在目标蛋白能够耐受约 60 °C 以上的最低沉淀温度持续超过 1 分钟时，才能有意义地使用。因此，这三种方法的第一步均为设计具有足够高熔解温度的目标分子，该策略已应用于多种疟疾疫苗候选蛋白，这些蛋白由来自不同区域的多个结构域组成 恶性疟原虫 抗原 16,18,21在已证实目标蛋白的热稳定性后，可根据现有设备与培养基、预期的最终工艺规模以及后续的下游加工（DSP）操作，选择三种方法之一。 16.
烫漂是所有方法中速度最快的，且对附加设备的要求极低，因此可轻松整合到现有的实验室规模植物源重组蛋白纯化方案中。充分搅动烫漂液是一个重要的工艺参数，实证数据和理论计算均表明该参数会影...

现代医疗系统日益依赖生物制药蛋白1。与传统的表达系统相比，利用植物生产这些蛋白具有病原体负担低和可扩展性更强的优势2-4。然而，植物源性药品的下游加工（DSP）可能面临挑战，因为破坏性的提取过程会产生大量颗粒，浊度超过5,000散射浊度单位（NTUs），且宿主细胞蛋白（HCP）浓度通常超过95% [m/m]5,6。
去除分散的颗粒需要复杂的澄清步骤7-9，但如果在早期步骤中能有效去除宿主细胞蛋白（HCP），则在初始产物回收阶段，亲和-洗脱模式下的色谱设备运行成本更低10,11。这可以通过絮凝剂12或低pH值13,14使目标蛋白沉淀来实现，也可以通过促使HCP聚集来完成。通过添加聚乙二醇可促进核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的选择性聚集，该蛋白是烟草（Nicotiana tabacum）等绿色植物中最丰富的HCP15，但该方法成本较高，且不适用于大规模生产。热处理已被证明可使超过95%的烟草HCP变性并沉淀，而诸如Vax8等蛋白质疟疾候选疫苗在溶液中仍能保持稳定16-18。
采用三种不同方法实现烟草HCPs的热诱导沉淀：（i）焯烫， 即， 将完整叶片浸入热液体中，(ii) 温度可控的搅拌容器，以及 (iii) 热交换器（图1) 16对于完整的叶片，热烫处理可实现宿主细胞蛋白的快速高效沉淀，且易于放大，与现有的大规模生产工艺兼容，这些工艺均包含对植物生物量进行清洗的初始步骤。 19相比之下，某些工艺中已具备温度控制容器，可用于植物提取物的热处理 20但其可扩展性和能量传递速率受限，因为在工艺规模下，反应罐的表面积与体积比逐渐降低，变得不适宜。换热器是相较于加热搅拌容器在技术上更为明确的替代方案，但需要大量供应加热和冷却介质。 例如， 蒸汽和冷水，以及根据换热器几何结构和介质特性调整的严格控制的体积流量 例如比热容。本文展示了这三种方法均可用于烟草热致宿主细胞蛋白（HCP）沉淀，以及植物HCP的一般性研究。在实验室条件下建立并运行每种方法，可用于评估其在大规模工艺中的适用性。主要挑战在于为每项操作确定合适的缩小模型及运行条件，以模拟工艺规模生产中所使用的设备和条件。本文所呈现的数据来自转基因烟草植物的实验，这些植物表达疟疾疫苗候选抗原Vax8和荧光蛋白DsRed。 16，但该方法也已成功应用于 N. benthamiana 瞬时表达其他生物制药蛋白的植物 21.
采用实验设计（DoE）方法22可促进工艺开发，絮凝剂23在此背景下也可能具有积极作用，如先前所述8。热烫、加热容器与热交换器之间的主要区别在于，热烫是在工艺早期应用于完整的叶片，而其他方法则应用于植物提取物（图1）。
<img alt="转基因烟草处理示意图；用于蛋白质提取的均质器、加热器和色谱装置。" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 三种不同烟草HCP热沉淀方法实施流程示意图。 植物材料在澄清和纯化前经过清洗和均质处理。漂烫步骤（红色）所用设备可轻松添加至现有机械系统中。相比之下，使用搅拌罐（橙色）尤其是换热器（蓝色）则需要增加一个或多个额外装置及管路。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>2100P 便携式浊度计</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>浊度计</td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&amp;nbsp;</td><td>SPR 芯片偶联试剂盒</td></tr><tr><td>高压灭菌篮</td><td>Nalgene</td><td>6917-0230</td><td>叶片漂烫用篮子</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>SPR 检测仪</td></tr><tr><td>Bio Cell Analyser BCA 003 R&amp;D 带 3D ORM</td><td>Sequip</td><td>n.a.</td><td>粒径分析仪</td></tr><tr><td>搅拌机</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>搅拌机</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>袋式过滤器</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>离心机</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>反应管</td></tr><tr><td>50 ml 自立式离心管</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>反应管</td></tr><tr><td>CM5 芯片</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012&amp;nbsp;</td><td>SPR 测量用芯片</td></tr><tr><td>比色皿 10 × 10 × 45</td><td>Sarsted</td><td>67.754</td><td>Zetasizer Nano ZS 用比色皿</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.</td><td>实验设计软件</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&amp;nbsp;4984.3&amp;nbsp;</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>肥料</td></tr><tr><td>Forma -86C 超低温冰箱</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>冰箱</td></tr><tr><td>温室</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>Grodan 岩棉块 10 × 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>岩棉块</td></tr><tr><td>二十圈热交换器（4.8 m 长）</td><td>n.a.（定制设计）</td><td>n.a.</td><td>热交换器</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>K200P 60D</td><td>Pall</td><td>5302303</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>水浴恒温器</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>管路</td></tr><tr><td>mAb 5.2</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-9148</td><td>Vax8 特异性抗体</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>蠕动泵</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>滤布</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH 计 / 电导率计</td></tr><tr><td>Osram 冷白光 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>光源</td></tr><tr><td>植物生长室</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8554.1</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>不锈钢容器；0.7 kg 2.0 L；高 180 mm；直径 120 mm</td><td>n.a.（定制设计）</td><td>n.a.</td><td>热沉淀用容器</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>荧光与光谱酶标仪</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>滤器外壳</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS 粒径分布测量</td></tr><tr><td>Zetasizer 软件 v7.11</td><td>Malvern</td><td>n.a.</td><td>用于操作 Zetasizer Nano ZS 设备的软件</td></tr></tbody></table>

通过整株植物热烫或提取物热处理比较烟草宿主细胞蛋白去除方法

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

植物不仅为人类提供食物、饲料和原材料，还被开发为一种经济的生物制药蛋白生产系统，例如抗体、疫苗候选物和酶。这些蛋白必须从植物生物量中纯化，但植物提取物中高浓度的宿主细胞蛋白（HCPs）会阻碍层析步骤的进行。然而，大多数HCPs在温度高于60 °C时会发生不可逆聚集，从而有利于目标蛋白的后续纯化。本文介绍了三种在完整叶片或提取物中实现烟草HCP热沉淀的方法。对完整叶片进行烫漂处理可轻松整合到现有工艺中，但可能对后续过滤步骤产生不利影响。而在搅拌容器中对叶片提取物进行热沉淀则相反，尽管需要对工艺设备设计（如匀浆器几何结构）进行较大改动，但可改善下游操作的性能。最后，换热器装置在传热条件方面具有良好的可表征性且易于放大，但清洗可能较为困难，并可能对过滤能力产生负面影响。通过实验设计方法可确定影响HCP去除和产物回收率的最关键工艺参数。这有助于将每种方法应用于其他表达平台，并为特定纯化策略选择最合适的方法。

通过焯烫实现烟草宿主细胞蛋白的热沉淀 
第2节所述的漂白程序已成功用于从烟草叶片中沉淀宿主细胞蛋白（HCPs） 70 °C，使总悬浮颗粒物减少96 ± 1%（n = 3），同时回收高达51%的Vax8目标蛋白，从而在色谱分离前将其纯度从0.1%提高至1.2% 16此外，还可回收83 ± 1%（n = 3）的荧光蛋白DsRed，使其纯度从3.3%提高至64.1%。漂白步骤可轻松整合到标准的提取与澄清流程中，该流程包括生物质洗涤、均质化、袋式过滤和深层过滤。图1) 7. 准备漂烫设备（图2加入澄清装置的设置时间约增加了5分钟，而该装置的常规设置时间为20分钟。此外，对完整叶片进行烫漂操作还需额外7分钟，加上常规的提取和澄清时间45分钟。然而，这额外的7分钟中仅有2分钟为实际操作时间。另外，短时间孵育（少于1分钟）也是可行的，可将烫漂时间从7分钟缩短至约3分钟。因此，烫漂不仅可提高粗植物提取物中目标产物的初始纯度，而且可在无需额外工艺设备的情况...

本文介绍了三种热沉淀方法，可在进行任何其他纯化步骤之前，有效去除烟草提取物中超过90%的宿主细胞蛋白（HCPs）。植物HCPs在温度高于60 °C时会发生不可逆聚集。

植物不仅为人类提供食物、饲料和原材料，还被开发为一种经济高效的生物制药生产系统……

本组实验的总体目标是利用加热沉淀植物宿主细胞蛋白，从而促进重组生物制药蛋白的后续层析纯化。该方法有助于简化工艺开发并提高产物稳定性，例如通过激活宿主蛋白酶实现。该技术的主要优势在于易于整合到现有的蛋白酶体系中，并可快速适用于不同的靶蛋白。演示该实验步骤的是我实验室的硕士生Hannah Gruchow。加热沉淀宿主细胞蛋白。例如从烟草叶片中提取。按照文本方案培养烟草植株后，将一个八升工作体积的水浴装置置于隔热的聚苯乙烯泡沫桶中。将整个装置转移到磁力搅拌器上，并将磁力搅拌子放入水浴中。然后用非磁性支撑垫片包围搅拌子，使垫片高出搅拌子约一厘米，后续实验步骤中将在此上方放置聚丙烯篮。向水浴中加入八升缓冲液。然后将一个 23 × 23 × 23 厘米的聚丙烯篮子放在支撑瓷砖上。确保支撑物不会妨碍搅拌子的旋转，并且篮子完全浸没在液体中。随后取出篮子。使用可调恒温器将水浴加热至70摄氏度。达到目标温度后，至少等待15分钟，以确保整个装置达到热平衡。接下来，从烟草叶片中制备150克的等分样品。将一份等分试样放入篮中，避免对叶片造成不可逆的压缩或损伤（例如撕裂）。小心而迅速地将篮子浸入热液中，并置于支撑瓷砖上。然后在篮子上方放置一块不锈钢块以防止其上浮。将叶片在烫漂液中孵育5分钟，或根据实验设计选择合适的时间。在整个孵育期间监测液体温度。孵育结束后，小心地将篮子从烫漂液中取出，让叶片沥干30秒。然后将植物叶片从篮中取出，转移至均质机中，并立即按照文本中的实验方案开始提取。在搅拌容器中加热沉淀宿主细胞蛋白（HCPs）。将水浴锅放置于磁力搅拌器上，并将一个两升的不锈钢容器放入水浴锅中，使容器中心与搅拌器中心对齐。将磁力搅拌子放入不锈钢容器中。用提取缓冲液填充容器，然后加入去离子水。将水浴加水至不锈钢容器上边缘以下五厘米处。使用聚苯乙烯泡沫盖覆盖。接着，通过盖子上的一个缓冲孔将温度计插入不锈钢容器中。然后将水浴温度设定为78摄氏度，将整个装置孵育15分钟以达到热平衡。当组装体系达到平衡后，倒空容器，并在容器仍处于水浴中时，倒入300毫升提取液，同时启动计时器。以150 rpm的速度搅拌提取液，孵育5分钟。在孵育期间，确保提取液温度达到70摄氏度并维持至少2分钟。孵育结束后，将热水浴从磁力搅拌器上取下。取出不锈钢容器，放入装有冰水的桶中，然后将桶放在搅拌板上。确保植物匀浆以150 rpm充分振荡。将温度计插入提取液中，并孵育至温度达到20摄氏度或指定温度。根据文本方案设置两个工作体积为八升的水浴后，使用去离子水注满第一个水浴。将恒温器设定为74.5摄氏度，使组装体系孵育15分钟以达到热平衡。通过将一个0.5升的塑料烧杯放入一个1升的塑料烧杯中，制备隔热储存容器，并使用棉花等隔热材料填充间隙。使用 LS24 管路，将一端连接至热交换器，另一端连接至蠕动泵，并将另一端连接至出水软管。将管

comparison-tobacco-host-cell-protein-removal-methods-blanching-intact

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过热烫完整植株或提取物热处理烟草宿主细胞蛋白去除方法的比较

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌...

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。...

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过...

在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶...

在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

通过优化的人类外周血单个核细胞（PBMC）ex vivo...

评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。...

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。...

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

在Nicotiana benthamiana叶片中进行三萜类化合物制备规模的瞬时表达

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A...

用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

本文介绍了一种对烟草幼苗进行 Phytophthora nicotianae...

筛选烟草基因型对Phytophthora nicotianae的抗性

了解利用热沉淀法去除烟草宿主细胞蛋白的技术，该方法可去除超过90%的宿主细胞蛋白，有效简化重组生物制药蛋白的下游纯化流程并提高产品稳定性。

通过整株植物热烫或提取物热处理比较烟草宿主细胞蛋白去除方法

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