Name: 一个两亲性共聚物的阴离子聚合通过π-π堆积作用稳定嵌段共聚物胶束的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习通过阴离子开环聚合合成两亲性嵌段共聚物，制备载有阿霉素的胶束用于疏水性药物递送。该方法可实现四天内持续释药，产率高且分散度低，适用于聚合物药物递送系统的临床前研究。

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CA 承认获得了加拿大自然科学与工程研究理事会的发现基金资助。CA 承认获得了葛兰素史克（GSK）药物制剂与药物递送领域的讲席职位。作者声明不存在竞争性财务利益。

<img alt="阴离子聚合过程示意图，显示试剂添加、聚合和纯化步骤。" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. mPEG-b-PPheGE 嵌段共聚物制备过程的九个关键步骤示意图。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
1. 在干燥条件下配制试剂
<ol>
	<li>试剂的制备。
	<ol>
		<li>称取15 g mPEG-5K（Mn=5,400 g/mol，PDI 1.03），在使用前于50 °C真空烘箱中干燥48小时。</li>
		<li>将200 ml二甲基亚砜（DMSO）用氢化钙（CaH2）（约1 g）干燥，真空处理30分钟，用氩气置换，然后在使用前搅拌48小时。</li>
		<li>将50 ml PheGE单体置于干燥洁净的100 ml烧瓶中，加入1 g CaH2，在冰上抽真空密封15分钟，用氩气置换后，在使用前于氩气氛围下搅拌24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 萘钾的制备
<ol>
	<li>小心地将用己烷干燥过的金属钠切成小块（约 1.5 g），以去除多余的矿物油，然后加入含有四氢呋喃（THF）（v = 500 ml）的圆底烧瓶中。 
	注意：由于存在起火风险，钠块不得长时间暴露在空气中。</li>
	<li>加入二苯甲酮（约 5 g），用氩气吹扫后，用玻璃塞密封双颈圆底烧瓶。</li>
	<li>在氩气氛围下搅拌 24 小时后，将圆底烧瓶连接至蒸馏装置（图 2），在氩气保护下对深色溶液进行蒸馏，同时回流（即溶液变蓝后继续回流约 2 小时）。通过关闭蒸馏装置中部的左侧阀门，开始收集约 150 ml 的所需体积 THF。 
	注意：如果溶液未变蓝，则停止蒸馏，冷却至室温（RT），加入更多二苯甲酮或钠，然后重新开始蒸馏。这表明 THF 中仍含有水分。</li>
	<li>在干燥的锥形瓶中加入蒸馏过的 THF（v = 100 ml），并溶解 3.9 g 萘。 
	注意：停止蒸馏，冷却至室温（RT），打开右侧阀门以转移 THF 体积。</li>
	<li>如步骤 2.1 所述，将金属钾切成小块（1.1 g），加入含萘的溶液中（最终浓度约 0.3 mol/L）。用带顶部隔垫的冲洗接头（T）（开关型）密封锥形瓶，并用氩气吹扫。</li>
	<li>在氩气氛围下搅拌 24 小时后，观察所得的萘钾碱溶液，应呈现均一的深绿色。</li>
	<li>在惰性条件下，用注射器从烧瓶中取出 5 ml 该碱性溶液，加入 10 ml 蒸馏水中。随后向该溶液中加入 1–2 滴酚酞指示剂，溶液变为品红色。</li>
	<li>使用滴定管，以标准盐酸溶液（0.1 N）滴定萘钾溶液，直至溶液变为无色。</li>
</ol>
3. 高效活性阴离子聚合所需的材料及必要注意事项
<ol>
	<li>氩气/真空系统装置 
	注意：如文中所述 图2使用带有空心玻璃旋塞的双层玻璃歧管，在玻璃器皿中切换氩气输送和真空条件。
	<ol>
		<li>将装有氩气（带压力计）的气瓶通过惰性橡胶管连接至干燥除湿柱和多通道管路。在氩气管路的另一端连接一个装有矿物油的鼓泡器。</li>
		<li>将柔性惰性管和针头连接到玻璃活塞上。在多通管的另一端连接一个玻璃捕集器，并将其浸入装有冰/水或液氮的低温杜瓦瓶中，再连接至高真空泵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单体和DMSO蒸馏装置。 
	注意：一种便捷的（即， 用于高真空蒸馏的多功能装置被采用（图2）。干燥玻璃器皿配有高真空阀门和内置冷凝器，其内部为制冷头。
	<ol>
		<li>将冷却装置（字母）的进水口（A）和出水口（B）连接水源。将另一进/出接口（C）连接至氩气/真空双通管路。在加料/取样口处安装并密封隔垫（金属丝固定），并在顶部/回路位置连接不锈钢针头，用于转移对空气敏感的液体（D）。</li>
		<li>聚合前，在半球形加热套上对PheGE和DMSO进行蒸馏 100 °C 和 70 °C分别在真空条件下搅拌加热2小时。PheGE单体的沸点为 254 °C 而DMSO的沸点为 189 °C 在（1 atm）下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于阴离子聚合的玻璃器皿
	<ol>
		<li>除了蒸馏系统外，仅使用耐高真空的玻璃器皿，包括圆底烧瓶（需有制造商认证）、量筒（用于转移溶剂、碱和单体的体积）、套管、隔垫以及用于密封隔垫的金属丝。 
		注意：进行活性聚合反应时，使用前需在真空条件下小心加热，并在氩气氛围中冷却所有玻璃器皿。使用热风枪时，应保持其与玻璃器皿的距离约为10 cm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="高真空蒸馏装置示意图，包含高真空阀门、转移技术及鼓泡器设置。" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 装置组装及关键蒸馏/转移步骤。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 活性阴离子聚合关键步骤说明：蒸馏与转移
<ol>
	<li>在干燥的圆底烧瓶/Schlenk 瓶（经烘箱干燥）中加入磁力搅拌子，称取 mPEG-5K（2 mmol，10 g），并在瓶口用橡胶隔垫密封三通接头（T）（开关）。</li>
	<li>将烧瓶连接至真空/惰性气体共用管线，用氩气吹扫 2–3 分钟以置换瓶内空气。将阀门转至抽真空位置，进一步抽除残留气体。</li>
	<li>手动旋转烧瓶，并用热风枪均匀加热反应容器，直至 mPEG-5K 熔化。 
	注意：热风枪应保持距离烧瓶约 10 cm。</li>
	<li>1 分钟后，通过快速切换共用管线上的阀门至氩气通入位置，打破真空状态。 
	注意：需观察鼓泡器中保持连续的氩气流。当气流稳定连续后，将阀门保持在通氩位置。重复加热与冷却步骤两次，以彻底去除微量水分。</li>
	<li>反应开始前，将聚合物大分子引发剂在真空下保持约 2 小时，随后置于氩气氛围中备用。</li>
	<li>在通风橱内安装两套高真空蒸馏装置（图 2）；一套用于 DMSO 的蒸馏，另一套用于单体（PheGE）的蒸馏。</li>
	<li>将分别装有 DMSO 和单体的烧瓶连接至两套蒸馏装置，并置于半球形加热套（或油浴）中。将冷却水连接至装置顶部（进/出）以及共用管线（氩气/真空）。</li>
	<li>确保每套装置固定牢固且密封良好。通过阀门开启真空系统。 
	注意：如步骤 3.3 所述，重复加热与冷却步骤两次，以彻底去除微量水分。</li>
	<li>通过温度控制器设定加热温度，并开始搅拌溶液。DMSO 循环/蒸馏 2 小时后，关闭蒸馏装置中部的高真空阀，收集约 20 ml 溶液（用于清洗装置内壁）。随后将该馏分释放至烧瓶中，并重复操作一次，以确保后续收集的目标馏分纯度。</li>
	<li>用热风枪加热装有 mPEG-5K 的烧瓶（保持真空状态），直至聚合物（mPEG-5K）熔化，再次用氩气吹扫。 
	注意：此操作有助于后续 DMSO 加入后的溶解过程。</li>
	<li>2 小时后，关闭高真空阀，收集溶剂体积（VDMSO = ~100 ml）。停止加热，并通过共用管线释放真空。如前所述，通过快速切换阀门向体系内通入氩气。</li>
	<li>在维持氩气正压条件下，将套管的一端（握住装置的旋塞）连接至量筒，或直接连接至装有 mPEG-5K 的烧瓶（若蒸馏装置自带刻度），另一端小心浸入 freshly 蒸馏的 DMSO 馏分中。</li>
	<li>利用氩气压力将 DMSO 通过套管压入反应烧瓶。在烧瓶（或量筒，若需测量）上连接额外的鼓泡器，并关闭与鼓泡器相连、位于共用管线对侧的玻璃旋塞。 
	注意：当套管一端在转移过程中被移除时，必须确保持续施加正压氩气。</li>
	<li>为避免因氩气压力造成意外，每隔约 0.5 分钟打开玻璃旋塞 1–2 秒以释放压力，随后重新关闭，以维持 DMSO 的持续转移，直至完成全部转移。转移结束后重新打开旋塞。 
	注意：接下来必须采用相同操作流程进行单体的蒸馏与收集。溶剂与单体不可同时收集。</li>
	<li>通过套管转移 5 ml 浓度为 0.3 M 的萘基钾溶液，将其转移至带有隔垫密封的量筒中（套管插入形成回路）。 
	注意：操作须如 NOTE 4.13 所述，首先在萘基钾溶液瓶与量筒之间、再在量筒与反应烧瓶之间维持正压氩气，以防止空气或水分污染。</li>
	<li>从共用管线上插入另一根针头至量筒（通氩气）。小心移除与蒸馏系统相连的套管，并迅速插入反应烧瓶中。 
	注意：此技术适用于碱液和单体的转移。</li>
	<li>逐滴加入碱液，直至溶液变为深色。随着颜色缓慢褪去，再次加入适量碱液使深色重现，重复此过程直至完成全部碱液的转移。</li>
	<li>转移所需体积的单体（VPheGE = 5 ml），以实现 PPheGE 的聚合度约为 n=18–20。</li>
	<li>在氩气氛围中，80 °C 下持续搅拌反应 48 小时，以确保聚合反应完全。</li>
	<li>通过滴加 1 N HCl 的甲醇溶液（用石蕊试纸检测至中性 pH）终止反应，并以颜色消失作为反应终止的标志。</li>
	<li>用正己烷（3×50 ml）从 DMSO 溶液中萃取萘。在相同装置中减压蒸馏去除约 70 ml DMSO。冷却浆状溶液后，加入 50 ml THF。</li>
	<li>在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟，去除浆液中的盐分。转移上清液，并逐滴加入 500 ml 冷的乙醚中。</li>
	<li>通过过滤或离心收集沉淀物（重复两次），并在 30 °C 下真空干燥 24–48 小时（产率 85%）。 
	注意：该共聚物现已可用于表征分析。</li>
</ol>
5. 共聚物的表征
<ol>
	<li>取5-10 mg共聚物（记录实际质量），置于铝制样品盘中，并用铝盖密封。将样品盘和参比盘（空盘）装入差示扫描量热仪中。</li>
	<li>设置一个方法程序（“加热/冷却/加热”循环）：1）以10 °C/min的速率从40 °C加热至100 °C，2）以10 °C/min的速率冷却至-70 °C，3）再以10 °C/min的速率加热至100 °C。重复步骤2）和3）两次。根据第三次循环（如适用）的热流曲线确定熔点（Tm）、结晶温度（Tc）和玻璃化转变温度（Tg），以及熔融焓（ΔHf）。</li>
	<li>将聚合物溶解于THF中（2 mg/ml），并通过0.2-µm PTFE滤膜过滤。取50 µl样品注入凝胶渗透色谱系统，利用样品的保留时间及以一系列聚苯乙烯标准品绘制的校准曲线测定聚合物的分子量。19</li>
	<li>将（共）聚合物（15 mg/ml）溶解于d6 DMSO中，用于1H NMR谱分析。19</li>
	<li>采用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）作为荧光探针，测定共聚物的临界胶束浓度（CMC）。9
	<ol>
		<li>在避光条件下，用THF配制DPH储备液（2.32 mg/L），并取100 µl该储备液加入一系列样品瓶中。</li>
		<li>配制共聚物的THF储备液，并向上述各瓶（每瓶已含等量DPH储备液）中加入等体积（2 ml）的储备液，使最终共聚物浓度范围为0.01至1,000 µg/ml。</li>
		<li>随后涡旋混合共聚物-DPH溶液，并逐滴加入含搅拌子的10 ml双蒸水中。然后在氮气氛围下避光剧烈搅拌48小时，使THF缓慢挥发。各溶液中DPH的最终浓度为0.232 mg/L。</li>
		<li>使用双扫描微孔板荧光分光光度计，在激发波长λex = 350 nm、发射波长430 nm处测定各样品的荧光发射强度，并绘制荧光强度对聚合物浓度对数的曲线。两条线性区段交点所对应的浓度即为该共聚物的CMC值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 将阿霉素载入 BCM 的操作步骤
<ol>
	<li>将 12 mg DOX 溶解于 1 ml 乙腈中，加入 10 µl 三乙胺，在避光条件下搅拌 2 小时。</li>
	<li>将共聚物（45 mg）溶解于 1 ml THF 中，同样搅拌相同时间。将共聚物溶液加入 DOX 溶液中，并用额外体积的 THF（0.5 ml）冲洗残留共聚物的样品瓶。</li>
	<li>在搅拌条件下，将共聚物-药物混合液（2.5 ml）逐滴加入含有 15 ml 0.9% 生理盐水（NaCl）的样品瓶（20 ml）中。</li>
	<li>将溶液转移至透析袋（截留分子量 3.5 kDa）中，并在 500 ml 0.9% 生理盐水中进行透析。 
	注意：6 小时后更换外部生理盐水，继续在室温避光条件下搅拌透析 24 小时。</li>
	<li>将透析液转移至 50 ml 离心管中，在 5,000 × g 条件下离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至超滤系统（容量 10 ml），该系统内含透析膜（截留分子量 10 kDa）。将搅拌适配器放入超滤系统中，盖紧盖子，并通入氮气流。</li>
	<li>将 BCM 溶液浓缩至 4 ml 体积，加入 6 ml 新鲜生理盐水，重复此操作两次。</li>
	<li>将 BCM 溶液再次浓缩至 4 ml，用 0.5 ml 生理盐水冲洗滤室并并入溶液中。储存于棕色样品瓶中，置于室温避光处，待后续使用。</li>
</ol>
7. 多柔比星在DOX-BCMs中载药效果的评价
<ol>
	<li>将 DOX-BCM 溶于二甲基甲酰胺中（400 µl 中含 100 µl），以破坏胶束结构，随后在测定前用盐酸水溶液（0.1 N）稀释（900 µl 0.1 N HCl 中含 100 µl）。</li>
	<li>使用台式微孔板分光光度系统在 490 nm 处测定载药量。采用以下公式计算载药量（DLC）和载药效率（DLE）： 
	DLC （wt%）=（载入药物质量 / BCMs 总质量）× 100% 
	DLE （%）=（载入药物质量 / 投料药物质量）× 100%</li>
</ol>
8. 评估 体外 DOX从DOX-BCMs的释放
<ol>
	<li>在37 °C条件下，研究DOX从BCMs在0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）中的释放情况，对比含0.1% (w/v) Tween 80的PBS（pH 7.4）、含BSA（50 mg/ml）的BCMs与PBS（pH 7.4）以及0.1 M乙酸盐缓冲液（pH = 5.5）中的释放情况。20,21</li>
	<li>将BCMs-DOX制剂（700 µl）稀释于选定缓冲液（2.3 ml）中，使透析袋内DOX总量约为0.6–0.7 mg。</li>
	<li>将溶液置于透析袋中，用夹子密封后浸入200 ml相应的外部介质中。</li>
	<li>在预定时间点，从透析袋外取样2 ml，并补充等体积的新鲜缓冲液。</li>
	<li>将取出的样品 aliquot 储存于-20 °C，待用紫外-可见分光光度法（Abs490 nm）分析。药物累计释放百分比（Er）可通过以下公式计算： 
	<img alt="药物释放效率计算公式，显示用于释放分析的Et(%)公式。" src="/files/ftp_upload/54422/54422eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1"> 
	注：其中mDOX表示BCMs中DOX的量，V0为释放介质的总体积（200 ml），Vt为每次更换介质的体积（Vt = 2 ml），Ci为校正前的浓度，Cn表示样品中DOX的浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于阴离子聚合能很好地控制分子量，因此它是工业上制备基于环氧烷单体（如 PEG 和 PPG）的聚合物最常用的方法之一。要成功实现聚合，必须采用最佳且严格的反应条件。所有试剂的严格纯化以及合适的实验装置对于保持聚合反应的“活性”特征至关重要。当前实验装置的主要局限性通常与依赖套管转移的技术有关。在适当的压强下，套管转移在学术研究环境中的实验室规模操作是安全的。采取这些预防措施可在聚合过程中实现更好的可重复性和控制性（低 PDI）。此外，这些转移和纯化步骤也可用于制备如 mPEG-b-PCL、mPEG-b-PLLA 和 mPEG-b-PAGE 等嵌段共聚物19,29。然而，这种便捷的方法可能不适用于某些需要更严格条件（例如，苯乙烯）的单体的聚合反应。在这些情况下，通常更倾向于采用安瓿断裂密封（break-seal）技术进行阴离子聚合30。在工业生产中，为控制这些步骤，通常使用类似系统（不锈钢/玻璃）通过密闭阀门相互连接。
对于环氧烷单体，其一般机理是氧负离子（自由离子或离...

在水相介质中，两亲性嵌段共聚物会自组装形成纳米级的嵌段共聚物胶束（BCMs），其结构由疏水性内核和亲水性外壳（或称冠层）组成。胶束的疏水内核可作为疏水性药物的储库，而亲水性冠层则在内核与外部介质之间提供界面。聚乙二醇（PEG）及其衍生物是聚合物中极为重要的一类，也是药物制剂中最广泛应用的材料之一1-3。嵌段共聚物胶束已被证实是一种具有潜力的药物递送平台，目前已有多种基于该技术的制剂进入临床后期开发阶段4。通常情况下，这类共聚物的疏水嵌段由聚己内酯、聚(D,L-丙交酯)、聚氧化丙烯或聚(β-苄基-L-天冬氨酸酯)构成5-9。
Kataoka 团队研究了由 PEO-b-PBLA 和聚乙二醇-b-(聚天冬氨酸-阿霉素偶联物) 形成的球形胶束用于阿霉素（DOX）的递送。10,11 在他们的报告中提出，聚合物偶联药物或 PBLA 与游离 DOX 之间的 π-π 相互作用有助于稳定胶束核心，从而提高药物的载药量和滞留性。已知药物与核心形成嵌段之间的相容性或相互作用是决定关键性能相关参数的重要因素。12 除 DOX 外，多种抗癌治疗药物在其核心结构中包含芳香环（例如，甲氨蝶呤、奥拉帕利、SN-38）。
因此，人们对合成在其成核嵌段中包含苄基环的共聚物具有浓厚兴趣。聚乙二醇（PEG）及其衍生物的阴离子开环聚合能够精确控制分子量，并以较高产率获得低多分散性的材料13,14。环氧乙烷可与苯基缩水甘油醚（PheGE）或苯乙烯氧化物（SO）进行（共）聚合，形成可自组装为胶束的嵌段共聚物，用于增溶疏水性药物15-18。本报告描述了以mPEG-OH为大分子引发剂，对苯基缩水甘油醚单体进行活性阴离子聚合所必需的实验步骤（图1）。随后，对所得嵌段共聚物及其聚集体在药物递送应用中相关的关键性质进行了表征。

<table><tbody><tr><td>DMEM/HAMF12</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12500</td><td>添加10% FBS。在37 &amp;deg;C水浴中预热。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>在37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>加拿大来源</td></tr><tr><td>MDA-MB-468细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>MTS四氮唑试剂</td><td>PROMEGA</td><td>G111B</td><td></td></tr><tr><td>吩嗪硫酸乙酯（PES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4544</td><td>&gt;95%</td></tr><tr><td>mPEG5K（Mn 5,400 g/mol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81323</td><td>PDI=1.02</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>&gt;99.5%</td></tr><tr><td>萘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147141</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>苯基缩水甘油醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A32608</td><td>&gt;85%</td></tr><tr><td>二苯甲酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>427551</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451096</td><td>&gt;98%</td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>8900 1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>5500 1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>氢化钙（CaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>ACP</td><td>C-0460</td><td>&gt;99.5%</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>1/10/4800</td><td>ACS</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>差示扫描量热法（DSC）</td><td>TA Instruments Inc</td><td>DSC Q100</td><td></td></tr><tr><td>凝胶渗透色谱法（GPC）</td><td>Waters</td><td>2695分离模块 / 2414检测器&amp;nbsp;</td><td>两根色谱柱：Agilent Plgel 5 &amp;micro;m Mixed-D</td></tr><tr><td>核磁共振波谱法（NMR）</td><td>Varian Mercury 400MHz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151858</td><td>99.96%</td></tr><tr><td>氘代DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156914</td><td>99.96%</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.</td><td></td><td>极限压力 1×10&lt;sup&gt;-4&lt;/sup&gt; torr</td></tr><tr><td>含指示剂的干燥剂，8目</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238988</td><td>在230&amp;nbsp;&amp;deg;C下再生2小时</td></tr></tbody></table>

通过π-π堆叠相互作用稳定的两亲性嵌段共聚物胶束制备：基于阴离子聚合合成两亲性共聚物

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

本研究通过在甲氧基聚乙二醇（mPEG-）上对苯基缩水甘油醚（PheGE）进行活性阴离子聚合，合成了包含具有苯基的成核嵌段的两亲性共聚物。b-PPheGE)。共聚物表征结果显示其具有较窄的分子量分布（PDI &#60; 1.03）并确认了mPEG的聚合度122-b（苯基甘氨酸乙酯）15采用已建立的荧光法测定共聚物的临界胶束浓度，并通过动态光散射和透射电子显微镜评估其聚集行为。对共聚物在药物递送应用中的潜力进行了初步评估，包括 体外 生物相容性、载药及疏水性抗癌药物阿霉素（DOX）的释放。制备了稳定的DOX胶束制剂，载药量高达14%（wt%），载药效率 &#62; 在生理相关条件下（酸性和中性pH，存在白蛋白），药物负载率达60%（w/w），并在4天内实现持续释放。较高的药物负载量和持续释放特性归因于阿霉素（DOX）与胶束核心形成嵌段之间的π-π相互作用稳定效应。

<img alt="通过π-π堆积形成胶束；化学合成示意图，25 nm的胶束，DLS图谱。" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 以mPEG大分子引发剂引发苯基缩水甘油醚的阴离子聚合，制备mPEG-b-(PheGE)15，用于制备载药多柔比星的嵌段共聚物胶束示意图。 该示意图展示了使用萘基钾作为自由基阴离子对mPEG的羟基进行去质子化，随后引发苯基缩水甘油醚（PheGE）单体聚合的过程。代表性透射电子显微镜（TEM）图像显示了用醋酸铀酰（1% w/v）染色的BCM胶束，以及通过动态光散射（DLS）测定的胶束粒径分布。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54422/5...

本文描述了甲氧基聚乙二醇（mPEG-b-PPheGE）上苯基缩水甘油醚（PheGE）活性阴离子聚合的关键步骤。所得嵌段共聚物胶束（BCMs）负载了14%（wt%）的阿霉素，并在生理相关条件下实现了长达4天的药物缓释。

本研究通过苯基的活性阴离子聚合反应，合成了包含具有苯基的成核嵌段的两亲性共聚物……

本研究的总体目标是展示通过阴离子开环聚合合成嵌段共聚物材料所需的关键步骤，并阐明疏水性药物的嵌段共聚物胶束制剂研究的必要流程。本方案详细演示了通过阴离子聚合合成嵌段共聚物时所需步骤与操作的正确实施。阴离子开环聚合的一大优势在于能够以较高的产率合成材料，并获得较低的分子量分布多分散性。此外还有工艺的可扩展性。对于聚合物药物递送领域而言，当前正处于一个令人振奋的发展时期，已有多种依赖制剂和嵌段共聚物胶束的药物正处于临床前后期或临床开发阶段。按照文本方案中的描述准备转移所需的试剂和材料。称取分子量为5,000的甲氧基聚乙二醇。将mPEG加入含有搅拌子的干燥烧瓶中，并在顶部用隔膜密封通气适配器。将烧瓶连接至多通阀，用氩气吹扫烧瓶两到三分钟。将阀门转至真空位置以抽真空处理烧瓶。手动旋转烧瓶，并使用吹风机或加热枪均匀干燥反应容器，直至mPEG熔化。一分钟后，通过快速几次将多歧管上的阀门转向氩气位置来打破真空，以冷却烧瓶。将聚合物大分子引发剂在真空下保持约两小时，然后置于氩气氛围中，再开始反应。接下来，在通风橱内安装两套此前已在烘箱中干燥过的高真空蒸馏装置。一种装置用于蒸馏DMSO，另一种装置用于蒸馏单体苯基甘油醚。将两个独立的烧瓶分别连接至这两套装置，并将其安装在半球形加热套中或置于油浴内。将冷水连接至每套装置的顶部以及多通管。确保每台仪器均固定牢固且密封良好。打开阀门启动真空。通过温度控制器设定加热温度，并开始搅拌溶液。在DMSO循环蒸馏两小时后，关闭高真空阀，收集约20毫升溶液。随后将馏分释放至烧瓶中，并重复操作一次，以确保后续收集的目标馏分的纯度。在真空条件下用加热枪加热含有mPEG的烧瓶，直至聚合物熔化，然后再次用氩气置换。两小时后，关闭高真空阀，并收集溶剂体积。停止加热，从多通管处解除真空。如前所述，向腔室内通入氩气。在氩气正压条件下，将套管的一端连接至量筒，或直接连接至同样处于氩气保护下的含有mPEG的烧瓶，并将另一端小心浸入新蒸馏的馏分中。在烧瓶上连接一个额外的鼓泡器，关闭氩气流，仅利用蒸馏装置中的氩气压力进行操作。为避免因氩气压力导致意外，打开玻璃活塞1至2秒以释放压力，然后重新关闭，继续DMSO的转移，直至完成全部转移过程。接下来，在氩气保护下，将干燥的量筒一侧通过隔膜连接至套管的一端，另一端连接至0.3摩尔萘基钾储备溶液。然后，在量筒上加装一个额外的鼓泡器，关闭通向量筒的氩气流，并在正压氩气条件下，通过套管转移五毫升0.3摩尔萘基钾储备溶液至该量筒中。将多通阀上的另一根针头插入量筒内，随后移除额外的鼓泡器。小心移除连接至储备溶液的导管，迅速将其插入反应烧瓶中，并连接一个额外的鼓泡器。接着，按照之前所述方法，逐滴加入碱液，直至溶液变为深色。待颜色缓慢消失后，再次加入一部分碱液，使深色重新出现，并重复此过程，直至完成全部转移。如前所述，将所需体积的单体转移至反应体系中，使聚酚甘醇醚的聚合度达到约18至20个单元。在氩气氛围下，80摄氏度持续搅拌反应48小时，以确保完全聚合。通过滴加1 N盐酸和甲醇淬灭反应，直至观察到颜色消失为止。用正己烷萃取DMSO溶液中的萘。在减压下蒸馏除去约70毫升DMSO。冷却浆状溶液，加入15毫升THF。通过在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟，从浆液中去除盐分。转移上清液，并逐滴加入 500 毫升冷的乙醚中。通过过滤或离心收集沉淀物。重复沉淀两次后，将沉淀物置于通风橱内室温下干燥过夜，随后在30摄氏度下真空干燥24至48小时，产率为85%。该共聚物现已可用于表征，具体步骤见文中的实验方案。将12毫克阿霉素溶解于1毫升乙腈中，加入10微升三乙胺，避光搅拌反应2小时。将45毫克共聚物溶解于1毫升四氢呋喃（THF）中，并搅拌相同时间。将共聚物溶液加入到阿霉素溶液中，并用额外体积的THF冲洗含有残留共聚物的小瓶。接着，将共聚物-药物混合物逐滴加入含有15毫升0.9%生理盐水的20毫升小瓶中，同时搅拌。将溶液转移至透析袋中，用500毫升0.9%生理盐水透析。将透析液转移至15毫升离心管中，在5,000 × g条件下离心15分钟。然后，将上清液转移至含有透析膜的超滤系统中。将搅拌适配器放入超滤系统中，盖上盖子，并通入氮气流。将嵌段共聚物胶束溶液浓缩至4毫升体积，加入6毫升新鲜生理盐水。然后再次将嵌段共聚物胶束溶液浓缩至4毫升，用0.5毫升生理盐水冲洗滤室，并将冲洗液加入溶液中。将所得溶液在室温避光条件下储存于棕色小瓶中，以备后续使用。采用深部质子化mPEG大分子引发剂的羟基，引发苯基甘油醚的开环阴离子聚合，从而制备两亲性二嵌段共聚物。以萘基钾作为自由基阴离子，随后引发苯基甘油醚单体的聚合反应。通过凝胶渗透色谱和质子核磁共振波谱分析对嵌段共聚物进行表征，结果表明苯基甘油醚的聚合度为15个单元，且分子量分布较窄。在水相介质中，两亲性嵌段共聚物自组装形成胶束，其结构为疏水性内核被亲水性外壳包围。透射电子显微镜观察证实了球形形貌，动态光散射结果显示其流体力学直径为25纳米。阿霉素成功地被包载于嵌段共聚物胶束中。与溶液中游离的质子化药物相比，通过荧光光谱观察到的阿霉素自猝灭现象证实了药物已成功载入聚合物胶束，载药量高达14%。阿霉素从嵌段共聚物胶束中的释放行为表明，该制剂在中性pH条件下具有良好的稳定性，并在生理相关条件下实现持续四天的药物缓释。一旦掌握，该技术可帮助药物科学领域的学员制备用于药物递送的二嵌段共聚物。本文所述方法可用于以聚乙二醇（PEG）为引发剂的多种共聚物的合成。本实验重点强调良好的实验室操作规范，以确保无水条件并获得高质量的材料。观看本视频后，我应该能够充分理解如何在无水条件下进行操作，并能够将这些步骤应用于聚乙二醇聚酯或聚乙二醇聚酯材料的合成。在开展任何所述研究时，必须牢记：实验是在受控条件下进行的，涉及潜在有害的有机溶剂及其他试剂。此外，所有药品均具有毒性，必须采取必要的防护措施进行操作。例如，佩戴手套、实验服、封闭式鞋履，以及在称量药物时佩戴口罩。

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