使用 CeleST 软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为进行自动化分析

本方法的总体目标是利用名为 CeleST 的计算机视觉软件，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为进行定量评估，即“秀丽隐杆线虫游泳测试”。该分析方法有助于研究基因突变或药物干预对秀丽隐杆线虫游泳行为的影响，也可便捷地评估与年龄相关的运动能力下降。该技术的主要优势在于可同时追踪多只动物，并对游泳姿态的多个方面进行分析，从而量化游泳行为的八个参数，且支持自动化数据评估。

首先准备一台体视显微镜和数字CCD相机，以及一台装有数字视频录制软件和用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为分析的计算机视觉软件的计算机。在数字视频录制软件中设置以下参数：用深色布料覆盖显微镜，以防止载玻片上游泳液滴区域产生反光，从而提高图像质量。调节显微镜的工作距离和放大倍数，以确保游泳区域的完整视野，并调整底座反光镜，使动物与背景之间具有清晰的对比度。

然后，将照明设置为暗场，以便在黑色背景上将成虫的身体观察为白色。接着，用移液器将60微升1×M9缓冲液加入到显微镜载玻片上预先印制的10毫米环内，并确保液滴完全覆盖环的内部区域。将四条成虫线虫转移至1×M9缓冲液液滴中，同时尽量减少携带可能使液体浑浊的细菌。

通过以下两种方法之一减少泳道中的细菌：在转移线虫前，让其在培养皿未接种的区域短暂爬行，或在记录前轻轻混匀泳道以分散微量细菌。接着，将载有成虫线虫的载玻片置于显微镜载物台上，以记录其在液体中的游泳行为，每次录制30秒视频。开始录制时，在“主页”菜单下的RAM中选择“新建序列”，然后按下红色录制按钮。

最后，录制完成后，单击“Home”标题并选择“Export Full Sequence”，以将视频分割为一系列图像帧。首先，通过点击“Run”按钮，从Mat Lab中启动用于C.elegans游泳行为分析的计算机视觉软件。在游泳分析程序的主屏幕上，使用“Add one video”或“Add multiple videos”按钮，逐个或分组上传图像帧序列，同时添加相关标签，例如基因型、日期、实验次数和持续时间。

然后，点击“Process videos”以在上传的视频序列中实现对多个动物的同时追踪。在新出现的界面中，于左侧框内选择所需的视频，然后点击“Add to the list”。接下来，通过在圆环内选择三个点来划定游泳区域，并点击“Process all the videos listed above”以开始处理。视频处理的进度可在屏幕底部中央查看。

完成处理后，关闭视频处理界面。首先点击“Compute measures”以打开一个新界面，在此界面中可逐个上传已处理的视频，用于验证或拒绝单个动物的轨迹追踪结果。通过此手动步骤，重点关注追踪失败的区域（以红色块标注）并对比追踪成功的区域（以绿色块标注）。

在屏幕下半部分横向的第一个颜色条中查找“分段身体”的有效性。注意，有效帧的百分比以绿色显示，被拒绝帧的百分比以红色显示。然后，使用“下一区块”、“切换有效性”、“分割区块”和“隔离帧”选项来导航并修改有效或被拒绝的帧区块。

在动物数量稀少的游泳区域中，若极少数情况下两只动物相遇，可使用“Switch”按钮，在特定的帧范围内切换它们的编号。最后，点击“Save and compute measures”以保存有效性输入，然后再上传另一段已处理的视频。随后选择“Close”以退出“Compute Measures”界面。

请注意，软件会在后台自动计算单个动物游泳表现的曲率图以及后续所述的八个参数。在计算机视觉软件程序的主界面，点击“显示结果”以获取分析输出。然后，通过在左侧框中选择已分析的帧序列，并点击“添加到选定样本组”或“添加到新样本组”按钮，将其移至现有或新建的样本组中，以进行统计处理。

单击“显示这些样本的图表”，进入第二个屏幕，通过屏幕顶部的选择项，查看八个参数中每个参数对应的样本图表和关键统计信息。接着，选择“二维直方图”，通过屏幕左侧的X轴测量值和Y轴测量值下拉菜单，绘制任意两个参数组合的图表。单击“关闭”，退出并返回“显示结果”屏幕。

然后，选择屏幕左上方的导出按钮，将详细的数值数据保存为 csv 文件，以便在电子表格程序中打开并进一步处理。最后，选择“关闭”以退出“显示结果”界面，并返回主界面。单击“退出”以确保保存包含已分析视频序列的数据库。

即使在遗传背景有利的情况下，某些游泳参数（如波浪启动频率、活动指数、划动动作和移动速度）也会随着年龄增长而逐渐下降。另一方面，在野生型和衰老突变型成虫中，体波数量、不对称性、伸展度和卷曲参数则随年龄增长呈上升趋势。尽管所有线虫都从健康的成年阶段开始生命历程，但有些个体迅速丧失身体机能，而另一些个体则能在较长时间内保持活力，这表明衰老不良个体的健康寿命显著短于衰老良好个体。

一旦掌握，对四条游泳线虫的分析可在数分钟内完成。每段视频的计算分析耗时约六分钟，且可远程进行。每天处理 250 只动物是可行的。

观看本视频后，您应能够充分理解如何获取游泳实验的视频，并处理数据以评估液体中的运动能力。