Name: 设计微流体装置用于研究细胞反应在单人或共存化工/电气/剪切应力刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解如何使用聚甲基丙烯酸甲酯设计和制造微流控芯片，以研究细胞对化学、剪切应力和电场刺激的体外反应。该方法为细胞生物学和生物医学工程研究提供了精确控制实验条件的平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作获得中国台湾科技事务主管部门合同编号MOST 104-2311-B-002-026（K. Y. Lo）、MOST 104-2112-M-030-002（Y. S. Sun）以及中国台湾大学职业发展项目（103R7888）（K. Y. Lo）的经费支持。作者同时感谢中国台湾大学新兴材料与先进器件中心提供细胞培养室的使用。

1. 芯片设计与制备
<ol>
	<li>使用商用软件在PMMA基底和双面胶带上绘制待烧蚀的图案24。
	<ol>
		<li>为研究化学浓度和剪切应力的影响，在五个培养区域中的每一个区域末端绘制一个宽度变化的“圣诞树”形图案（图1A 和 1B）。</li>
		<li>为研究化学浓度和电场的影响，绘制一个带有两条额外流体通道用于盐桥的“圣诞树”形图案（图2A 和 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将相应文件载入CO2激光刻划仪，在PMMA板材或双面胶带上刻划单个图案。
	<ol>
		<li>打开激光刻划仪，并检查其与计算机的连接。使用商用软件打开待烧蚀的图案。</li>
		<li>将PMMA板材或双面胶带放置在刻划仪的工作台上。如有必要，使用校准杆和可见的He-Ne激光调整CO2激光的焦距。</li>
		<li>将图案载入刻划仪，以在PMMA板材或胶带上进行烧蚀。</li>
		<li>取下已刻划的板材或胶带，去除不需要的部分，并用氮气吹扫清洁表面。 
		注意：PMMA板材的厚度为1 mm，双面胶带的厚度为0.07 mm或0.22 mm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 芯片组装
<ol>
	<li>使用万能胶将亚克力连接器（长 × 宽 × 高 = 10 mm × 10 mm × 5 mm，中间带有螺纹）粘接到芯片最顶层，使螺纹与最顶层的孔对齐。这些连接器用作流体入口/出口和盐桥连接口。</li>
	<li>在层流罩内组装微流控芯片。</li>
	<li>组装化学-剪切应力微流控芯片（CSS芯片）。
	<ol>
		<li>使用两片带刻痕的双面胶带将3片刻痕PMMA片粘合在一起。（图1A 和 1B）。</li>
		<li>在芯片底部再添加一片厚度为0.07 mm的双面胶带，并将芯片粘附到直径为10 cm的培养皿上。</li>
		<li>将组装好的芯片放入真空腔室中过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为组装化学-电场芯片（CEF芯片），将PMMA片粘接到厚度为0.22 mm的双面胶带上（图2A 和 2B）。
	<ol>
		<li>使用同一片胶带将刻痕PMMA片和双面胶带粘接到直径为10 cm的培养皿上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组装好的芯片留在层流罩内，并用紫外光照射30分钟以进行灭菌。</li>
	<li>通过塑料管和指旋螺母将入口连接至两个3 ml注射器，通过塑料管和指旋螺母将出口连接至废液管。 
	注意：使用前需将所有管路和螺母在121 °C下高压灭菌15分钟。</li>
	<li>缓慢按压注射器推杆，用PBS对流体通道进行引液。来回推动注射器以排除气泡。</li>
	<li>将芯片置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜。 
	注意：这两个步骤旨在清洗芯片并清除芯片内残留的任何气泡。</li>
	<li>从培养箱中取出芯片。</li>
	<li>为CEF芯片制备琼脂盐桥以产生电场。
	<ol>
		<li>使用微波炉将3%低熔点琼脂糖溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>将液态琼脂糖注入盐桥通道，并在溶液凝固前插入电极。</li>
		<li>将银/氯化银电极插入管状螺母中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将注射器连接至注射泵，并以20 μl/min的流速持续向流体通道中注入培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）10分钟，以替换PBS。</li>
</ol>
3. 细胞准备与实验设置
注意：使用前将1× PBS、培养基（DMEM加FBS）和胰蛋白酶在37 °C水浴中预热。
<ol>
	<li>在10 cm培养皿中接种2 × 105个肺癌CL1-5细胞25,26，培养皿中加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养至90%融合度。</li>
	<li>吸除培养基，用预热的1×PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入2 ml 0.05%胰蛋白酶缓冲液，在37 °C下孵育2至3分钟以使细胞脱落。</li>
	<li>将细胞转移至15 ml无菌离心管中，并向管中加入6 ml培养基。轻轻颠倒混匀，取出5 µl含细胞的培养基，用血细胞计数板计数细胞数量。</li>
	<li>以300 × g离心5分钟。将106个细胞重悬于1 ml培养基中，并将含细胞的培养基装入1 ml注射器中。</li>
	<li>从微流控芯片的出口端将含细胞的培养基注入芯片，确保溶液均匀分布于五个培养区域。将芯片置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育2小时。</li>
</ol>
4. 实验设置
<ol>
	<li>从培养箱中取出芯片，放置在透明的氧化铟锡（ITO）玻璃加热器上方。 
	注意：ITO玻璃通过热电偶紧密夹在ITO加热器与芯片之间提供反馈，连接至比例-积分-微分（PID）控制器，以维持温度在37 ± 0.5 °C。</li>
	<li>将芯片-加热器组件置于倒置显微镜的电动XY载物台上，用于追踪细胞迁移；或置于倒置荧光显微镜的固定XY载物台上，用于检测活性氧（ROS）的生成。</li>
	<li>为生成不同的化学浓度，用两支注射器分别吸取5 ml浓度相对为0和1的化学溶液（溶于培养基中），并以所需流速泵入芯片：在CSS芯片中，以0.3 ml/min的流速持续1小时；在CEF芯片中，前20分钟以20 µl/min的流速泵入，随后120分钟以20 µl/hr的流速继续泵入（总时间为2小时）。</li>
	<li>在CEF芯片中，为追踪细胞迁移，设置显微镜的XY载物台程序，通过数码单反（DSLR）相机每15分钟对培养区域内的特定视野（FOVs）重复拍摄图像，持续2小时。</li>
	<li>为检测活性氧（ROS）的生成，使用基于荧光的探针2′-7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′-7′-DCFDA）。
	<ol>
		<li>用分子生物学级的二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM的2′-7′-DCFDA储备液。将DCFDA用不含血清的DMEM稀释至5 µM（即5 µM DCFDA溶于DMEM中）。潜在的脱乙酰酶可能增加背景信号并降低细胞内的信号强度。</li>
		<li>在CSS芯片中施加1小时剪切应力刺激后，或在CEF芯片中施加2小时电场刺激后，以20 µl/min的流速将2′-7′-DCFDA（5 µM溶于DMEM）泵入芯片，持续前20分钟，随后以20 µl/hr的流速继续泵入20分钟。清洗时，以20 µl/hr的流速将DMEM泵入芯片，持续20分钟。</li>
		<li>通过电荷耦合器件（CCD）相机拍摄培养区域内特定视野（FOVs）的图像，用于分析荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 化学浓度、剪切应力和电场的计算
<ol>
	<li>在 CSS 芯片和 CEF 芯片中，计算五个培养区域中的化学物质浓度。例如，从两个入口分别注入浓度为 0 和 200 µM 的 H2O2，可生成 0、25、100、175 和 200 µM 的浓度。 
	注意：假设所有液体在分叉处平滑且均匀地分流，则五个培养区域中的相对浓度分别为 0、1/8、1/2、7/8 和 1。</li>
	<li>在 CSS 芯片中，使用 <img alt="τ=12(Qη/h²w)，流体流动阻力公式，科学方程。" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"> 27 计算每个培养区域内的剪切应力（τ），其中 Q 为体积流速，η 为流体黏度，h 为通道高度，w 为通道宽度。 
	注意：当每个入口的 Q 设为 0.3 ml/min（每个培养区域的 Q 为 0.12 ml/min），培养基的 η = 0.0008 Pa·s，h = 1 mm，w = 1 ~ 4 mm 时，计算得到的剪切应力范围为 0.0048 Pa（4 mm 宽区域）至 0.0192 Pa（1 mm 宽区域）。</li>
	<li>在 CEF 芯片中，使用 E = I/(σAeff)（欧姆定律）计算每个培养区域内的电场强度，其中 I 为流经流体通道的电流，σ 为培养基的电导率，Aeff 为通道的有效横截面积。 
	注意：当培养基的 σ = 1.38 Ω-1m-1，Aeff = 0.22 mm2（宽度 = 1 mm，高度 = 0.22 mm）时，电场强度计算公式为 E (mV/mm) = I (A) × 3.3 × 106。
	<ol>
		<li>如图 2D所示，将等效电路视为由四个（8 + 35 + 8）段和一个（5 + 35 + 5）段组成的五个 C 型电路。 
		注意：根据基尔霍夫电压定律和欧姆定律分析该并联电路，可计算出流经五个培养区域的电流 I1 至 I5（从下至上）分别约为 0.49I （区域 1）、0.25I （区域 2）、0.13I （区域 3）、0.08I （区域 4）和 0.05I （区域 5），其中 I 为总直流电流。当施加 0.157 mA 的直流电流时，五个培养区域内产生的电场强度分别为 254、130、67、41 和 26 mV/mm。 
		注意：为简化对微流控网络的电学分析，所有流体段均被视为电阻，其阻值与长度成正比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据分析
注意：数据分析使用 ImageJ 软件进行。
<ol>
	<li>分析活性氧（ROS）的产生。
	<ol>
		<li>运行 ImageJ 软件，点击“文件” → “打开”，加载待分析的荧光图像。</li>
		<li>点击“图像” → “类型” → “16位”，将图像转换为灰度图像。</li>
		<li>绘制一个多边形以圈选一个细胞，点击“分析” → “测量”，获取该细胞的平均荧光强度。</li>
		<li>重复步骤 6.1.3，从三次独立实验中至少收集 50 个细胞的荧光强度，并计算平均强度及其标准误（SEM）。</li>
		<li>对每种实验条件重复步骤 6.1.1–6.1.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析细胞迁移。
	<ol>
		<li>运行 ImageJ 软件，点击“文件” → “打开”，加载时间 = 0 时拍摄的待分析图像。</li>
		<li>绘制一个多边形以圈选一个细胞，点击“分析” → “测量”，测量该细胞的质心位置，记为 (x1, y1)。</li>
		<li>重复步骤 6.2.1–6.2.2，从另一张在时间 = t 时拍摄的图像中测量同一细胞的质心位置，记为 (x2, y2)。</li>
		<li>计算该细胞的迁移速率（单位：µm/hr），公式为 <img alt="距离公式方程；数学概念；用于计算二维点间距离的公式。" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2">。</li>
		<li>重复步骤 6.2.1–6.2.4，从三次独立实验中至少收集 50 个细胞的迁移速率，并计算平均迁移速率及其标准误（SEM）。</li>
		<li>根据步骤 6.2.2 和 6.2.3，计算该细胞的迁移定向性，表示为 cos θ 或 <img alt="物理学中的距离公式，用于分析速度或速率计算，数学表达式。" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 3">，其中 θ 为所施加电场方向（从正极到负极）与细胞从起始位置到终止位置的位移矢量之间的夹角（图 2G）。</li>
		<li>重复步骤 6.2.6，从三次独立实验中至少收集 50 个细胞的迁移定向性，并计算平均迁移定向性及其标准误（SEM）。</li>
		<li>针对每种实验条件，分别计算平均迁移速率（含 SEM）和平均迁移定向性（含 SEM）。 
		注：定向性值为 +1 表示所有细胞均向阴极迁移，-1 表示所有细胞均向阳极迁移；随机移动的细胞群体其定向性接近于 0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析细胞排列方向。
	<ol>
		<li>运行 ImageJ 软件，点击“文件” → “打开”，加载待分析的图像。</li>
		<li>将细胞视为椭圆，绘制一条线以表示细胞的长轴，点击“分析” → “测量”，测量该线与水平电场方向之间的夹角 β。</li>
		<li>重复步骤 6.3.2，从三次独立实验中至少收集 50 个细胞的 β 值，并计算平均 cos β 及其标准误（SEM）。</li>
		<li>对每种实验条件重复步骤 6.3.1–6.3.3。 
		注：cos β 值为 +1 表示所有细胞均与所施加的电场方向平行排列，0 表示所有细胞均与电场方向垂直排列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2, (2008).</li>
<li>Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-Chromatographic+Air+Analyzer+Fabricated+on+a+Silicon-Wafer%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T+Electron+Dev%22%5BJournal%5D)">Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer.</a> Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoreceptors+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemoreceptors in bacteria.</a> Science. 166, 1588-1597 (1969).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Kao, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+chemotaxis+of+lung+cancer+cells+by+using+electric+fields+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device.</a> Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).</li>
<li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab Chip. 5, 611-618 (2005).</li>
<li>Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+electrical+stimulation+promotes+the+speed+and+accuracy+of+motor+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration.</a> J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+in+embryos+during+development%2C+regeneration+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosim%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing.</a> Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+Current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential.</a> Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+and+wound+healing%3A+experimental+methods+to+study+electric+fields+as+a+directional+signal+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration.</a> Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>Yan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+A549+Cells+Migrate+Directionally+in+DC+Electric+Fields+With+Polarized+and+Activated+EGFRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs.</a> Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+electrotaxis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+Guiding+Migration+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electrical-stimulated+wound-healing+chip+for+studying+electric+field-assisted+wound-healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process.</a> Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li>
<li>Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+studying+cell+migration+in+single+or+co-existing+chemical+gradients+and+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields.</a> Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).</li>
<li>Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+chemical+and+electrical+stimulation+on+lung+cancer+cells+using+a+multichannel-dual-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip.</a> Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).</li>
<li>Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+studying+the+production+of+reactive+oxygen+species+and+the+migration+in+lung+cancer+cells+under+single+or+coexisting+chemical%2Felectrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation.</a> Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).</li>
<li>Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stresses+and+antioxidant+concentrations+on+the+production+of+reactive+oxygen+species+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells.</a> Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+laser+micromachining+and+universal+surface+modification+of+PMMA+for+device+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development.</a> Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).</li>
<li>Chen, J. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene+expression+in+invasion+by+a+lung+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model.</a> Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).</li>
<li>Shih, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsin+response+mediator+protein-1+and+the+invasion+and+metastasis+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+I%22%5BJournal%5D)">Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells.</a> J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Fried, L. E., Arbiser, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honokiol%2C+a+Multifunctional+Antiangiogenic+and+Antitumor+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Sign%22%5BJournal%5D)">Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent.</a> Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).</li>
<li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+damage+to+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic damage to animal cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).</li>
<li>Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li>
<li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li>
<li>Chin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cells+under+different+pulsatile+shear+stresses+and+glucose+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations.</a> Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于PMMA的芯片采用激光烧蚀和刻写技术制备，相较于需要复杂软光刻工艺的PDMS芯片，成本更低且操作更简便。在微流控芯片设计完成后，其制备与组装可在短短5分钟内完成。实验过程中需特别注意一些关键步骤。首先是&#34;组装&#34;问题。接头应正确粘接至芯片最上层，若胶水用量过多，可能渗入流体通道；若用量过少，则可能导致液体从芯片中泄漏。此外，在组装PMMA基底与双面胶带时，必须施加适当压力，使整个芯片紧密贴合，以防止任何液体泄漏。其次是&#34;气泡&#34;问题。为去除气泡，需以20 µl/min的流速持续向流体通道中注入1× PBS溶液1至2分钟，随后将芯片置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜。若流体通道中仍残留气泡，将导致流动不均匀，从而引起化学浓度和电场分布（EF）的非均一性。第三是&#34;细胞加载&#34;问题。接种至培养区域的细胞数量应严格控制。若细胞数量过少，则需进行多次实验以获取足够的统计数据；若细胞数量过多，则难以区分单个细胞并准确量化其迁移行为。
在CSS芯片中，一种&#34;圣诞树&#34;结构与三角形培养区域相结合，在五个区域中...

体内细胞被多种生物分子所包围，包括细胞外基质（ECM）、碳水化合物、脂类以及其他细胞。它们通过响应微环境刺激（如与细胞外基质的相互作用以及对各种生长因子化学梯度的响应）来实现功能化。传统上，体外细胞研究是在细胞培养皿中进行的，这种方式需要消耗大量的细胞和试剂，且细胞生长在静态（非循环）环境中。近年来，集成了流体组件的微加工装置为细胞研究提供了一种更为可控的替代平台。这类装置能够在精确控制化学和物理刺激的微环境的同时，最大限度地减少细胞和试剂的消耗。这些微流控芯片可由玻璃基板、硅晶圆、聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基板或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基板制成1-3。基于PDMS的装置具有透明、生物相容性好以及气体通透性强等优点，适用于长期的细胞培养与研究。PMMA和PET基板成本低廉，且易于通过激光烧蚀和激光加工进行处理。
微流控装置应为细胞提供一个稳定且可控的微环境，使细胞能够受到不同的化学和物理刺激。例如，微流控芯片可用于研究细胞的趋化性。与传统的采用Boyden小室和毛细管的方法4,5相比，这些微型化的流体装置能够产生精确的化学梯度，用于研究细胞行为1,6,7。另一个例子是研究细胞在电场（EFs）作用下的定向迁移，这一现象称为电趋性（electrotaxis）。已有报道表明，细胞的电趋性行为与神经再生8、胚胎发育9以及伤口愈合10,11相关。许多研究已开展以探究多种细胞类型的电趋性，包括癌细胞12,13、淋巴细胞14,15、白血病细胞11和干细胞16。传统上，使用培养皿和盖玻片构建用于产生电场的电趋性实验装置17。这类简单装置存在培养基蒸发和电场不精确等问题，而封闭式、具有明确定义流道的微流控装置可克服这些局限12,18,19。
为了系统研究细胞在精确且可控的化学和电刺激下的响应，开发能够同时向细胞提供多种刺激的微流控装置将具有重要意义。例如，Li et al. 报道了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置，可用于建立单一或共存的化学梯度和电场20。Kao et al. 开发了类似的微流控芯片，用于研究电场对肺癌细胞趋化性的影响6。此外，为了提高通量，Hou et al. 设计并制造了一种基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的多通道双电场芯片，可为细胞提供8种不同的复合刺激，即（2种电场强度 × 4种化学浓度）21。为进一步提高通量并引入剪切应力刺激，我们开发了两种基于PMMA的微流控装置，用于研究细胞在单一或共存的化学、电和剪切应力刺激下的响应。
由 Lo 报道 等. 22,23，这些装置包含五个独立的细胞培养通道，可进行持续的流体流动，模拟 体内 循环系统。在第一种芯片（化学-剪切应力芯片或CSS芯片）中，培养区域生成了0、1/8、1/2、7/8和1五个相对浓度，并在每个培养区域内部产生剪切应力梯度。在第二种芯片（化学-电场芯片或CEF芯片）中，通过使用一组电极和两个注射泵，在这些培养区域中同时产生五种不同的化学浓度和五种不同强度的电场（EF）。通过数值计算与模拟优化芯片的设计与操作，培养于芯片内的肺癌细胞接受单一或共存刺激，以观察其在活性氧（ROS）生成、迁移速率和迁移方向等方面的响应。这些芯片被证实为研究细胞对多种微环境刺激响应的高效、高通量且可靠的工具。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>将细胞从培养皿上解离</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养培养皿</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Bright-Line&amp;nbsp;血细胞计数板</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>细胞计数设备</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>定制</td><td>定制</td><td>微流控芯片</td></tr><tr><td>适配器</td><td>定制</td><td>定制</td><td>微流控芯片</td></tr><tr><td>0.07/0.22 mm 双面胶带&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>微流控芯片</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>盐桥</td></tr><tr><td>2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>细胞内活性氧检测</td></tr><tr><td>氧化铟锡（ITO）玻璃</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>加热器</td></tr><tr><td>比例-积分-微分控制器&amp;nbsp;</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>温度控制器</td></tr><tr><td>热电偶</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>温度控制器</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 激光划片机</td><td>Laser Tools &amp; Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>微流控芯片制备</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>向芯片中泵入培养基和化学试剂</td></tr><tr><td>电源</td><td>Major Science&amp;nbsp;</td><td>MP-300V</td><td>提供直流电流</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>监测细胞迁移</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>监测细胞迁移和荧光信号</td></tr><tr><td>数码单反相机</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>记录明场图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>记录荧光图像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>快干胶</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>将适配器粘接到 PMMA 基底上</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>微流控芯片设计</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>溶解 DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>定量分析荧光强度和细胞迁移</td></tr></tbody></table>

设计用于研究细胞在单一或共存化学/电/剪切应力刺激下响应的微流控装置

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

微流控装置能够创建精确且可控的细胞微环境，包括 pH、温度、盐浓度以及其他物理或化学刺激因素。这些装置已被广泛用于 体外 通过提供细胞研究 体内 类似周围环境。特别是，细胞对化学梯度、电场和剪切应力的响应引起了广泛关注，因为这些现象对于理解细胞的特性和功能具有重要意义。这些微流控芯片可由玻璃基板、硅晶圆、聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基板或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基板制成。在这些材料中，PMMA基板成本低廉，并可通过激光烧蚀和激光直写技术方便地加工。尽管已有少数微流控装置被设计和制造用于产生多种共存的化学和电刺激，但这些装置在减少实验重复次数方面，特别是在筛选应用中，尚未达到足够高的效率。本报告中，我们描述了两种基于PMMA的微流控芯片的设计与制备，用于研究细胞在单一或共存的化学/电/剪切应力刺激下活性氧的产生及细胞迁移行为。第一种芯片在培养区域中生成0、1/8、1/2、7/8和1五个相对浓度，并在每个区域内同时产生剪切应力梯度；第二种芯片生成相同的相对浓度，但在每个培养区域内施加五种不同的电场强度。这些装置不仅为细胞提供了精确且可控的微环境，还显著提高了实验通量。

化学-剪切应力（CSS）芯片
CSS 芯片由三层厚度均为 1 mm 的 PMMA 板材组成，通过两层厚度各为 0.07 mm 的双面胶带粘合在一起（图 1A 和 1B）。该芯片的“圣诞树”结构可在五个培养区域中产生 0、1/8、1/2、7/8 和 1 五种相对浓度。通过将培养区域设计为三角形结构，可在每个区域内形成剪切应力梯度，其大小与体积流速、流体黏度以及流道尺寸相关。随后，该芯片通过另一层厚度为 0.07 mm 的双面胶带固定于培养皿上，用于培养肺癌 CL1-5 细胞，并观察不同化学浓度和剪切应力条件下活性氧（ROS）的生成情况。肺癌细胞中 ROS 的生成与肺癌的转移和发展密切相关，已有研究证实某些化学物质和剪切应力参与了 ROS 的产生过程23。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

集成流体组件的微加工器件为 体外 模拟细胞研究的平台 体内 微环境。我们开发了基于聚甲基丙烯酸甲酯的微流控芯片，用于研究细胞在单一或共存的化学、电场和剪切应力刺激下的响应。

微流控装置能够创建出对pH值、温度、盐浓度及其他因素精确且可控的细胞微环境。

本实验的总体目标是设计并制备用于观察细胞对环境刺激响应的微流控装置。该方法有助于回答细胞生物学与生物医学工程领域中的关键问题，例如细胞在不同环境刺激（包括化学物质、剪切应力和电场）下的反应机制。该技术的主要优势在于微流控装置易于加工与组装，且这些微流控装置能够以优异的能力模拟体内环境。本实验的演示者为本实验室的本科生周子元（Tzu-Yuan Chou）以及朱利安·钟（Julian Chung）博士实验室的博士后研究人员侯心山（Hsien-San Hou）。

首先，打开二氧化碳激光刻蚀机，并检查其与计算机的连接状态。随后，载入预先设计的圣诞树图案（如图中所示的图案之一）至刻蚀机中。接着，将一块聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材或双面胶带放置于刻蚀机工作台上。使用校准杆和可见的氦氖激光调节二氧化碳激光的焦距。然后将图案刻蚀至基底材料上。刻蚀完成后，取下图案基底，移除不需要的部分，并用氮气流吹扫表面以清除残留碎屑。对芯片的每个组件重复此过程。

组装化学-剪切应力微流控芯片。具体操作为：使用两片刻蚀好的双面胶带将三层化学-剪切应力图案化的PMMA板材粘合在一起。使用强力胶将带有螺纹的丙烯酸接头固定在芯片最上层的PMMA层上，对齐螺纹与孔位。这些接头将作为培养基的进样口、出样口以及盐桥连接器。随后，在芯片底部添加一片厚度为0.7 mm的双面胶带，并将芯片粘附至直径为10 cm的培养皿上。组装完成后，将芯片置于真空腔中过夜。

接下来组装化学-电场微流控芯片。将用于化学-电场芯片的刻蚀PMMA片通过双面胶带粘附至一个直径为10 cm的培养皿上。在使用芯片前，需将其暴露于紫外线下30分钟以进行灭菌处理。随后，通过塑料管和指旋螺母将芯片的进样口连接至装有3 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器。以相同方式将出样口连接至废液管。缓慢推动注射器活塞，以PBS预润湿流体通道。前后推动注射器以排除气泡，随后将芯片置于培养箱中过夜。

为设置化学-电场芯片，需在管状螺母中填充3%琼脂糖以构建盐桥。然后将银/氯化银电极插入管状螺母中。在D-MEM培养基（补充10%胎牛血清，FBS）中培养肺腺癌CL1-5细胞，直至细胞融合度达到90%。随后吸除培养基，用预热的PBS洗涤细胞一次，并向直径为10 cm的培养皿中加入2 ml浓度为0.5%的胰蛋白酶缓冲液。将细胞重新置于37℃培养箱中继续培养。

designing-microfluidic-devices-for-studying-cellular-responses-under

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

设计微流体装置用于研究细胞反应在单人或共存化工/电气/剪切应力刺激

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。...

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

为了理解机械应力如何激活生化通路并引发生物学反应，机械生物学研究需要新的工具。本文展示了一种新方法，利用微流控捕获装置对固定化的动物进行选择性机械刺激，从而实现对细胞反应的高分辨率成像。...

使用微流控装置进行机械刺激与高分辨率成像 秀丽隐杆线虫

本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流控装置的制备与表征的详细方法。...

一种用于对软骨细胞施加动态压缩刺激的微流控平台

本实验方案的目的是描述一种改良的平行板流动室，用于研究剪切应力对机械敏感性离子通道的实时激活作用。...

在明确定义的剪切应力下进行单细胞离子电流的电生理记录

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

本文介绍一种用于构建独特双层微流控装置的实验方案，以研究上皮组织稳态的电机械调控机制。该装置可施加垂直于组织平面的静态生理性电流，影响细胞间黏附、增殖及细胞挤出过程。通过活细胞成像和机械应力测量，揭示这些生物学过程的作用机制。...

利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

在此，我们介绍一种用于构建和运行微流控系统的方案，该系统可使内皮细胞同时暴露于振荡性高血糖和脉动性剪切应力。该方法具有生理相关性...

一种用于模拟生理脉动剪切应力与振荡性高血糖共同作用下内皮功能障碍的微流控系统

了解如何使用聚甲基丙烯酸甲酯设计和制造微流控芯片，以研究细胞对化学、剪切应力和电场刺激的体外反应。该方法为细胞生物学和生物医学工程研究提供了精确控制实验条件的平台。

设计用于研究细胞在单一或共存化学/电/剪切应力刺激下响应的微流控装置

探索更多视频