Name: 确定免疫系统抑制中枢神经系统对保护药物干预自身免疫性脱髓鞘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解实验性自身免疫性脑脊髓炎药物干预方法，通过流式细胞术分析免疫细胞浸润与中枢神经系统保护机制。该技术有助于多发性硬化症治疗策略的研究与开发。

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本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）P30-NS069324、美国国家多发性硬化症协会RG 4587-A-1、国际Civitan研究基金会、Mike L. Jezdimir横贯性脊髓炎基金会、阿拉巴马大学健康服务基金会普通捐赠基金、美国国家科学基金会1355183项目以及美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所T32 AI007051项目资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

多发性硬化症（MS）患者在使用可减弱T细胞活化和/或其向中枢神经系统（CNS）浸润的药物期间，仍会经历疾病复发，因此有必要开发能够直接保护中枢神经系统的治疗方案。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）传统上被用于模拟MS的症状，在研究免疫系统与中枢神经系统之间相互作用的本质时，可作为一种强有力的工具。 体内根据EAE治疗时机的考虑 例如在疾病发生之前或之后，结合检测中枢神经系统中的免疫细胞浸润以及外周免疫细胞的增殖与活化情况，可以明确治疗手段对免疫系统和中枢神经系统的双重影响。
尽管C57BL/6小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型应用更为广泛，但SJL小鼠的EAE模型可能更能代表多数多发性硬化（MS）病例，因为这些小鼠表现出复发-缓解的表型，并伴有免疫细胞向脑实质的浸润10。SJL小鼠在缓解期具有明显的恢复特征，因此可在疾病表现后、炎症减轻期间开始治疗。需要注意的是，SJL小鼠的复发与缓解并不总是同步发生，这可能导致在合并结果时出现较大的变异性。因此，部分研究人员可能选择展示单只动物的代表性临床评分结果，同时在疾病进展的个体化时间点分别采集小鼠用于FACS分析和组织学检查。
考虑在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠病程中的干预时机，有助于确定治疗手段对免疫系统或中枢神经系统（CNS）的影响。治疗开始的时间有多种选择，每种时机都暗示着免疫细胞是否已进入中枢神经系统，以及它们与中枢神经系统的相互作用方式。在症状出现前开始治疗，意味着免疫细胞尚未进入或对中枢神经系统造成损伤；而在症状出现后开始治疗，则表明免疫细胞已经侵入中枢神经系统并造成一定程度的损害。使用SJL小鼠时，治疗还可选择在复发期启动，此时免疫细胞正活跃地浸润并引发炎症；或在缓解期启动，此时中枢神经系统中的免疫细胞可能较少，炎症程度也较轻。在确定治疗干预时机时，结合免疫细胞在病理过程中所处阶段，可初步提出关于治疗手段如何影响中枢神经系统和免疫系统的假设。
治疗手段可通过多种方式影响免疫细胞和中枢神经系统（CNS），最终减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）症状的严重程度。因此，有必要采用流式细胞术分析和免疫组织化学方法，评估免疫细胞在外周和中枢神经系统中的变化情况、免疫细胞是否已进入中枢神经系统，以及中枢神经系统对治疗的反应。尽管对脊髓进行流式细胞术分析可确定在特定时间点进入中枢神经系统的细胞数量，但除非脾脏中免疫细胞的增殖未受影响，否则无法确定该效应是源于免疫细胞迁移减少所致。因此，必须同时分析外周和中枢神经系统组织，并通过比较两种组织的结果来阐明其潜在的作用机制。此外，治疗还可能改变免疫细胞的活性谱型，例如由以致病性辅助性T细胞为主的表型转变为以调节性T细胞为主的表型。因此，检测不同细胞类型的标志物，并比较经治疗与未治疗动物之间各标志物表达百分比的变化，也是重要的分析内容。多发性硬化（MS）研究中的一个新兴观点认为，B细胞在自身免疫性脱髓鞘过程中发挥重要作用，这一观点基于研究表明B细胞对于T细胞的再活化是必需的20。该观点也得到了利妥昔单抗等治疗手段成功的支持，利妥昔单抗是一种靶向B细胞表面表达的CD20分子的抗体21,22。正如奥瑞珠单抗（ocrelizumab）在临床试验中取得的成功所表明，靶向CD20分子不同表位的药物可能进一步提高针对B细胞治疗策略的疗效23。
本文所介绍技术的一个局限性在于，免疫细胞可能进入中枢神经系统（CNS），但无法在实质组织中迁移。可通过免疫组织化学方法检测免疫细胞的血管周围套袖现象，并评估经处理与未处理动物之间免疫细胞在实质组织中迁移的距离。另一个潜在的局限性涉及微生物组对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病机制的影响。共生的肠道微生物群可显著影响疾病的发生发展24；因此，饲养于不同种群甚至不同笼具中的小鼠，其疾病严重程度可能存在巨大差异。因此，在涉及EAE的实验中，应尽可能使用同窝对照小鼠，并在同一笼具中饲养。最后需指出的是，如果实验上希望消除外周免疫细胞增殖变化的影响，可考虑采用被动转移诱导方法，而非本方案中所述的主动诱导方法。
可通过共培养系统11进一步验证神经保护作用，以检测细胞死亡的特定机制，或利用条件性基因敲除小鼠，实现特定细胞类型中蛋白的选择性缺失。此外，为了拓展对具有神经保护作用的药理学制剂的研究，应纳入轴突横断和神经元死亡的标志物。另一个重要的研究方向是髓鞘再生。受损轴突无法实现再髓鞘化，这进一步支持将神经保护疗法作为髓鞘再生治疗的重要组成部分。此外，无髓鞘轴突比有髓鞘轴突更易受到损伤。这提示当轴突发生脱髓鞘后，促进及时再髓鞘化的治疗干预将可预防轴突损伤。为探索这些方向，可采用其他用于研究脱髓鞘与再髓鞘化的体内模型（例如，环己酮和溶血卵磷脂模型）。本文所述方法侧重于通过量化髓鞘丢失来评估神经保护作用。而对于再髓鞘化的评估，还应考察前体细胞的数量及其增殖与成熟能力。在提及这些替代模型时，也必须考虑由病毒介导的不同脑炎模型。目前已有两种特征明确的RNA病毒模型可导致髓鞘丢失：其一是鼠类脊髓灰质炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis），一种无包膜的小RNA病毒科（Picornaviridae）病毒；另一种是小鼠肝炎病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）病毒家族25,26。
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究各种干预或治疗手段如何影响免疫系统和中枢神经系统（CNS）体内功能的有力工具。本文所述方案有助于确定治疗作用于疾病过程的具体环节，无论是在外周免疫系统、血脑屏障，还是在中枢神经系统内部。目前尚无能够治愈多发性硬化症（MS）的疗法，患者常随时间推移出现病情恶化。类似地，其他涉及免疫细胞浸润中枢神经系统并导致髓鞘破坏的疾病，如急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎谱系疾病，也缺乏能够在免疫细胞直接攻击下保护中枢神经系统的有效治疗手段。通过综合考虑治疗时机，并结合流式细胞术对脾脏和脊髓的分析，以及对中枢神经系统的免疫组织化学检测来评估炎症与损伤程度，可深入阐明治疗作用的潜在机制。

多发性硬化症（MS）在疾病早期主要表现为脑部白质区域的炎性病灶。随着长期进展，通过磁共振成像（MRI）可检测到灰质萎缩，标志着疾病进入神经退行性阶段。白质中的反应性胶质增生、脱髓鞘及轴突损伤主要归因于中枢神经系统（CNS）浸润的免疫细胞。目前用于治疗MS的所有疗法均无法逆转或直接阻止CNS内的神经退行性变，而是通过抑制T细胞活化和/或其向CNS的浸润来减轻炎症。由于尚无治愈MS的方法，且接受现有治疗的患者仍持续出现病情进展，因此发现能够预防脱髓鞘和神经元丢失的药物显得尤为关键。然而，在实验上区分药物对免疫细胞与对CNS的效应仍具有挑战性，因为其最终结果—— 即，无论其发生机制如何，对中枢神经系统的损伤均表现出相似的减轻效果。因此，评估中枢神经系统保护作用时，必须同时评估中枢神经系统内浸润的免疫细胞以及外周免疫细胞的增殖情况，以确定药物如何影响疾病的发生机制。
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种成熟的自身免疫性炎症疾病的动物模型，直接促成了目前用于治疗多发性硬化症（MS）的药物的发现1-4。小鼠常被用于EAE研究，其中C57BL/6小鼠因存在多种遗传变异品系而被广泛使用。经EAE诱导的C57BL/6小鼠通常在诱导后约第10天发病，并呈现慢性疾病进展。这些动物的组织病理学特征表现为脊髓实质和小脑的炎性细胞浸润，而皮质实质中则无明显浸润5。此外，大脑中的皮质病变和脱髓鞘是该疾病的重要特征6-9，但在C57BL/6小鼠中这些病变相对少见。因此，在条件允许的情况下，使用SJL小鼠可能更为合适，因其表现出复发-缓解型病程，且在脑和脊髓中均可见病变，这些病变与多发性硬化症中的病变相似10。
如果免疫细胞从未到达中枢神经系统（CNS），则不能将治疗归类为具有神经保护作用。因此，本方案采用流式细胞术分析实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的脑组织、脊髓和脾脏，以确定治疗对免疫细胞向中枢神经系统浸润以及外周免疫细胞增殖的影响，方法如先前研究所示11。本文还描述了通过免疫组织化学分析中枢神经系统组织，以评估神经保护的程度和性质。结合这些方法，可判断免疫细胞是否在外周被激活并增殖、是否进入中枢神经系统，以及中枢神经系统是否受到炎症或损伤的保护。若怀疑治疗存在神经保护效应，即使其对免疫系统有影响，实验人员也可在免疫细胞浸润中枢神经系统后调整给药起始时间。
本文介绍了一种利用两种不同主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的研究方案。EAE是一种T细胞介导的多发性硬化症（MS）动物模型。通过在疾病发展过程中多个时间点结合流式细胞术分析与免疫组织化学检测，评估实验性治疗策略对MS发病机制不同环节的干预效果。该方法有助于研究人员区分药物对免疫细胞增殖与浸润的作用和对中枢神经系统（CNS）的保护作用，从而更清晰地阐明药物作用于疾病发病机制的具体途径。

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 毫米包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 毫米包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 毫米包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0.5 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗GFAP（混合抗体）</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗Iba-1多克隆抗体（50 &amp;#181;g）</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0.5 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗IFN-&amp;gamma; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗MBP（D-18）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗TCR&amp;beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0.5 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>抗TCR&amp;beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0.2 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>生物素化山羊抗兔IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1.5 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>生物素化马抗小鼠IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000&amp;nbsp;</td><td>1.5 mg/ml 储存浓度</td></tr><tr><td>柠檬酸，无水，99.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA），四钠盐二水合物，99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片，每箱10片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>高尔基体阻断剂（Golgi Plug）</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>蛋白转运抑制剂</td></tr><tr><td>Immedge 疏水屏障笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，100倍浓缩液</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>近红外活/死细胞染色试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>细胞活力染料</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>树脂封片剂</td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗髓鞘碱性蛋白抗体</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>非离子型去垢剂</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 试剂盒（标准型）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>亲和素-生物素-过氧化物酶&amp;nbsp;复合物（ABC）用于免疫过氧化物酶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vector Laboratories 过氧化物酶底物试剂盒（DAB）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB溶液</td></tr></tbody></table>

确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

多发性硬化（MS）是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，其主要特征是免疫细胞浸润进入脑和脊髓，导致髓鞘破坏。这不仅减缓了神经冲动的传导，还会引起轴突损伤，进而导致运动功能和认知能力下降。目前针对 MS 的治疗主要集中于减轻免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。这些疗法可减少复发次数，改善患者生活质量，但无法完全消除复发，因此对长期残疾的改善有限。因此，亟需能够保护中枢神经系统的治疗药物。在 MS 的动物模型及人类患者中，T 细胞进入 CNS 通常被认为是启动炎症反应的关键事件。为了评估某种药物是否具有 CNS 保护作用，必须排除其对周围免疫细胞浸润或增殖的潜在影响。本实验方案旨在阐明在药物干预后所观察到的 CNS 保护效应，究竟是源于减轻 CNS 浸润的免疫细胞所致，还是由于在炎症攻击过程中阻断了 CNS 细胞的死亡。能够在炎症攻击期间评估对 CNS 具有保护作用的 MS 治疗手段，对于推动治疗策略的发展至关重要，因为现有疗法虽可减少复发，却无法彻底根除复发。即，免疫细胞浸润），导致中枢神经系统易受退行性病变影响。

本研究采用两种实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，以评估药物是否通过抑制T细胞向中枢神经系统的浸润，或在炎性免疫细胞浸润过程中防止髓鞘和轴突损伤，从而提供中枢神经系统（CNS）保护作用。为确定治疗药物是否能够阻止免疫细胞浸润脊髓，采用C57BL/6小鼠的慢性EAE模型，该模型中免疫细胞浸润和疾病病理主要发生在脊髓（图1A）。为评估治疗药物是否在免疫细胞侵入中枢神经系统期间提供CNS保护作用，采用SJL小鼠的复发-缓解型EAE模型，该模型在脑和脊髓中均表现出疾病病理变化（图1B）。
临床评估
根据典型（图1C）或非典型（图1D）EAE的以下评分标准进行相关临床评估。对于典型临床疾病，评分为0表示无异常行为。当从尾根部提起小鼠时，尾巴可能快速旋转（类似于直升机旋翼），后肢会分开。临床评分为1表示尾巴部分无力，可通过从尾根部提起小鼠来判断。正常的类似直升机的旋转动作可能减弱或消失，尾巴的一部分可能完全无力。判断尾部麻痹程度的一个有效方法是用手指沿尾巴长度方向滑动：未麻痹的尾巴通常会缠绕手指，而部分麻痹的尾巴则无法完成此动作。临床评分为2表示尾巴完全麻痹。从尾根部提起小鼠时，尾巴完全无活动。临床评分为3表示后肢部分麻痹。确定该评分时需让小鼠在平坦表面上自由活动。若小鼠向前移动时有一只后肢拖行，或一只或两只后肢表现出部分麻痹，则可给予评分为3。临床评分为4表示后肢完全麻痹。在此评分下，小鼠无法移动其后肢，仅能依靠前肢拖动身体前行。临床评分为5表示濒死小鼠，或在笼内移动或呼吸困难的小鼠。若小鼠无法在笼底自行拖行或呼吸费力，则应实施人道安乐死。临床评分为6表示在笼内发现已死亡的小鼠。评分为6的情况较为罕见，应调查除EAE以外的其他死因。
非典型临床症状可能伴有或不伴有瘫痪。如果小鼠同时表现出非典型症状和典型症状，可能需要采用两套独立的评分系统。评分为0表示无异常行为，与典型评分系统相同。临床评分为1表示小鼠在行走时出现轻微头部偏转或倾斜。可通过让小鼠向前行走并观察其运动是否持续偏向左侧或右侧来判断。临床评分为2表示头部偏转更为明显，并伴有翻身能力下降。与非典型评分为1的情况类似，小鼠在运动中存在方向性，且可能有轻微的平衡困难。临床评分为3表示无法沿直线行走。小鼠会出现平衡困难，在行走时可能依靠笼壁来维持身体直立。临床评分为4表示小鼠侧卧，因平衡障碍而无法行走。小鼠可能能够在笼底拖行自身，但其运动仍可能具有方向性。临床评分为5表示小鼠在无支撑情况下持续翻滚。达到此评分的小鼠应实施人道安乐死。临床评分为6表示小鼠被发现死于笼中。评分为6的情况较为罕见，应调查除实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）以外的其他死亡原因。
可能需要予以考虑 &#34;介于两者之间&#34; 评分， 例如，若小鼠状况发生轻微变化或在两个评分之间难以抉择时，可增加0.5分。例如，小鼠活动速度较正常同类稍慢但无瘫痪表现，或在尾部提起时前肢抓握后肢而非正常伸展后肢，可评分为0.5分。小鼠仅能在笼底拖行自身，且后肢仅能周期性抽动或在触碰时抽动，可评分为3.5分。
评估免疫细胞浸润的减少
在C57BL/6小鼠模型中诱导EAE后（图1A，第0天），抗原呈递及脾脏T细胞增殖发生在第1至5天，随后约在第7天出现免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。在初始免疫细胞浸润发生后约3至5天，小鼠开始出现临床评分症状。为了评估某种治疗药物是否能够阻断免疫细胞向脊髓的浸润，可在抗原呈递和脾脏T细胞增殖之后、但免疫细胞尚未开始浸润脊髓之前的第7天给予药物或对照溶剂。若免疫细胞的浸润受到抑制，则疾病的上升期（第10至15天）临床病程应表现为临床评分的改善（图2）。
免疫细胞浸润减少也会导致神经炎症减弱。反应性星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化被认为是神经炎症的主要特征。通过GFAP标记星形胶质细胞、Iba-1标记小胶质细胞，随后检测平均面积分数染色的变化，可用于量化神经炎症（图3）。
为了确定免疫细胞浸润是否减少，在疾病高峰期（图1A，约第18天）取出脊髓并进行流式细胞术分析。这可确保有最大数量的免疫细胞已进入脊髓。T细胞进入中枢神经系统（CNS）被认为是启动炎症的关键事件，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型及多发性硬化症（MS）患者中均能检测到Th1和Th17细胞。因此，流式细胞术分析应包括对这两类致病性T细胞的评估。此外，调节性T细胞（Tregs）是已被充分表征的抑制性T细胞，能够缓解疾病进展。因此，必须将Treg占总CD4+细胞群体的百分比与效应T细胞亚群的百分比进行比较。这将揭示T细胞浸润总体是否减少，或中枢神经系统内T细胞表型是否存在偏移。代表性点图（图4A）显示，与对照溶剂处理小鼠相比，药物处理小鼠脊髓中浸润的CD4+ T细胞总数减少（右上象限数值）。为评估Th1、Th17和Treg细胞，需分别检测其特征性标志蛋白：IFN-γ+、IL-17+和Foxp3+，这些应有所降低（图4A）。应对CD4+、IFN-γ+、IL-17+和Foxp3+细胞数量进行统计学分析，以证明其显著减少（图4B）。为排除T细胞亚群比例偏移的可能性，需对IFN-γ+ IL-17+、IFN-γ+ IL-17-、IL-17+ IFN-γ-以及Foxp3+细胞的比例进行统计学评估（图4C）。
为了排除中枢神经系统浸润性T细胞减少是由于外周免疫应答中T细胞增殖、活化和分化受到抑制所致，需要评估外周区活跃增殖的T细胞数量以及T细胞亚群的比例。如果T细胞的活化和分化未受影响，则CD4+、IFN-γ+、IL-17+或Foxp3+细胞的比例应无变化（图 5A）。此外，如果增殖过程未受影响，则Ki67+ CD4+细胞的比例也应无变化（图 5B）。药物处理通常在第7天或之后开始，以避免干扰初始抗原呈递及外周T细胞的活化。然而，在遗传学模型中，相关蛋白通常在胚胎发育阶段即被持续性敲除，或在EAE诱导前已被诱导缺失，因此对脾细胞的评估尤为重要。
评估中枢神经系统保护作用
为了验证某种特定治疗药物是否在免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）后调节疾病病理过程，应在临床评分首次达到高峰期间给予药物干预。SJL型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型在这些实验中具有优势，因为该品系小鼠表现出复发-缓解的表型。如果某种药物治疗能够防止髓鞘-轴突变性，则可观察到临床评分的改善（图6）。对髓鞘的病理学评估必须证实髓鞘损伤减少，且与临床评分的改善相一致。为了定量评估髓鞘完整性，需对髓鞘碱性蛋白（MBP）进行DAB染色，随后对该染色结果进行光密度统计分析（图7）。为进一步验证治疗干预是否持续或减轻神经炎症，可按照前述方法测定反应性胶质增生的平均面积比例（图3）。为了证实该治疗干预直接保护中枢神经系统而无免疫调节作用，必须排除免疫细胞向中枢神经系统的浸润以及脾脏中免疫细胞增殖的减弱效应。为此，应按照前述方法进行脑和脊髓中免疫细胞浸润的评估，以及外周T细胞增殖与活化的检测（图4和图5）。综上所述，若某种治疗药物能够在不减少中枢神经系统浸润性T细胞或外周T细胞增殖的情况下阻断CNS细胞损伤，则该药物属于中枢神经系统保护性治疗。
<img alt="图 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig1.jpg" /> 
图 1. C57BL/6 和 SJL 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床评分的代表性结果。 （A）使用 MOG35-55 诱导 C57BL/6 小鼠（n = 10）产生慢性型 EAE 的临床评分（均值 ± 标准误）。（B）使用 PLP139-151 诱导 SJL 小鼠（n = 3）产生复发-缓解型 EAE 的临床评分（均值 ± 标准误）。（C）用于追踪 EAE 小鼠典型疾病进展的临床评分标准。（D）用于追踪 EAE 小鼠非典型疾病进展的临床评分标准。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig2.jpg" /> 
图2. EAE 诱导的 C57BL/6 小鼠在免疫细胞浸润前的药物治疗 临床评分（平均值 &#177; 经PBS（n = 20）或SAS（n = 19）处理的MOG免疫后第7天C57BL/6小鼠的扫描电镜（SEM）结果35-55数据来自三次合并的独立实验。统计学差异采用非参数双尾Mann-Whitney U检验确定，*p &#60; 0.05. 经许可重新印制自 (11)。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig3.jpg" /> 
图3. 对照组、EAE模型及经处理的C57BL/6小鼠脊髓中反应性胶质增生的免疫荧光染色与定量分析。（A）对照组（未免疫）小鼠（左图）、PBS处理的EAE小鼠（中图）以及SAS处理的EAE小鼠（右图）脊髓组织中GFAP（星形胶质细胞标记）和Iba-1（小胶质细胞标记）的荧光染色结果。比例尺 = 100 µm。通过面积分数法对染色面积进行定量，计算GFAP（B）和Iba-1（C）免疫阳性区域的百分比。数据以均值±标准误表示，n = 3 对照组，n = 3 SAS处理组，或 n = 4 PBS处理组，每只小鼠分析6个切片。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学差异检验，*p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01，***p &#60; 0.001。经许可重印自（11）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig4.jpg" /> 
图4. 经治疗EAE C57BL/6小鼠脊髓的流式细胞分析显示T细胞浸润减少。 C57BL/6小鼠在EAE诱导后第7天开始接受SAS或PBS处理。于第15天获取脊髓组织。(A) 代表性点图显示CD4+细胞群中Th1细胞（IFN-γ+/IL-17-）和Th17细胞（IFN-γ-/IL-17+）（上排图）以及调节性T细胞（Foxp3+）（下排图）。点图中右上象限显示相应细胞百分比。(B) 对CD4+细胞以及IFN-γ+、IL-17A+和Foxp3+细胞的绝对数量进行统计分析。(C) 还分析了SAS处理与PBS处理EAE小鼠之间T细胞亚群百分比的变化。数据表示为均值±标准误，PBS处理组n = 10，SAS处理组n = 9，来自两次独立实验。所有柱状图均采用双尾t检验。**p &#60; 0.01。经许可重印自(11)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig5.jpg" /> 
图5. 实验性自身免疫性脑脊髓炎C57BL/6小鼠脾脏的流式细胞术分析，显示经治疗与未治疗小鼠中T细胞表达谱和增殖水平相当。 在诱导EAE后第15天分析PBS处理组和SAS处理组小鼠的脾脏。（A）来自两项独立实验的PBS处理组（n = 10）和SAS处理组（n = 9）小鼠脾脏中CD4+ T细胞、Th1细胞（IFN-γ+/IL-17-）、Th17细胞（IFN-γ-/IL-17+）以及调节性T细胞（Foxp3+）的比例。（B，左图）来自健康小鼠脾脏（n = 4）、PBS处理组（n = 5）和SAS处理组（n = 5）EAE诱导小鼠CD4+细胞群中Ki-67+细胞的比例。单因素方差分析（one-way ANOVA）显示，健康小鼠脾脏中Ki-67+细胞比例与PBS或SAS处理的EAE小鼠脾脏相比具有统计学显著性差异；而PBS处理组与SAS处理组EAE小鼠脾脏之间无显著差异。（B，右图）代表性散点图；数字表示增殖比例。散点图显示百分比数值。柱状图采用双尾t检验分析，***p &#60; 0.001。经许可重印自（11）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig6.jpg" /> 
图6. SJL 小鼠 EAE 模型中免疫细胞浸润后的药物治疗 临床评分（均值 &#177; 经PBS（n = 8）或SAS（n = 8）处理的SJL小鼠在免疫后第24天（虚线）给予PLP后的扫描电镜（SEM）结果139-151数据为均值 &#177; 临床评分的扫描电镜分析。统计学差异采用非参数双尾Mann-Whitney U检验确定，***p &#60; 0.001。顶行表示用于统计分析的数值。经（11）许可重印。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig7.jpg" /> 
图7. 使用光密度法对MBP染色进行定量分析。 （A）未指明基因敲除小鼠与同窝对照C57BL/6小鼠在诱导EAE后胸段脊髓中MBP的代表性染色结果。括号标注的区域显示MBP染色减弱，提示脱髓鞘。（B）未指明基因敲除C57BL/6小鼠胸段脊髓的MBP染色结果。（C）与诱导EAE的野生型（WT；n = 3只小鼠，每只动物2 - 4个腰段和胸段切片）小鼠相比，诱导EAE的未指明基因敲除小鼠（KO；n = 6只小鼠，每只动物2 - 4个腰段和胸段切片）脊髓中MBP染色的光密度（OD）更高。采用双尾t检验进行统计分析，*p &#60; 0.05。误差线表示标准误（SEM）。比例尺：100 µm。

本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，其主要特征之一是免疫细胞浸润进入脑和脊髓，导致……

该概念性方法的总体目标是确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是在免疫细胞浸润攻击期间发挥其中枢神经系统保护作用，还是通过抑制免疫细胞浸润而产生保护效果。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如，调控EAE治疗时间如何区分对免疫细胞浸润的影响与神经保护作用之间的差异。该技术的意义还延伸至多发性硬化症的治疗，因为目前尚无针对此病的神经保护疗法。我们最初产生这一方法的想法，是在发现使用系统Xc-转运体抑制剂处理EAE小鼠具有神经保护和免疫调节双重作用时。尽管该方法可用于研究药物治疗，也可应用于接受EAE或其他干预措施的基因敲除小鼠的研究。首先使用无菌剪刀将单个动物的脑组织和脊髓剪切成小块。然后每份组织使用一个3毫升注射器活塞，将每份样本通过70微米细胞筛网研磨至各自的50毫升锥形管中，同时用培养基冲洗筛网。当所有组织块均被充分研磨后，用新鲜培养基将各管中的体积补足至50毫升，随后离心细胞悬液。将每个沉淀重悬于4 mL的40%密度梯度溶液中。然后，沿各支15 mL锥形管的管壁缓慢加入细胞悬液，覆盖在每管2 mL的70%密度梯度溶液之上。通过离心分离细胞，并使用1 mL移液器小心弃去上层髓鞘层。接下来，将样品界面中的活细胞转移至新的15毫升锥形管中，并用每管15毫升新鲜培养基洗涤细胞，最终体积为15毫升。将细胞沉淀重悬于200微升新鲜培养基中，并将细胞悬液分别转移至96孔圆底板的各个孔中。离心板后弃去上清液。然后，将沉淀重悬于200 µL再刺激培养基中，在37°C条件下孵育细胞4小时。孵育结束后，再次离心培养板并弃去上清液。随后用200 µL含2% FCS的PBS洗涤细胞，并将细胞重悬于200 µL含2% FCS和FC阻断剂的PBS中，冰上孵育10至15分钟。孵育结束后，按上述方法洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于15微升细胞表面染色混合液中，冰上孵育15分钟。随后离心收集细胞，并用200微升PBS洗涤两次。接着，根据生产商说明书，将细胞重悬于FOXP3转录因子染色试剂中，4摄氏度避光孵育30分钟至过夜。孵育结束后，用150微升破膜缓冲液洗涤细胞。然后离心细胞，并将沉淀重悬于15微升破膜缓冲液中的目标胞内抗体中，置于冰上。30分钟后，离心细胞，随后用200微升破膜缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于200 µL PBS中，并通过流式细胞术分析样品，圈选活的CD4阳性、TCRβ阳性细胞。评估外周T细胞增殖情况也非常重要，因为外周的变化可能影响免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。为了量化EAE诱导后脊髓组织样本中星形胶质细胞和胶质细胞的数量，需以4倍放大倍数获取每张切片的图像，并将图像保存为TIFF文件。接下来，在 ImageJ 中选择目标图像，使用多边形选区工具勾勒出整个脊髓组织切片的轮廓。在图像菜单下，选择“类型”并转换为 16 位，以将图像转换为 16 位格式。然后，打开“处理”菜单，选择“减去背景”，并将滚动球半径设置为至少等于背景中最大非背景物体的尺寸。检查滑动抛物面并点击“确定”。然后，在“图像”下选择“调整”和“阈值”，使用滑动条设置下限阈值水平。为获得选定区域内阈值化面积的百分比，在“分析”和“设置测量”下选择“面积分数”。确保未勾选“限制为阈值”，且已勾选“显示标签”，然后点击“确定”。为获取测量结果，在“分析”下选择“测量”。将出现一个结果弹出窗口。保存此数据，并比较不同处理组之间的面积分数值。为了通过光密度定量髓鞘碱性染色，打开目标图像，并使用多边形选择工具在样本内绘制感兴趣区域。在“分析”和“设置测量”中，选择“平均灰度值”，并确认未勾选“限制为阈值”，同时勾选“显示标签”。点击“确定”。然后，在“分析”菜单下选择“测量”。将弹出一个新的结果窗口，显示髓鞘碱性蛋白的平均灰度值数据。脊髓取出及流式细胞术分析可用于评估中枢神经系统中免疫细胞的浸润情况，其中免疫细胞浸润在疾病高峰期达到最高水平。对 CD4 阳性、干扰素 γ 阳性、IL-17 阳性以及 FOXP3 阳性细胞数量进行统计学分析，可揭示经药物处理动物与对照动物之间 CD4 阳性浸润性 T 细胞数量变化的显著性差异，而深入的共表达分析对于排除因细胞比例偏移导致的整体 CD4 阳性浸润性 T 细胞数量减少的混杂因素至关重要。为排除中枢神经系统浸润性 T 细胞减少可能是由于外周 T 细胞增殖、活化和分化受到抑制所致，还可进一步评估处于活跃增殖状态的 T 细胞数量及 T 细胞亚群的比例。为了对髓鞘完整性进行定量评估，可对髓鞘碱性蛋白染色的光密度进行统计学分析，例如，结果显示未明确的基因敲除动物与野生型同窝对照相比，脊髓组织出现显著的脱髓鞘现象。为进一步证实神经炎症是否因治疗干预而持续或减轻，还可通过测量反应性胶质增生的平均面积比例来评估反应性胶质增生，方法如前所述。一旦掌握，流式细胞术若操作得当可在两天内完成，而每种染色的组织染色定量分析则大约需要两小时。可通过在免疫细胞浸润前给予治疗，以评估T细胞迁移和增殖的变化，从而检测免疫调节作用。通过在疾病高峰期（即免疫细胞已浸润中枢神经系统后）给予治疗，可评估对中枢神经系统的保护作用。在进行该操作时，需注意在ImageJ中设置最佳阈值，以确保仅特异性地突出显示细胞染色部分。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估特定处理对中枢神经系统、T细胞增殖及迁移反应的影响。通过改变免疫细胞浸润前后的时间点进行处理，可实现这一评估。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

确定免疫系统抑制中枢神经系统对保护药物干预自身免疫性脱髓鞘

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。...

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

一种用于小鼠脊髓成像的新型ex...

双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

通过将溶血卵磷脂局部施用于中枢神经系统，可以在动物体内建立脱髓鞘疾病的模型。向小鼠脊髓单次注射溶血卵磷脂可产生一处病灶，该病灶会随时间推移自发修复。本研究的目的是探讨参与脱髓鞘及再髓鞘化过程的相关因素，并测试能够促进修复的干预手段。...

小鼠脊髓局灶性注射溶血卵磷脂诱导脱髓鞘与再髓鞘化的实验方法

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

本方案描述了一种溶血磷脂酰胆碱的两点注射法 通过...

一种稳定建立的溶血磷脂酸胆碱诱导小鼠局灶性脱髓鞘两点注射模型

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

了解实验性自身免疫性脑脊髓炎药物干预方法，通过流式细胞术分析免疫细胞浸润与中枢神经系统保护机制。该技术有助于多发性硬化症治疗策略的研究与开发。

确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用

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