Name: 原发肿瘤发展小鼠实验模型和腹膜转移通过原位接种卵巢癌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 了解原位接种卵巢癌细胞建立小鼠原发肿瘤及腹膜转移模型的方法。该技术有助于研究卵巢癌腹膜播散机制，为开发治疗策略提供重要实验基础。

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作者感谢妇产科及癌症生物学系成员提供的有益讨论和技术支持。本研究由日本科学促进会（JSPS）科学研究费补助金（15K15604；授予 H. Kajiyama）资助。

治疗方案遵循名古屋大学采纳的动物实验指导原则。
1. 细胞悬液的制备
<ol>
	<li>人卵巢透明细胞癌细胞系。
	<ol>
		<li>将ES-2细胞12 培养于含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（青霉素：100单位/毫升，链霉素：0.1毫克/毫升）的RPMI-1640培养基中。于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养细胞。</li>
		<li>用0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液（胰蛋白酶/EDTA）收集处于对数生长期的细胞。
		<ol>
			<li>首先从细胞培养容器中移除旧培养基，然后用PBS洗涤细胞一次（无Ca2+/Mg2+的PBS，每25 cm2加3–4 ml）。</li>
			<li>接着每25 cm2加入1 ml胰蛋白酶/EDTA，旋转培养容器使胰蛋白酶/EDTA覆盖细胞单层。吸除并弃去胰蛋白酶/EDTA后，将培养容器放回培养箱中孵育3–5分钟，或直至细胞脱落。</li>
			<li>在显微镜下观察细胞，确认细胞已从培养容器表面脱落并悬浮。</li>
			<li>加入含新鲜血清的生长培养基以灭活胰蛋白酶（每25 cm2加5 ml），重悬细胞。将重悬后的细胞转移至15 ml锥形管中。</li>
			<li>以300 × g离心5分钟。可在4 °C或室温下进行离心。小心吸除上清液，并用生长培养基重悬细胞（每25 cm2加5 ml）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对细胞进行计数（例如，通过台盼蓝排斥法），然后以2 × 108 个细胞/毫升的密度重悬于生长培养基中。将细胞悬液置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰浴中解冻基于细胞外基质（ECM）的水凝胶冻存 aliquot。</li>
	<li>按1:1的比例将细胞悬液加入基于ECM的水凝胶aliquot中（最终细胞浓度：1 × 105 个细胞/µl 培养基-ECM水凝胶），充分混匀。将制备好的细胞悬液置于冰浴中待用。</li>
</ol>
2. 细胞悬液的原位接种
注意：手术无需专用手术室。手术可在实验室工作台面上进行，但应选择房间内独立且活动较少的区域。也可使用层流罩。必须使用无菌外科器械，且不得使用剪刀进行皮肤切口。
<ol>
	<li>使用8周龄的雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）进行该原位接种模型实验。</li>
	<li>首先，使用异氟烷（2 - 4%）吸入麻醉小鼠。通过用力捏压脚趾无回缩反应来确认麻醉深度。小鼠麻醉后，根据需要在其眼睛上涂抹无刺激性的无菌眼膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠腹侧朝下置于手术台上。使用酒精以及含碘或含氯己定的消毒剂反复消毒手术区域数次。</li>
	<li>在右侧肋弓与股骨之间靠近脊柱处，纵向做一个约2厘米的切口。在切口周围使用无菌手术巾。用夹子固定切开的皮肤边缘以保持切口开放。 
	注意：可使用牵开器代替止血钳。</li>
	<li>接下来，在第一切口下方的壁层腹膜上做第二个切口（约1 cm），以打开腹腔。用止血钳夹住切开的腹壁切口边缘。用止血钳夹住包围同侧卵巢和输卵管的脂肪组织，将卵巢从腹腔中取出。小心地将卵巢和输卵管置于纱布上。然后，将小鼠腹部朝下放置于解剖显微镜下。</li>
	<li>将细胞悬液在注射前置于胰岛素注射器（1/2 cc，29 G）中。小心地将制备好的细胞悬液（1–2 µl）注入卵巢。注射后保持针头在卵巢内数秒，以确保基于细胞外基质的水凝胶发生凝胶化。凝胶化完成后，注入的肿瘤细胞将保留在卵巢内部。</li>
	<li>将卵巢小心放回体内。用无菌医用丝线缝合第二处切口，然后用伤口夹封闭皮肤。</li>
	<li>术后，小鼠将接受镇痛处理（例如，美洛昔康，肌内（i.m.）或皮下（s.c.）注射，0.2 mg/kg，持续最初24小时&#160;时期。</li>
</ol>
3. 术后治疗
<ol>
	<li>将每只小鼠单独置于一个笼子中，笼内铺上干净的纸巾并放置暖包，以保持小鼠体温，直至其恢复足够的意识并能维持胸卧位。随后，将动物放回笼中进行饲养和观察。手术处理后每日观察小鼠 3 至 7 天。</li>
	<li>术后小鼠的观察
	<ol>
		<li>若出现疼痛症状，每日给予镇痛药物（例如，美洛昔康，肌内或皮下注射，0.2 mg/kg）。</li>
		<li>若小鼠出现感染迹象（例如，红肿、分泌物），每日注射抗感染试剂（例如，青霉素，肌内注射，100,000 IU/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后 10 至 14 天拆除皮肤闭合材料。</li>
</ol>
4. 肿瘤与转移灶的分析
注意：接种后2-3周，注射侧卵巢将形成肿瘤。
<ol>
	<li>通过二氧化碳处死小鼠，然后采集样品（例如肿瘤、转移灶、器官13-15 用于进一步分析14,16-20. 
	注意：如果一个 体内 成像系统可用时，可检测表达能够产生生物发光的酶的细胞（例如，荧光素酶）或荧光蛋白（例如，GFP）可用于本实验方案。该改良方案将为癌细胞从原发性肿瘤扩散的动态过程提供有价值的信息。</li>
</ol>

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<li>Kajiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+patients+with+recurrent+epithelial+ovarian+carcinoma%3A+is+it+the+same+for+each+histological+type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type.</a> Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+intensity+analysis+of+carotid+artery%3A+a+noninvasive+technique+for+assessing+hemodynamic+changes+of+hyperthyroid+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huazhong+Univ+Sci+Technolog+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients.</a> J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

动物模型对于分析肿瘤发生、发展、转移以及抗癌药物对癌细胞作用机制至关重要。携带人卵巢癌细胞的小鼠也已被用作动物模型。本文介绍一种在原位接种卵巢肿瘤细胞的微创操作方法。该方法通过背部侧 flank 的腹膜后途径将细胞接种至卵巢，相较于其他常用技术具有显著优势。首先，原位接种能够更高效、准确地模拟人类肿瘤微环境13,21。其次，这种从背部 flank 进行的腹膜后入路仅需较小的切口（&#60; 1 - 2 cm），与腹腔入路相比操作更为快速。因此，该腹膜后入路对小鼠的创伤更小。第三，小鼠卵巢体积很小，难以容纳大量试剂。在本方案中，我们采用高浓度细胞悬液（1 × 105 个细胞/µl）并以单次低接种体积（1 - 2 µl/次）进行注射，从而最大限度减少对卵巢的损伤，同时避免接种细胞从卵巢泄漏。尽管仍需进一步研究，但所述的小鼠原位接种方法可能为未来上皮性卵巢癌（EOC）新疗法的开发提供有力支持。
该实验方案中有两个关键点。首先，细胞应处于对数生长期使用。其次，用基于细胞外基质（ECM）的水凝胶悬浮的细胞需置于冰上直至使用。当基于ECM的水凝胶开始...

上皮性卵巢癌（EOC）在妇科恶性肿瘤中导致的癌症相关死亡率最高1。EOC 预后较差，主要原因是其症状出现较晚，且常伴有多种腹膜内播散和远处转移2-4。腹膜播散是一个多步骤过程：首先，肿瘤细胞从原发灶脱落并迁移至腹腔内；当肿瘤细胞附着于腹膜间皮层后，便开始通过间皮层侵入组织5,6。为了更好地理解肿瘤生物学特性（例如，癌症进展和治疗反应），小鼠模型提供了大量信息。将人源癌细胞移植到小鼠体内的异种移植模型被广泛应用，人癌细胞可通过皮下、腹腔内、静脉内或原位接种等方式植入。与异位移植的动物模型相比，原位移植肿瘤的动物模型能够更高效、更准确地模拟人类肿瘤微环境。因此，针对多种人类肿瘤，已建立了原位移植模型7-11。
本文描述了通过腹膜后途径从背部 flank 区域进行人 EOC 细胞原位接种的方法，与腹侧接种相比，该方法的侵入性更小。该技术可提供关于 EOC 的多种有用信息，尤其是腹膜内播散的机制。

<table><tbody><tr><td>Matrigel 基质&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>基于细胞外基质的水凝胶</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS-05M2913</td><td>1/2 cc，29 G × 1/2&quot;</td></tr><tr><td>带缝线的缝合针</td><td></td><td></td><td>11 mm，3/8，尼龙线 6-0</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm 伤口缝合钉施加器</td><td>CellPoint Scientific</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Reflex 7 mm 伤口缝合钉</td><td>CellPoint Scientific</td><td>203-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

上皮性卵巢癌（EOC）因具有腹膜播散特性而预后不良。为了改善预后，控制腹膜播散至关重要。然而，肿瘤细胞如何从原发灶脱落并黏附于间皮层的机制尚不明确。建立合适的动物模型对于阐明腹膜播散的机制十分必要 体内在本研究中，我们介绍了从人上皮性卵巢癌（EOC）细胞局部注射至小鼠卵巢表面，到肿瘤发生腹膜及远端器官转移的完整过程。实验采用8周龄雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）。在显微镜视野下，将EOC细胞（1 × 105 通过背部侧腹膜后途径，将细胞/µl 培养基-细胞外基质（ECM）-基水凝胶/单侧卵巢/小鼠注入小鼠卵巢。该方法是一种对小鼠创伤较小的微创操作，可最大限度减少对卵巢的损伤。本文中，我们描述了卵巢上皮性癌（EOC）原发性及转移性肿瘤形成的实验方法步骤。

按照本实验方案，将人透明细胞癌细胞系 ES-2 接种至 6 只裸鼠的卵巢中。如图 1A所示，接种后 2 周，6 只小鼠中有 5 只在接种 ES-2 细胞的卵巢中形成肿瘤，而未接种细胞的对侧卵巢（作为对照）未见肿瘤形成。此外，5 只成瘤小鼠中有 2 只出现多发性腹膜播散并伴有腹水。癌细胞转移至肝脏（图 1B）。将两侧卵巢（包括接种部位形成肿瘤的卵巢及对侧对照卵巢）取出，进行解剖、切片、苏木精-伊红（HE）染色，并在显微镜下观察分析（图 2）。在接种侧卵巢中观察到大量卵巢癌细胞，而在对侧未见癌细胞。癌细胞形态与亲本肿瘤一致。
<img alt="ES2细胞器官暴露实验；接种与未处理器官的解剖对比。" src="/files/ftp_upload/54353/54353fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" d...

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。

上皮性卵巢癌（EOC）因具有腹膜播散特性而预后不良。为改善预后，有必要……

本实验的总体目标是观察上皮性卵巢癌中原发性肿瘤和转移性肿瘤的形成过程。该方法有助于回答妇科肿瘤学领域的一些关键问题，例如理解肿瘤生物学特性或腹膜播散机制。该技术的主要优势在于，通过腹膜后途径在背部 flank 区域接种人源上皮性卵巢癌（EOC 细胞），可实现肿瘤的原位生长。为准备人卵巢透明细胞癌细胞系，将 ES2 细胞接种并维持在含 10% FBS 和青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、5% CO2 条件下培养。在细胞处于对数生长期时，吸除培养皿中的旧培养基，加入三至四毫升 PBS 洗涤细胞一次。随后，加入一毫升胰蛋白酶/EDTA 溶液，并轻摇容器使液体覆盖整个单层细胞。去除并弃去胰蛋白酶溶液，将细胞放回培养箱中孵育三至五分钟。在显微镜下观察细胞，确认细胞已脱落并悬浮后，加入五毫升含新鲜血清的生长培养基以灭活胰蛋白酶，并重悬细胞，随后转移至 15 毫升锥形管中。在室温下以 300 × g 离心该细胞悬液

murine-experimental-model-original-tumor-development-peritoneal

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

原发肿瘤发展小鼠实验模型和腹膜转移<em&gt;通过</em&gt;原位接种卵巢癌细胞

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像...

用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

在本视频中，我们演示了以下内容的开发过程  一个 体外...

在腹膜腔衬里中模拟卵巢癌转移：一种建立腹膜衬里体外三维模型的方法

在本视频中，我们展示了在小鼠模型中进行卵巢癌细胞的子宫内注射。这种原位小鼠模型有助于我们无创地监测肿瘤生长，并评估新疗法在预防和治疗复发性卵巢癌方面的有效性。...

子宫内癌细胞注射：一种用于建立腹腔内卵巢癌小鼠模型的癌细胞递送技术

本视频介绍了用于研究肿瘤发生及腹膜转移的鼠类实验模型的建立方案。该卵巢癌模型通过将人卵巢上皮癌细胞原位接种至雌性小鼠的卵巢而建立。...

将卵巢癌细胞原位接种至小鼠卵巢：建立用于研究癌细胞腹膜播散的卵巢癌小鼠模型的操作步骤

关键词：卵巢癌，小鼠模型，原位接种，腹膜播散，癌细胞转移，卵巢，动物实验

我们描述了一种非侵入性动物成像平台，可用于检测、定量和监测卵巢癌的生长及复发。这种腹腔内异种移植模型模拟了卵巢癌患者的临床特征。...

用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体...

腹腔内卵巢癌转移的定量分析

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo...

一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。...

体内 模型用于检测缺氧对肿瘤转移的影响

了解原位接种卵巢癌细胞建立小鼠原发肿瘤及腹膜转移模型的方法。该技术有助于研究卵巢癌腹膜播散机制，为开发治疗策略提供重要实验基础。

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

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