确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用
2016年9月12日
本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。
该概念性方法的总体目标是确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是在免疫细胞浸润攻击期间发挥其中枢神经系统保护作用，还是通过抑制免疫细胞浸润而产生保护效果。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如，调控EAE治疗时间如何区分对免疫细胞浸润的影响与神经保护作用之间的差异。
该技术的意义还延伸至多发性硬化症的治疗，因为目前尚无针对此病的神经保护疗法。我们最初产生这一方法的想法，是在发现使用系统Xc-转运体抑制剂处理EAE小鼠具有神经保护和免疫调节双重作用时。尽管该方法可用于药物治疗研究，也可应用于接受EAE诱导或其他干预的基因敲除小鼠的研究。
首先使用无菌剪刀将单个动物的脑组织和脊髓剪切成小块。然后每份组织使用一个3毫升注射器活塞，将每份样本通过70微米的细胞筛网研磨至各自的50毫升锥形管中，同时用培养基冲洗筛网。当所有组织块均被充分研磨后，用新鲜培养基将各管中的体积补足至50毫升，随后离心细胞悬液。
将每个沉淀重悬于4毫升40%密度梯度溶液中。然后沿各支15毫升锥形管管壁缓慢加入细胞悬液，覆盖在每管2毫升70%密度梯度溶液之上。通过离心分离细胞，并使用1毫升移液器小心弃去上层髓鞘层。
接下来，将样品界面中的活细胞转移至新的15毫升锥形管中，并用每管15毫升新鲜培养基重悬细胞进行洗涤。将细胞沉淀重悬于200微升新鲜培养基中，并将细胞悬液分别转移至96孔圆底板的各个孔中。离心该板，弃去上清液。
然后，将沉淀重悬于200 µL复刺激培养基中，在37°C条件下孵育细胞4小时。孵育结束后，再次离心培养板并弃去上清液。随后，用200 µL含2% FCS的PBS洗涤细胞，并将细胞重悬于200 µL含2% FCS及FC阻断剂的PBS中，于冰上孵育10至15分钟。
孵育结束后，按照上述方法洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于15微升细胞表面染色混合液中，冰上孵育15分钟。然后离心收集细胞，并用200微升PBS洗涤两次。接着，根据生产商说明书，将细胞重悬于FOXP3转录因子染色试剂中，于4摄氏度避光孵育30分钟至过夜。
孵育结束后，用150微升破膜缓冲液洗涤细胞。然后离心细胞，并将沉淀重悬于15微升破膜缓冲液中的目标胞内抗体中，置于冰上。30分钟后，离心细胞，随后用200微升破膜缓冲液洗涤三次。
最后一次洗涤后，将沉淀重悬于200微升PBS中，并通过流式细胞术分析样品，圈选活的CD4阳性、TCRβ阳性细胞。评估外周T细胞增殖情况也十分重要，因为外周的变化可能影响免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。为了量化EAE诱导后脊髓组织样品中星形胶质细胞和胶质细胞的数量，需以4倍放大倍数获取每张切片的图像，并将图像保存为TIFF文件。
接下来，在 ImageJ 中选择目标图像，使用多边形选区工具勾勒整个脊髓组织切片。在图像菜单下，选择“类型”并转换为 16 位，以将图像转换为 16 位格式。然后，打开“处理”菜单，选择“减去背景”，并将滚动球半径设置为至少等于背景中最大非背景物体的尺寸。
检查滑动抛物面并点击“确定”。然后，在“图像”下选择“调整”和“阈值”，使用滑动条设置下限阈值水平。为获得选定区域内阈值化区域的百分比，在“分析”和“设置测量”下选择“区域分数”。确保未勾选“限制为阈值”，并勾选“显示标签”，然后点击“确定”。为获取测量结果，在“分析”下选择“测量”。
将出现一个结果弹出窗口。保存此数据，并比较不同处理组之间的面积分数值。要通过光密度定量髓鞘碱性染色，打开目标图像，并使用多边形选择工具在样本内绘制感兴趣区域。
在“分析并设置测量值”中，选择“平均灰度值”，并确认取消勾选“限制为阈值”，同时勾选“显示标签”。单击“确定”。然后，在“分析”菜单下选择“测量”。将弹出一个新的结果窗口，显示髓鞘碱性蛋白的平均灰度值数据。
脊髓取出及流式细胞术分析可用于评估中枢神经系统中免疫细胞的浸润情况，其中免疫细胞浸润在疾病高峰期达到最大。对 CD4 阳性、干扰素 γ 阳性、IL-17 阳性以及 FOXP3 阳性细胞数量进行统计学分析，可揭示药物处理组动物与对照组动物之间 CD4 阳性浸润性 T 细胞数量变化的显著性；深入的共表达分析对于排除因共表达偏倚导致的整体 CD4 阳性浸润性 T 细胞数量减少的混杂因素至关重要。为排除中枢神经系统浸润性 T 细胞减少是由于外周 T 细胞增殖、活化和分化受到抑制所致，还可评估正在活跃增殖的 T 细胞数量以及 T 细胞亚群的比例。
为了对髓鞘完整性进行定量评估，可对髓鞘碱性蛋白染色的光密度进行统计学分析，例如，该分析可揭示未明确的基因敲除动物与野生型同窝动物相比，脊髓组织出现显著的脱髓鞘现象。为进一步证实神经炎症是否因治疗干预而持续或减轻，还可通过测量反应性胶质增生的平均面积分数来评估反应性胶质增生，方法如前所述。一旦掌握，流式细胞术若操作得当可在两天内完成，而每种染色的组织染色定量分析则大约需要两小时。
可通过在免疫细胞浸润前引入治疗处理，以评估T细胞迁移和增殖的变化，从而评价免疫调节作用。可通过在疾病高峰期（即免疫细胞已浸润中枢神经系统后）引入治疗处理，以评估对中枢神经系统的保护作用。在进行该操作时，需注意在ImageJ中设置合适的阈值，以确保仅特异性地突出显示细胞染色部分。
观看本视频后，您应能够充分理解如何评估特定治疗在免疫细胞浸润前后不同处理时间下，对中枢神经系统、T细胞增殖及迁移反应的影响。
概述
本方案概述了一种评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的药物治疗是否通过抑制免疫细胞浸润或在免疫细胞浸润期间发挥神经保护作用，从而提供中枢神经系统保护的方法。该方法对于理解多发性硬化症治疗的意义具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 药理学
背景
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化症的模型。
- 目前的治疗方法缺乏神经保护性选择。
- 了解免疫细胞动态对于开发有效疗法至关重要。
- 先前的研究结果表明，某些治疗方法同时具有神经保护和免疫调节作用。
研究目的
- 区分药物治疗对免疫细胞浸润和中枢神经系统保护的不同作用。
- 探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）治疗的时间点及其对免疫反应的影响。
- 提供可能有助于开发多发性硬化症新治疗策略的见解。
使用的方法
- 从EAE小鼠模型中分离和分析免疫细胞。
- 采用流式细胞术评估T细胞群体及其活化状态。
- 对脊髓组织中的星形胶质细胞和胶质细胞进行图像分析以实现定量。
- 进行统计学分析以比较不同治疗对免疫细胞浸润的影响。
主要结果
- 根据治疗时机的不同，确定了免疫细胞浸润的关键差异。
- 证实了治疗动物中神经保护作用的重要性。
- 提供了星形胶质细胞和胶质细胞群体的定量数据。
- 揭示了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中免疫调节机制的见解。
结论
- 该方法能有效区分治疗的免疫调节作用与神经保护作用。
- 研究结果对开发多发性硬化症的治疗方法具有重要意义。
- 尚需进一步研究以探索这些治疗的长期效果。
常见问题
行业重要性概述
该方法通过区分药物干预是通过直接神经保护，还是通过抑制致病性免疫细胞浸润的间接途径实现中枢神经系统（CNS）保护，解决了自身免疫性脱髓鞘研究中的一个关键空白。这种区分对于多发性硬化症（MS）治疗开发中的靶点验证去风险化和研发管线布局决策至关重要，因为现有的免疫调节疗法无法阻止长期的神经退行性病变。该方法能够机制性地区分免疫调节作用与神经保护作用，从而提升靶点选择的预测可信度，并支持以神经保护为导向的研发管线在转化生物标志物方面的合理匹配。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过确定观察到的中枢神经系统保护作用是源于免疫细胞调节还是直接的神经组织保护，能够验证治疗假设。
- 操作价值：提供一个框架，通过排除外周免疫效应作为中枢神经系统结果的混杂因素，降低靶点风险。
- 预测价值：通过分离出独立于免疫调节的神经保护机制，支持靶点的优先排序。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的多参数读数，包括流式细胞术免疫分析以及星形胶质细胞、胶质细胞和髓鞘完整性的免疫组织化学定量。
- 操作价值：标准化组织处理和分析流程，以实现对不同研究组中中枢神经系统保护作用与免疫调节作用的可重复评估。
- 可扩展性：适用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的基因敲除和药理学干预模型，可重复使用该平台进行靶点验证研究。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过量化中枢神经系统浸润性T细胞亚群及其细胞因子谱，将实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的免疫细胞动态与人类多发性硬化症（MS）病理联系起来。
- 机制去风险化：明确治疗获益是源于免疫介导损伤的减轻，还是源于炎症攻击期间神经元抗损性的增强。
- 生物标志物一致性：支持评估反应性胶质增生和髓鞘碱性蛋白作为神经保护或脱髓鞘过程的转化生物标志物。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到临床前疗效评估的整个发现流程，特别有助于研究团队通过将神经保护候选物的作用与免疫调节活性分离，从而降低其研发风险。
- Discovery Biology：通过比较在免疫细胞浸润高峰前与高峰后给予处理的效果，支持假设验证，以解析作用机制。
- Screening：提供即用型定量检测结果，涵盖免疫细胞浸润（CD4+、IFNγ+、IL-17+、FOXP3+ T细胞）和中枢神经系统结构完整性（髓鞘碱性蛋白光密度、星形胶质细胞/胶质面积占比）。
- Analytics：支持对免疫细胞共表达谱和组织染色指标进行统计学比较，以排除偏倚或外周增殖等混杂因素。
- Translational Research：通过量化抗原经历T细胞的浸润及中枢神经系统胶质细胞反应，将实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的免疫动态与多发性硬化（MS）相关通路相联系。
- Enterprise Reuse：在自身免疫性脱髓鞘研究项目中，建立标准化能力，用于评估不同干预方式（小分子药物、生物制剂、基因模型）对中枢神经系统的保护作用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过区分免疫调节与真正的神经保护作用，实现对靶点的机制性去风险化。
- 操作价值：提供标准化、可重复的多参数中枢神经系统-免疫表型分析工作流程。
- 战略价值：揭示候选药物是通过免疫抑制还是直接神经支持来调节疾病，从而指导决策是否推进研发。
- 组合影响：基于更清晰的机制依据，支持对神经保护候选药物进行风险调整后的推进。
实施注意事项
- 精通流式细胞术、免疫组织化学及图像分析（ImageJ），用于多参数数据采集。
- 具备离心、细胞分选和荧光显微镜设备，可用于免疫细胞分离和组织染色。
- 在不同实验室间统一阈值设置和染色方案，以确保面积分数和光密度测量结果的可比性。
- 需考虑不同啮齿类品系、疾病模型及组织处理时间对细胞活力和抗原保存的影响。
- 实际限制：为明确药物作用机制，需谨慎协调给药时间与免疫细胞浸润高峰的对应关系。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
4:44
Quantification of Reactive Gliosis Using Mean Fraction Area and Myelin Using Optical Density
2:57
Central Nervous System (CNS) CD4+ T Cell Phenotype Assessment
6:52
Results: System Xc-transporter Inhibition Attenuates T Cell CNS Infiltration and Myelin Destruction
8:31
Conclusion
1:10
Brain and Spinal Cord Immune Cell Isolation
