Name: 重新编程的小鼠胚胎成纤维细胞转录因子诱导Hemogenic计划 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习通过转录因子过表达在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序，无需经过多能性中间阶段即可生成造血前体细胞。该方法为研究造血编程和开发血液疾病新疗法提供了重要工具。

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本工作获得了针对 K.M. 和 I.R.L. 的 NHLBI 资助（1RO1HL119404）。Carlos-Filipe Pereira 获得了雷夫森高级生物医学博士后奖学金。我们衷心感谢西奈山人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞共享资源中心及 S. D'Souza 在材料和实验方案方面提供的协助。同时感谢西奈山流式细胞术、基因组学和小鼠实验平台的支持。

伦理声明：小鼠细胞系的制备需遵循西奈山伊坎医学院的动物护理指南，并应符合任何所在机构的相关规定。
1. C57BL/6 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离
<ol>
	<li>设置定时交配13。一旦观察到阴道栓，记为第0.5天。</li>
	<li>在发现阴道栓的当天将雌鼠分离，并于第10-11天检查以确认是否怀孕。</li>
	<li>在第13.5-14.5天，通过吸入CO2的方式对怀孕雌鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>用70%乙醇浸泡怀孕雌鼠腹部，使用无菌剪刀和镊子沿腹中线切开腹腔，手术取出含有胚胎的子宫角14。在切除残余腹腔组织的同时轻柔取出胚胎。 
	注意：每侧约获得4个胚胎，共约8个胚胎。</li>
	<li>将含有胚胎的子宫角放入盛有5-10 ml无菌冷磷酸盐缓冲液（PBS）的10 cm培养皿中。</li>
	<li>使用无菌剪刀和镊子沿子宫角剪开，分离出携带胚胎的胚囊。将胚囊转移至另一盛有5-10 ml无菌冷PBS的新10 cm培养皿中，并置于冰上。</li>
	<li>取部分胚囊放入另一盛有5-10 ml无菌冷PBS的10 cm培养皿中。使用无菌剪刀和镊子轻轻剪开胚囊（避免切得过深），以防刺破胚胎。</li>
	<li>剪断脐带，将胚胎与胎盘分离。</li>
	<li>将胚胎转移至另一盛有5-10 ml冷PBS的10 cm培养皿中，在完成其余解剖操作期间保持冰上放置。</li>
	<li>使用无菌镊子将胚胎头部去除。从去头部位开始，使用无菌剪刀和镊子沿胚胎中线小心剪开体腔以暴露腹腔。将镊子置于内脏器官（包括心脏、肝脏和肺）下方，轻轻刮除这些组织15。</li>
	<li>用剪刀和镊子将剩余组织剪成小块，并转移至含有10 ml胰蛋白酶的50 ml锥形管中。</li>
	<li>使用10 ml移液器上下吹打20-30次，以混合并解离组织。</li>
	<li>将组织与胰蛋白酶混合物置于37 °C水浴中孵育45分钟，期间偶尔摇动。</li>
	<li>使用10 ml移液器上下吹打约5分钟，以混匀内容物。</li>
	<li>将消化后的细胞加入3倍体积的标准达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），其中含有10%胎牛血清（FBS）、10 µg/ml青霉素/链霉素（P/S）和1 mM L-谷氨酰胺（L-GLUT），分装至10 cm培养皿（约10 ml），于37 °C培养至细胞融合（约2-4天）。每10 cm培养皿培养约1-2个胚胎的组织。 
	注意：细胞长满后即可冻存。冻存细胞解冻后可再传代2次。也可在冻存前传代2次，解冻后再传代1次。</li>
</ol>
2. 病毒制备
<ol>
	<li>使用含10% FBS、1% P/S和1% L-GLUT的10 ml DMEM在10 cm培养皿中扩增293T细胞以进行转染。
	<ol>
		<li>用2 ml胰蛋白酶消化293T细胞，在37 °C孵育5分钟，将细胞收集至15 ml离心管中，以300 × g离心，然后按适当密度接种（每10 cm培养皿10 ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染前24小时，将汇合的10 cm培养皿中的293T细胞按1:6比例传代，并接种于经0.1% PBS配制的明胶包被的10 cm培养皿中。 
	注意：每种病毒需要4个培养皿。
	<ol>
		<li>进行明胶包被时，向每个10 cm培养皿中加入至少2 ml 0.1%明胶溶液，确保底部完全覆盖。在37 °C孵育至少20分钟。在接种细胞前吸除明胶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 ml离心管中加入84 µg质粒（例如Gata2、Gfi1b、cFos或Etv6（亚克隆至pFUW-TetO载体16）或FUW-M2rtTA17）、84 µg psPAX2和42 µg pMD2.G。加入水（H2O）定容至2 ml。为每个因子（例如 Gata2、Gfi1b、cFos、Etv6和FUW-M2rtTA）分别准备一个离心管。</li>
	<li>向每个含有2 ml混合液（84 µg目标基因（Gata2、Gfi1b、cFos、Etv6或FUW-M2rtTA）+ 84 µg psPAX2 + 42 µg pMD2.G + H2O）的离心管中加入250 µl 2M CaCl2。</li>
	<li>将巴斯德吸管插入移液器辅助装置中，向含2.25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl2的混合液中缓慢释放气泡。在产生气泡的同时，将P1000移液器的吸头紧贴玻璃吸管，沿管壁缓慢逐滴（每次1 ml）加入2 ml 100 mM N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸（BES）盐溶液。</li>
	<li>将所有离心管置于超净台中室温孵育至少15分钟。 
	注意：4.25 ml混合液（现为DNA + H2O + 2M CaCl2 + BES盐溶液）将呈现轻微浑浊。</li>
	<li>在混合液孵育期间，吸除293T细胞培养皿中的培养基，并加入10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-谷氨酰胺 + 25 nM氯喹。 
	注意：该培养基不含P/S。</li>
	<li>孵育至少15分钟后（或在更换293T细胞培养基的同时），将4.25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl2 + BES盐溶液逐滴加入293T细胞中，每管混合液均匀分配至4个细胞培养皿（即每个培养皿加入略多于1 ml混合液）。</li>
	<li>将培养皿在37 °C孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>孵育24小时后，将所有培养皿中的培养基更换为4 ml标准DMEM（见步骤1.15）。</li>
	<li>此后将细胞置于32 °C培养箱中继续培养。</li>
	<li>在步骤2.10之后24小时，将培养基分别收集至50 ml离心管中。每块培养皿用4 ml标准DMEM替换已收集的培养基。 
	&#8203;注意：每管初始混合液对应4个培养皿，共收集16 ml培养基。
	<ol>
		<li>再孵育12小时后，再次将培养基收集至同一50 ml离心管中，并更换为另外4 ml标准DMEM。</li>
		<li>再孵育12小时后，收集培养基并加入同一50 ml离心管中。 
		注意：每管离心管中此时应含有约48 ml含病毒的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为浓缩收集的病毒，首先将收集的培养基通过0.45 µM低蛋白结合滤膜进行过滤。</li>
	<li>将过滤后的含病毒培养基倒入病毒浓缩离心管中（每次约16 ml）。</li>
	<li>在4 °C下以4,000 × g离心25分钟，并弃去滤过液。 
	注意：滤膜中将可见少量浓缩的培养基和病毒。</li>
	<li>向滤膜中残留的浓缩培养基+病毒中加入另外16 ml过滤后的含病毒培养基，并通过倒置离心管混匀。</li>
	<li>再次在4 °C下以4,000 × g离心25分钟，并弃去滤过液。</li>
	<li>将剩余的过滤后收集液加入滤膜中残留的浓缩培养基+病毒中，并通过倒置离心管混匀。</li>
	<li>最后一次在4 °C下以4,000 × g离心10–20分钟（根据滤膜中液体体积而定），确保滤膜中残留的浓缩培养基+病毒体积约为1 ml。若残留体积大于1 ml，再以4,000 × g离心1分钟，并重复操作直至滤膜中剩余1 ml。</li>
	<li>将浓缩病毒按每管200 µl分装至1.5 ml离心管中，于-80 °C冻存或立即使用。</li>
</ol>
3. MEF 重编程
<ol>
	<li>在6孔板中每孔加入0.5 ml含0.1%明胶的PBS溶液进行预包被，确保明胶完全覆盖孔底表面。置于37 °C培养箱中孵育至少20分钟。孵育结束后取出，吸除明胶溶液。</li>
	<li>将MEF细胞以每孔25,000个细胞（每6孔板共150,000个细胞）的密度接种于步骤3.1中已包被明胶的6孔板中，置于37 °C培养箱中过夜培养使其贴壁。</li>
	<li>通过混合50 µl M2rtTA与剩余的50 µl病毒液（包含Gata2、Gfi1b、cFos和Etv6，各12.5 µl）制备100 µl病毒混合液。</li>
	<li>吸除MEF细胞的培养基，每孔加入含8 µg/ml六亚甲基溴化铵（hexadimethrine bromide）的2 mL标准DMEM培养基。</li>
	<li>每孔加入15 µl病毒混合液进行转导，于37 °C培养箱中过夜孵育。 
	注意：此为重编程过程的第0天。</li>
	<li>第1天，在孵育16–20小时后，弃去原培养基，每孔更换为2 ml新鲜的标准DMEM培养基，并添加1 µg/ml DOX。</li>
	<li>制备添加以下成分的造血培养基：氢化可的松（10-6 M）、100 ng/ml干细胞因子（SCF）、100 ng/ml Fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）、20 ng/ml白细胞介素-3（IL-3）、20 ng/ml白细胞介素-6（IL-6）以及1 µg/ml DOX。</li>
	<li>第4天，吸除各孔中的培养基，每孔用1 ml PBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>吸除PBS，每孔加入1 ml 0.05%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，以300 × g离心5分钟，弃上清后将细胞重悬于12 ml步骤3.7所述的造血培养基中，按每6孔板60,000个细胞（每孔10,000个细胞，每孔2 ml）接种至0.1%明胶包被的培养板中。</li>
	<li>在整个培养期间（35至36天），每隔6天更换一次新鲜的补充造血培养基。</li>
	<li>通过免疫染色12、FACS分析8,12、qRT-PCR12和mRNA测序12对中间阶段细胞或出现的类造血细胞进行分析，以确认其获得造血内皮细胞或类造血干细胞（HSC-like）的标志物表达及基因表达特征。</li>
</ol>
4. 甲基纤维素中的胎盘聚集和集落形成单位（CFU）实验
<ol>
	<li>按照先前所述方法18分离 E12.5 天的 C57BL/6 孕鼠胎盘，并将组织置于冰上保存。</li>
	<li>为开始胎盘解离19，用 2–5 ml 含 20% 胎牛血清（FBS）的 PBS 配制的 0.2% I 型胶原酶溶液洗涤胎盘组织，并使用装有 18G 针头的 5 ml 注射器进行机械解离，将胎盘与 PBS 溶液反复通过针头至少 3 次。</li>
	<li>机械解离后，将胎盘细胞置于 2–5 ml 胶原酶溶液中，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。</li>
	<li>再用安装在 5 ml 注射器上的 20–25G 针头反复吹打数次，进一步机械解离胎盘细胞。</li>
	<li>通过 70 µm 细胞滤器过滤获得单细胞悬液。</li>
	<li>用血细胞计数板计数细胞，并以 2,000 cGy 剂量照射，以实现有丝分裂失活20。</li>
	<li>在 10 cm 培养皿中加入 10 ml 含 100 ng/ml SCF、100 ng/ml Flt3L、20 ng/ml IL-3、20 ng/ml IL-6 和 10 ng/ml 血小板生成素（TPO）的造血培养基。 
	注意：此阶段无需添加 DOX。</li>
	<li>将 0.65 µm 滤膜直接放置于培养皿中的造血培养基上，使其自然漂浮，形成液-气界面，将培养皿静置备用。</li>
	<li>按照步骤 3.8–3.10 所述方法解离第 25 天转导的 MEFs（来自步骤 3.11），并将 33,000 个转导 MEFs 与步骤 4.6 获得的 167,000 个胎盘细胞聚集体（1:6 比例）混合。</li>
	<li>为形成聚集体18,21，首先将步骤 4.9 中的 MEF 与胎盘细胞混合物在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，用 P200 移液器将细胞沉淀重悬于 30–50 µl 标准 DMEM 中，并将单细胞悬液吸入 200 µl 无斜面移液枪头内。</li>
	<li>用石蜡膜封住移液枪头口部，将封口的枪头放入 15 ml 离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞在枪头封闭端形成沉淀。</li>
	<li>小心将枪头从 15 ml 离心管中取出，装回 P200 移液器，撕去石蜡膜，将细胞沉淀挤出并置于步骤 4.8 中已漂浮的滤膜上。 
	注意：每张滤膜最多放置 3 个聚集体。</li>
	<li>将聚集体在 37 °C、5% CO2 条件下，于漂浮的 0.65 µm 滤膜上培养 4–5 天。</li>
	<li>用细胞刮刀收集滤膜上的聚集体（每张滤膜最多 3 个），合并后使用 0.2% 胶原酶消化，操作流程与完整胎盘解离步骤（步骤 4.2–4.5）相同，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>解离完成后，用含 5% FBS 的 PBS 溶液 2–5 ml 洗涤聚集体，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将聚集体重悬于 500 µl 不含 FBS、P/S 及 L-谷氨酰胺的 DMEM 中。取此 500 µl 重悬液加入 3 ml 含 10 ng/ml TPO 的 1% 甲基纤维素培养基中，注意避免产生气泡。将该混合液等体积接种至 3 个 35 × 10 mm 未处理培养皿中，用于集落形成单位（CFU）检测12。</li>
	<li>作为对照，将经照射但未与重编程 MEFs 混合的胎盘聚集体培养 4–5 天，随后按上述步骤 4.7–4.16 进行 CFU 检测。 
	注意：此类聚集体单独培养时不会形成集落。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 10–14 天后，在显微镜下人工计数造血集落。</li>
	<li>对挑取的集落进行细胞离心涂片22，以观察单个细胞的形态学表型。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs） 从头合成 从易于获取的体细胞中研究造血作用提供了一种独特的方法 体外，并有望将该技术应用于人类系统。这种转化将产生一种在体外研究人类血液系统疾病的新工具，同时为药物筛选平台和基因靶向治疗提供机会，从而利用新型疗法或造血干细胞移植治疗多种疾病。在该领域，近期研究已进一步拓展了生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的能力 从头合成，表明重编程过程多个特征的重要性，包括起始细胞群体和转录因子组合的选择，以及培养条件（共培养微环境）和添加物（细胞因子、小分子等）对重编程效率的显著影响24-26多项研究正在将重编程技术应用于人类体系，且不经过多能性中间阶段，27,28 这些过程中的一个不理想步骤。
以下是一项首次通过发育过程从体细胞生成造血干细胞样细胞（HSC-like cells）的方案，该过程避免了使用多能性因子及形成多能性中间态细胞。所生成的造血干细胞样细胞似乎经历了一个类似发育的进程，首先需要细胞经过一种类似于内皮-造血转化（EHT）的生血性内皮中间态...

造血作用是一个复杂的发育过程，其中造血干细胞（HSCs）从存在于多种胚胎造血位点（如主动脉-性腺-中肾区和胎盘）的生血性内皮中产生1,2无法培养造血干细胞 体外 阻碍了对该过程的深入分析以及这些研究的临床应用。为克服这一局限性，先前的研究已尝试衍生出HSCs 从头合成 通过多能干细胞（PSCs）的分化3，或通过重编程培养基诱导体细胞的可塑性及定向分化4,5然而，这些研究尚无法生成具有临床安全性的可植入细胞，也无法用于研究确定性发育造血过程。 &#34;在培养皿中。&#34;
山中伸弥及其同事开创的新型工作——通过体细胞成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）——为基于转录因子（TF）过表达的细胞命运重编程策略提供了框架6,7这项工作促使多个领域的研究人员通过转录因子重编程技术，将易于获取的体细胞转化为所需的目的细胞类型。本文所述重编程策略的目标是利用基于转录因子的重编程方法，诱导小鼠体细胞发生造血生成过程，并致力于将这些发现转化为人类体系，以重编程患者特异性成纤维细胞，从而研究人类造血过程。 体外 并为疾病建模、药物测试和干细胞移植生成患者特异性的血液制品。
在此小鼠系统中确保正确重编程的第一步是构建一种报告基因小鼠品系，用于检测CD34的表达情况，CD34是内皮祖细胞和造血干细胞（HSCs）中已知的标志物。为此，利用huCD34-tTA和TetO-H2BGFP两种转基因小鼠品系，生成双转基因小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），现记为34/H2BGFP，当CD34启动子被激活时，细胞会发出绿色荧光8。这使得研究人员能够筛选一系列在造血特化与发育不同阶段所必需的转录因子（TFs）。最初选用18种转录因子，这些因子通过文献挖掘以及对先前描述的34/H2BGFP小鼠中GFP标记滞留的造血干细胞进行表达谱分析而确定，并将其克隆至pMX逆转录病毒载体中。将所有因子转导至34/H2BGFP MEFs中，并在支持造血干细胞生长的AFT024基质细胞上进行培养。在检测到34/H2BGFP激活后，逐步从重编程组合中剔除转录因子，直至确定能够激活报告基因的最优转录因子组合。完成初步筛选后，将这些因子转移至可由多西环素（DOX）诱导的pFUW载体系统中，以实现对转录因子表达的可控调节。由于这两种DOX可调控系统互不兼容（即34/H2BGFP小鼠系统与pFUW诱导型载体系统），因此必须使用野生型C57BL/6小鼠来源的MEFs。此外，还需提供适当的微环境，以支持血液细胞生成过程的进行，并产生具有多谱系克隆形成能力的祖细胞。
目前，将体细胞重编程为造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的研究已取得不同程度的成功9-11迄今为止，尚未实现利用同一组转录因子生成兼具长期和自我更新重筑能力的小鼠和人类可移植造血干/祖细胞。在本方案中，我们详细描述了先前建立的在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中可重复诱导造血发生的策略。我们证明，引入一组最少数量的转录因子（Gata2、Gfi1b、cFos 和 Etv6）即可启动复杂的发育程序 体外 为发育性造血及造血重编程的临床应用提供进一步研究的平台12.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;M 滤器</td><td>康宁</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤器</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>双子座基准测试</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myelocult 培养基</td><td>干细胞技术</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R &amp;amp; D 系统</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R &amp;amp; D 系统</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R &amp;amp; D 系统</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R &amp;amp; D 系统</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R &amp;amp; D 系统</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene（六亚甲基溴化物）</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &amp;mu;M 膜过滤器</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素培养基</td><td>干细胞技术</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>干细胞技术</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>质粒 #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>OriGene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>OriGene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>OriGene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>质粒编号 #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>质粒编号 #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm 培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

本方案详细描述了通过过表达转录因子（TFs）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中诱导造血程序的方法。我们首先设计了利用人源CD34-tTA/TetO-H2BGFP（34/H2BGFP）双转基因小鼠来源的MEFs进行的报告基因筛选。CD34+ 这些小鼠的细胞用GFP标记H2B组蛋白，并在加入多西环素（DOX）后停止标记。MEFs被转导候选转录因子（TFs）后，观察GFP的出现情况+ 可指示造血或内皮细胞命运获得的细胞。从18个候选转录因子（TFs）出发，通过组合式筛选剔除，我们获得了一组最小因子组合，可诱导最高比例的GFP+ 细胞。我们发现Gata2、Gfi1b和cFos是必需的，而加入Etv6可实现最佳诱导效果。在重编程过程的不同时间点进行的一系列基因表达分析显示，这些细胞似乎经历了一个由内皮向造血转变（EHT）的前体细胞阶段。因此，该重编程过程实现了“在培养皿中”模拟发育性造血，从而为研究造血过程提供了可能 体外 以及一个用于鉴定该特化过程机制的平台。该方法还为将此项研究转化应用于人类系统提供了框架，旨在为多种血液系统疾病的治疗和研究提供一种替代来源的患者特异性造血干细胞（HSCs）。

造血作用是一个复杂的发育过程，起始于多个胚胎部位。这些部位中存在的生血内皮细胞通过细胞出芽的方式产生造血干细胞（HSCs）。23目前尚无法通过将造血干细胞（HSCs）或造血前体细胞置于培养环境中来复制这一过程，因此需要一种能够以某种方式获取这些细胞的方法。 体外，通过HSPC扩增 离体 或生成 从头合成本方案展示了我们的一项新技术，旨在通过在MEFs中过表达转录因子（TF）来获取这些细胞。
图1展示了整体重编程过程。在生成并扩增MEF细胞后，用Gata2、Gfi1b、cFos、Etv6和FUW-M2rtTA对细胞进行转导。转导后经过3天的扩增，并加入DOX以启动转基因表达；第4天将细胞解离后接种至明胶包被的培养板上，置于添加补充物的造血培养基中继续培养。
<p class="jove_content" fo:keep-together....

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。

本方案详细描述了通过过表达转录因子（TFs）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中诱导造血程序的方法。我们……

本血液诱导方案的总体目标是通过过表达转录因子，在小鼠成纤维细胞中启动一种发育过程，从而在体外生成造血前体细胞，这些前体细胞在长期培养后可产生造血细胞。该方法有助于回答造血编程领域中的关键问题，例如是否能够开发出一种方案，从头生成真正具有多谱系分化能力和移植能力的造血干细胞（HSCs）。该技术的主要优势在于，仅需过表达少量转录因子，即可在重编程细胞中启动发育过程，而无需经历多能性中间状态。在按照文本方案培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEFS）并制备病毒后，使用 PBS 中含 0.1% 明胶预包被 6 孔板。确保明胶覆盖孔板的整个区域。将孔板置于 37°C 培养箱中孵育至少 20 分钟。然后，移除培养板并吸除明胶。用标准DMEM培养基以每孔25,000个细胞的密度接种MEF细胞，并在37摄氏度下孵育过夜，使细胞贴壁。通过混合50微升M2RTTA、以及GATA2、GFI1B、CFOS和ETV6各12.5微升，配制100微升病毒混合液。吸弃MEFs中的培养基，加入2毫升含8微克/毫升六甲基溴化铵的标准DMEM。随后，每孔加入15微升病毒混合液，转导MEFs，并在37摄氏度孵育过夜。孵育16至20小时后，弃去每孔中的培养基，更换为2毫升新鲜的标准DMEM，其中添加1微克/毫升DOX。在37摄氏度下孵育三天。第四天，制备添加有氢化可的松、干细胞因子、MFS相关酪氨酸激酶3配体、白细胞介素3、白细胞介素6和DOX的造血培养基。接着，吸除MEF上的培养基，并用1 mL PBS洗涤细胞。然后，吸除 PBS 后，每孔加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶，以解离并收集细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后以 300 ×g 离心 5 分钟，并用 12 毫升刚配制的造血培养基重悬细胞。接着，将 10,000 个细胞每孔接种于明胶包被的六孔板中。每六天更换一次新鲜的添加补剂的造血培养基，持续整个培养过程。根据正文方案分析细胞。按照正文方案从怀孕小鼠中分离胎盘后，使用2至5毫升含20%胎牛血清（FBS）的0.2% I型胶原酶PBS溶液洗涤组织，并用装有18号针头的5毫升注射器在PBS溶液中机械解离组织。将胎盘细胞在 2 至 5 毫升胶原酶溶液中于 37 摄氏度孵育 1.5 小时。然后，使用装有 5 毫升注射器的 20 至 25 号针头反复吹打细胞数次，以进一步进行机械解离。接着，通过 70 微米细胞滤网过滤单细胞悬液。然后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以 2,000 厘戈瑞（centigray）剂量照射，以实现有丝分裂失活。向一个 10 厘米培养皿中加入 10 毫升造血培养基，培养基需添加以下成分。将 0.65 微米滤膜直接放置于培养皿中的培养基上，使其自然漂浮，形成液-气界面，随后将培养皿置于一旁。按照本视频前面展示的方法，将第25天转导的MEF细胞进行解离，并将33,000个转导的MEF细胞与167,000个有丝分裂失活的胎盘聚集体细胞混合。为形成聚集体，将MEF细胞与胎盘细胞混合物在300 × g离心5分钟。吸除培养基，使用30至50微升标准DMEM重悬细胞沉淀，将单细胞悬液吸入200微升无斜面的移液器吸头中。接下来，用石蜡膜封住移液枪头。然后，将封堵的枪头放入一个15毫升离心管中，在300 × g 条件下离心5分钟，使沉淀物聚集在枪头的封闭端。小心地将枪头从15毫升离心管中取出，并套在P200移液枪的末端。 弃去石蜡膜，将细胞沉淀挤出至培养皿中漂浮的滤膜上。将细胞团块置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，在漂浮滤膜上培养4至5天。使用细胞刮收集团块，合并后用0.5%胶原酶进行消化。消化后，使用 2 至 5 毫升含 5% FBS 的 PBS 清洗细胞团块，并在 300 × g 离心 5 分钟。将细胞团块重悬于 500 微升不含 FBS、青霉素-链霉素或 L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基中。将全部悬液加入 3 毫升含 1% 甲基纤维素的培养基中，其中添加 10 纳克/毫升 Tepo，操作时需小心避免产生气泡。将该混合物等体积接种至三个35 mm × 10 mm的未经处理的培养皿中，用于CFU检测。作为对照，培养经辐照的胎盘聚集体。最后，在37°C、5%二氧化碳条件下培养10至14天后，在显微镜下人工计数造血集落。在将MEFs重编程为HSCs的过程中，细胞被转导了如图所示的转录因子。在扩增并暴露于DOX以启动转基因表达三天后，细胞被解离、分种并培养在明胶包被的培养皿上，同时补充造血培养基。转导后第20天，在重编程培养基中培养的34/H2BGFP MEFs呈现出明显的形态学改变，包括与MEFs明显不同的内皮样形态。进一步培养至第35天，可观察到多个圆形的类似造血细胞从GFP阳性且表达造血标志物Sca1和CD45的类似内皮中间细胞中产生。继续培养后，细胞表达CD45，同时维持人CD34报告基因的表达。在胎盘样聚集后，培养细胞获得克隆形成潜能，可在含多种造血形态及类似原始细胞的甲基纤维素中形成集落。在进行该操作时，重要的是要牢记每个步骤都应缓慢进行，以免混淆。任何错误在开始重编程后的数周内都难以察觉。完成本操作后，可进一步采用其他方法，如集落形成细胞检测和长期培养起始细胞检测，以回答更多问题，例如通过功能检测验证所获得的细胞是否真正具备造血功能。该技术建立后，为造血干细胞编程领域的研究人员探索血液、内皮及其他细胞类型的其他重编程策略和优化方案奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何在小鼠成纤维细胞中诱导造血程序、转录因子的过表达方法，以及如何对所获得的细胞进行功能检测。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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