Name: 与听觉HEI-OC1细胞工作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习使用HEI-OC1小鼠听觉细胞系的标准化操作流程，研究药物对听觉细胞的毒性效应，并协助表征马达蛋白prestin的功能特性。该方法为听觉神经科学研究提供了可重复的基础。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01-DC010146 和 R01-DC010397。本研究内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 细胞培养
注意：所有细胞培养方案必须采用正确的细胞培养技术进行操作（可参考《细胞生物学：实验室手册》第一卷的前3章10）。HEI-OC1细胞在正常贴壁和生长过程中无需对细胞培养皿进行额外的包被或处理。非常重要：请勿使用玻璃器皿进行细胞培养，否则细胞的表型及其对药理学药物的生物学反应将发生变化（G Kalinec &amp;#38; F Kalinec，未发表数据）；建议使用常规的塑料细胞培养皿（见材料/设备表）。需特别注意无菌操作技术以避免污染，但切勿在HEI-OC1细胞培养中使用抗生素（例如，氨苄青霉素或链霉素）。如有必要，可使用两性霉素B。尽管在以往研究中HeLa细胞和HEK-293细胞曾被用作HEI-OC1细胞的对照8，但其他任何细胞系也可适用于此目的。
<ol>
	<li>复苏冻存的HEI-OC1细胞 
	注意：本方案也可用于本实验室开发的同种转基因小鼠的其他细胞系，例如来自柯蒂氏器的 OC-k3 细胞系 11,12，以及来自血管纹的SV-k1 13,14.
	<ol>
		<li>从液氮中取出一管冻存的 HEI-OC1 细胞2，置于37 °C水浴中。仅将冻存管下半部分浸入水中，待管内冰块仅剩少量时停止解冻。用70%酒精擦拭冻存管外壁。</li>
		<li>从冻存管中用移液器吸取细胞，转移全部体积（约 1.5 × 10⁶ 个细胞）5 细胞/ml）缓慢地逐滴加入含有10 ml预热培养基（如添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM））的15 ml锥形管中。</li>
		<li>以300–500 × g离心5分钟，去除DMSO，弃去上清液，将细胞重悬于9 ml新鲜培养基（DMEM + 10% FBS）中。用移液枪头反复吹打悬浮细胞3至4次，使细胞团块或细胞片分散，吹打过程中枪头接触管底，使液体在移液枪与培养基之间来回流动。</li>
		<li>将悬浮于培养基中的全部细胞置于100 mm直径未经处理的塑料细胞培养皿中。</li>
		<li>在 33 °C、10% CO₂ 条件下培养细胞2 （允许条件）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HEI-OC1 细胞传代培养 
	注意：细胞在达到汇合（约80%）之前应进行悬浮培养并传代，以防止培养物死亡。本方案也可用于本实验室从同种转基因小鼠建立的其他细胞系，例如来自柯蒂氏器的OC-k3细胞系。 11,12，以及来自血管纹的SV-k1 13,14.
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，用 2 ml PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>用0.25%胰蛋白酶溶液覆盖细胞单层，每25 cm²使用1 ml2 表面积。进入下一步前，必须有超过40%的细胞脱落。使用倒置显微镜观察细胞，如有必要， &#34;拍打或轻敲&#34; 轻轻吹打培养皿以释放任何残留的贴壁细胞。 
		注意：胰蛋白酶消化时间过长可能导致细胞死亡；消化不足则会导致转移的细胞数量不足以满足计划中的研究需求。</li>
		<li>重悬细胞，按照1.1.3步骤中描述的方法进行操作，并将细胞转移至15 ml锥形离心管中。</li>
		<li>离心5分钟，300–500 × g，弃去培养基，用新鲜生长培养基重悬细胞，并接种至至少四个直径100 mm的细胞培养皿中。每皿细胞数量取决于回收的细胞总量。将细胞置于33 °C、10% CO₂条件下培养2 （P-HEI-OC1）并根据计划的实验需求或建立新代次的需要进行多次传代培养。</li>
		<li>进行储备培养时，将100 mm培养皿替换为250–550 ml细胞培养瓶；进行实验时，较小的培养皿或多孔板可能更为合适。</li>
		<li>为诱导分化，将HEI-OC1细胞在允许性条件下培养至约80%汇合度；随后将培养皿转移至39 °C、5% CO₂的环境中2 (NP-HEI-OC1) 培养2至3周。 
		注意：细胞将逐渐停止增殖并开始死亡。每隔一天更换培养基以清除死亡细胞。根据初始接种的细胞数量，通常约4周后将不再有可用于实验的细胞。一旦将细胞置于NP条件下，分化即开始，但并非所有细胞都以相同速度进行分化。重要的是，在分化过程中，prestin的表达及其在细胞膜上的定位会逐渐增加（参见 代表性结果, 图4），提供分化程度的定性与定量指示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 药物细胞毒性研究
注意：建议在允许性条件下培养的HEI-OC1细胞（P-HEI-OC1）用于这些研究（参见代表性结果，图1）。
<ol>
	<li>细胞活力（MTT 法）
	<ol>
		<li>按照 1.2 中所述步骤收集 P-HEI-OC1 细胞，并使用自动细胞计数器或血球计数板进行计数。将细胞浓度调整至 2.0 × 105 个细胞/ml。</li>
		<li>将细胞接种于 96 孔透明平底培养板（每孔 100 µl），在培养箱中孵育过夜以促进细胞贴壁，随后加入目标药物进行处理。注意设置空白孔和未处理细胞孔（对照）！</li>
		<li>药物处理后（通常在 33 °C 下处理 24 或 48 小时），按照试剂盒说明书进行 MTT 检测。一般而言，该检测的步骤如下：
		<ol>
			<li>向每孔加入 10 µl MTT 试剂。</li>
			<li>在 37 °C 下孵育 2 至 4 小时，直至可见紫色沉淀，然后向每孔加入 100 µl MTT 裂解试剂。切勿震荡培养板。</li>
			<li>用盖子盖好培养板，在 37 °C 黑暗环境中继续孵育 2 至 4 小时。</li>
			<li>使用酶标仪测量各孔在 570 nm 处的吸光度（包括仅含培养基的空白孔）。以对照组细胞的平均光密度值作为 100% 活力，对数据进行归一化处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>半胱天冬酶 3/7 活化检测 
	注意：建议在允许性条件下培养的 HEI-OC1 细胞（P-HEI-OC1）用于本实验。
	<ol>
		<li>按照 1.2 中所述步骤收集 HEI-OC1 细胞，并使用自动细胞计数器或血球计数板进行计数。将细胞浓度调整至 2.0 × 105 个细胞/ml。</li>
		<li>将细胞接种于白色壁 96 孔板（每孔 100 µl），在培养箱中孵育过夜以促进贴壁，随后加入目标药物进行处理。注意设置空白孔和未处理细胞孔（对照）！</li>
		<li>药物处理后（通常在 33 °C 下处理 24 或 48 小时），按照相应试剂盒说明书进行半胱天冬酶检测。一般而言，该检测的步骤如下：
		<ol>
			<li>配制试剂，充分混匀，并使其恢复至室温。</li>
			<li>将细胞从培养箱中取出，使培养板平衡至室温。</li>
			<li>向每孔加入指定体积的试剂，注意避免交叉污染，不同样本应使用不同的移液枪头。</li>
			<li>盖好培养板，使用板式振荡器在 300–500 rpm 下振荡混匀 30 秒。</li>
			<li>在室温下孵育至少 30 分钟。最佳孵育时间需通过实验确定。若室温波动较大，应使用恒温培养箱，因温度变化会影响发光信号读数。</li>
			<li>测量每孔的发光值，并以对照组细胞的平均发光值作为 100% 半胱天冬酶活化水平，对数据进行归一化处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分裂（增殖）
	<ol>
		<li>按照 1.2 中所述步骤收集 HEI-OC1 细胞，并使用自动细胞计数器或血球计数板进行计数。将细胞浓度调整至 2.0 × 105 个细胞/ml。</li>
		<li>将细胞接种于 96 孔透明平底培养板（每孔 100 µl），在允许性条件下孵育过夜以促进贴壁，随后加入目标药物进行处理。注意设置空白孔和未处理细胞孔（对照）！</li>
		<li>处理 1 小时后，向每孔加入 1 µl 预配的 100 倍稀释 BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）溶液，然后将培养板放回 33 °C 培养箱中继续培养。</li>
		<li>在处理后 12、24 和 48 小时，分别移除对应培养板中的原有培养基，并用 PBS 洗涤每孔一次。</li>
		<li>按照试剂盒说明书进行细胞增殖检测。一般而言，该检测的步骤如下：
		<ol>
			<li>根据试剂盒说明书配制试剂，包括固定/变性液、洗涤缓冲液、一抗检测液、二抗检测液和 BrdU 溶液。</li>
			<li>向每孔加入指定体积的固定/变性液，室温孵育 30 分钟。</li>
			<li>移除固定/变性液，加入指定浓度的一抗，室温孵育 1 小时。</li>
			<li>移除一抗溶液，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，然后加入指定浓度的二抗，室温孵育 30 分钟。</li>
			<li>移除二抗溶液，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，加入底物溶液。室温孵育 10 分钟后，加入终止液。注意：密切观察颜色变化；若溶液颜色过深，应在标准显色时间（10 分钟）前终止反应。</li>
			<li>在加入终止液后 30 分钟内，于 450 nm 处读取吸光度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞毒性 
	注意：建议在允许性条件下培养的 HEI-OC1 细胞（P-HEI-OC1）用于本实验。
	<ol>
		<li>在允许性条件下，将 HEI-OC1 细胞分别在仅含培养基（对照）或含目标药物的培养基中孵育 24–48 小时。</li>
		<li>处理结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后加入非酶解细胞解离液（每 25 cm2 表面积加 1 ml），作用 3 分钟以使细胞脱离。</li>
		<li>细胞脱离后，于 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀，弃去上清液，加入细胞毒性检测试剂，在避光条件下染色 15 分钟。</li>
		<li>按照流式细胞仪制造商的说明，通过流式细胞术测定活的 HEI-OC1 细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞衰老
	<ol>
		<li>在允许性条件下，将 HEI-OC1 细胞分别在仅含培养基（对照）或含目标药物的培养基中孵育 24–48 小时。</li>
		<li>使用 Debacq-Chainiaux et al. 15 所述的流式细胞术方法或其他已知可靠的方法，检测衰老相关 β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量。流式细胞术的简要步骤如下：
		<ol>
			<li>实验处理结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在允许性条件下，用含 100 nM 巴佛洛霉素 A1 的培养基孵育 1 小时。</li>
			<li>加入 C12FDG 至终浓度约 33 µM，继续孵育 1–2 小时。</li>
			<li>用 PBS 洗涤细胞 2 次，加入非酶解细胞解离液（每 25 cm2 表面积加 1 ml），作用 3 分钟收集细胞，然后于 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀。</li>
			<li>将细胞重悬于预冷的 PBS 中，按照流式细胞仪制造商的说明，通过流式细胞术测定阳性 HEI-OC1 细胞的数量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自噬
	<ol>
		<li>按照 1.2 中所述步骤收集对照组和饥饿处理组（无血清培养 48 小时）的 HEI-OC1 细胞，并按照标准流程进行 Western 印迹分析。一般而言，Western 印迹的步骤如下：
		<ol>
			<li>将 HEI-OC1 细胞以 1.0 × 105 个细胞/ml 的浓度接种于 6 孔板中。在培养 24 和/或 48 小时后，用预冷的 PBS 洗涤细胞。</li>
			<li>加入 200 µl TNESV 裂解缓冲液（含 1% NP40、50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM Na3VO4），并加入蛋白酶抑制剂混合物和 1 mM PMSF，在冰上裂解 5 分钟。</li>
			<li>用细胞刮刀刮下细胞，转移至微量离心管中，于 4 °C、16,800 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>收集上清液，使用 BCA 法测定蛋白浓度。</li>
			<li>向各样品中加入 5 倍上样缓冲液和 1 mM DTT，沸水浴 5 分钟以变性蛋白。</li>
			<li>使用 4–12% 的 SDS-PAGE 凝胶进行电泳，随后将蛋白转移至 PVDF 膜上。</li>
			<li>用含 0.1% Tween 20 的 TBS-T 缓冲液配制的 5% 脱脂奶粉在室温下封闭 60 分钟。</li>
			<li>将膜在 4 °C 与一抗孵育过夜。</li>
			<li>次日，用 TBS-T 充分洗涤膜，然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:1,500 稀释），室温孵育 1 小时。</li>
			<li>使用增强型化学发光（ECL）检测系统显影。以 GAPDH（在含 10% 脱脂奶粉的 TBS-T 中 1:2,000 稀释）作为内参，对蛋白表达水平进行归一化处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 Western 印迹中检测至少两种不同的自噬标志物的表达，如 Beclin-1 和 LC3B（通常在含 2.5% BSA 的 TBS-T 中 1:1,000 稀释）。同时注意检测 GAPDH 或肌动蛋白等蛋白表达内参。</li>
		<li>使用数字印迹扫描仪或公共域软件（如 NIH Image 或 ImageJ，http://rsb.info.nih.gov/nih-image/）进行密度分析，评估目标蛋白的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 HEI-OC1 细胞进行电生理学实验
<ol>
	<li>收集细胞 
	注意：使用在直径100 mm培养皿中生长且融合度为50%–80%的细胞。可选用胰蛋白酶、Accutase或无酶溶液， p磷酸盐- b缓冲 saline + e乙烯 diamine tetra a磷酸盐缓冲液-乙二胺四乙酸（PBS-EDTA）可用于细胞剥离，对吉欧封接（gigaseals）的数量和质量无明显影响。然而，在某些情况下，胰蛋白酶处理会使细胞更加脆弱。此时，应在开始实验前让细胞恢复约30分钟。
	<ol>
		<li>用不含 Ca 的 10 ml PBS 洗涤细胞两次2+ 和 Mg2+.</li>
		<li>加入2 ml无酶解离液，例如非酶细胞解离溶液，将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育3分钟。2.</li>
		<li>使用倒置显微镜检查细胞脱落情况。如有必要，可轻轻移动细胞培养皿以促进更多细胞脱落。 
		注意：不要晃动培养皿。</li>
		<li>加入10 ml DMEM+10% FBS，用10 ml移液器轻轻吹打细胞上下5次。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞。如果 &#62; 80%的细胞已分散为单细胞，无需进一步吹打。若细胞仍有聚集成团，需轻柔吹打至超过80%的细胞呈单细胞状态。</li>
		<li>将约10 ml悬浮细胞转移至15 ml锥形管中，以100 × g离心2分钟，弃去上清液。</li>
		<li>使用约 200 µl 外部记录液（用蒸馏水将 Leibovitz's L-15 培养基调节至 305–310 mOsm）重悬细胞。光学观察应显示大量单个、圆形细胞，细胞膜边缘光滑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜片钳与非线性电容测量
	<ol>
		<li>使用合适的放大器和软件，结合标准电生理技术进行膜片钳记录和电压依赖性非线性电容（NLC）测量。胞内（微电极内）溶液使用 150 mM KCl、1 mM MgCl₂2，0.1 mM EGTA、2 mM ATP-Mg、0.1 mM GTP-Na 和 10 mM HEPES；用 Tris 调节 pH 至 7.2。</li>
		<li>在显微镜下选择一个形态完整、细胞膜边缘圆润光滑的健康细胞。将玻璃移液管尖端贴附于细胞表面，检测膜电阻，其值应约为3–6兆欧姆，对应移液管尖端内径约为2 µm。</li>
		<li>轻轻将微量移液器尖端接触细胞质膜，然后施加负压。部分细胞膜将被吸入移液器内，形成约10至100吉欧姆（gigaseal）的电阻力。</li>
		<li>通过施加吸力脉冲破坏细胞膜以建立全细胞记录条件。</li>
		<li>使用不表达prestin的细胞（如HEK-293细胞）作为对照 9. 
		注意：当前响应应在5 kHz处进行滤波，并对残余串联电阻效应进行校正。所有数据采集和大部分分析均可使用通常随锁相放大器提供的软件完成。电容函数可拟合为描述非线性电荷与膜电压关系的双态Boltzmann函数的一阶导数 16. 
		 
		&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
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作者声明不存在现有或潜在的利益冲突。

在本报告中，我们描述了如何培养HEI-OC1细胞，并利用这些细胞评估药物诱导的细胞毒性的机制，以及研究耳蜗外毛细胞分子马达prestin的功能特性。然而，这些技术操作具有通用性，可轻松适用于不同的研究。
本文所述所有实验方案均需正确使用成熟的细胞培养技术10。与使用其他任何细胞系一样，操作HEI-OC1细胞需要配备完善的细胞培养设施，包括经过认证的生物安全柜、带制冷功能的离心机、水浴锅，以及一台用于观察细胞培养状况和进行细胞计数（若采用血细胞计数法）的倒置显微镜。然而，一个特殊的要求是需要配备两个加湿培养箱：一个设定为33 °C/10% CO2，用于培养P-HEI-OC1细胞；另一个设定为39 °C/5% CO2，用于培养NP-HEI-OC1细胞。如果计划开展的研究仅涉及P-HEI-OC1细胞，则第二个培养箱可设定为37 °C/5% CO2，以用于不同的实验分析。
使用塑料细胞培养皿是培养HEI-OC1细胞时的一项重要附加要求。事实上，HE...

House Ear Institute-耳蜗器1（HEI-OC1）细胞源自一种转基因小鼠的听觉器官1,2。在33 °C/10% CO2（允许条件）下培养该转基因小鼠的任何细胞，均可诱导一种永生化基因的表达，从而引发去分化和增殖加速；将细胞转移至39 °C/5% CO2（非允许条件）时，则导致增殖减少、发生分化，并且至少在HEI-OC1细胞中还会导致细胞死亡2,3。
HEI-OC1 细胞系由本实验室在十余年前建立并鉴定，初步研究表明，这些细胞表达耳蜗毛细胞的特异性标志物，如 prestin、myosin 7a、Atoh1、BDNF、calbindin 和 calmodulin，同时也表达支持细胞的标志物，如 connexin 26 和成纤维细胞生长因子受体（FGF-R）。 2因此，有研究提出HEI-OC1可能代表耳蜗柯蒂氏器中感觉细胞和支持细胞的共同前体细胞 2平行研究提供了有力证据，表明顺铂、庆大霉素和链霉素等典型耳毒性药物可诱导这些细胞中caspase-3的活化，而青霉素等被认为无耳毒性的药物则不会。 2,3因此，该细胞系被提议作为一种 体外 用于研究耳毒性相关的细胞和分子机制，并可用于筛选新药理学药物潜在的耳毒性或耳保护特性。据估计，在过去十年发表的研究中，已有超过一百五十项研究使用了HEI-OC1细胞。
尽管大多数涉及该细胞系的研究主要关注不同药物潜在的促凋亡作用，但其他重要的细胞过程，如自噬和细胞衰老，才刚刚开始在HEI-OC1细胞中得到研究4-7。在我们实验室最近的一项研究中8，我们利用HEI-OC1细胞系统收集了关于细胞死亡、存活、增殖、衰老以及由临床常用的不同药理学药物诱导的自噬的全面数据。我们还将HEI-OC1细胞对某些药物的反应与接受相同处理的HEK-293（人胚胎肾细胞）和HeLa（人上皮细胞）的反应进行了比较。结果表明，HEI-OC1细胞对每种药物均表现出特征性的反应，至少对其中一种研究机制具有独特的剂量和时间依赖性敏感性。我们在此前的研究中还强调，要正确解读实验结果，必须采用多种技术进行平行研究8。
在另一项研究中，我们探讨了使用HEI-OC1细胞评估耳蜗外毛细胞（OHCs）的运动蛋白prestin功能反应的可能性9。我们报道了在允许性条件（P-HEI-OC1）和非允许性条件（NP-HEI-OC1）下培养的HEI-OC1细胞中，通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜对prestin表达模式的研究，以及非线性电容（NLC）和全细胞膜片钳实验的结果。我们的结果表明，在NP-HEI-OC1细胞中，总prestin表达量和细胞膜定位均随时间呈依赖性增加。有趣的是，我们还发现NP-HEI-OC1细胞中prestin在细胞膜上的定位增加与Na+K+ATP酶的减少相关，后者从细胞膜易位至细胞质，而其总细胞表达量无显著变化。此外，我们证明P-HEI-OC1细胞具有显著的与prestin运动功能相关的非线性电容，当细胞膜上prestin分子密度增加时，该非线性电容反而下降。综上所述，这些结果有力支持了HEI-OC1细胞在听觉蛋白研究中的应用价值。
在本视频文章中，我们介绍了如何培养HEI-OC1细胞，为何在允许条件（P-HEI-OC1）下生长的细胞适用于细胞毒性研究，如何评估药物诱导细胞毒性的机制，以及如何进行电生理学研究（例如，膜片钳、非线性电容（NLC）），以探究耳蜗外毛细胞分子马达prestin的功能特性。

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 细胞</td><td></td><td></td><td>所有检测试剂盒、设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGARD III</td><td>以及文中提及的公司</td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>前两列仅为</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>示例，以及其他任何类似内容</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>斯托瓦尔</td><td>HWB115</td><td>产品可被使用。</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>两台（2）细胞培养箱，一台设置为33 &amp;deg;C/10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 以及其他在39 &amp;deg;C/5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，聚苯乙烯材质，100 mm × 20 mm，带通气孔</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，聚苯乙烯（PS），&amp;nbsp; 60 mm x 15 mm，带通气孔&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 细胞培养瓶&amp;nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 细胞培养器&amp;nbsp; 550 ml 锥形瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;6 孔细胞培养板（带盖）-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 细胞培养板，96 孔，平底，带盖</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>微孔板，Chimmey，96孔白色板，透明底</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯锥形管（带盖），Cellstars</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯锥形管带盖-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基，无酚红</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒&amp;nbsp; 试剂盒</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU细胞增殖检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>非酶细胞解离液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green 细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp; G8741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII 仪器&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>&amp;nbsp;FACSAriaIII</td><td>使用488 nm激发（蓝色激光）</td></tr><tr><td>数字印迹扫描仪</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>电泳与印迹单元</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 酶标仪配备 Soft Max Pro 5.2 软件</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>用于制备膜片电极的拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

使用听觉hei-oc1细胞进行实验

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 是目前可用于研究的少数小鼠听觉细胞系之一。最初被提出作为 体外 用于耳毒性药物筛选，这些细胞已被用于研究药物激活的凋亡通路、自噬、细胞衰老、细胞保护机制、炎症反应、细胞分化、药物的遗传与表观遗传效应、缺氧的影响、氧化应激与内质网应激，以及分子通道和受体的表达。在耳蜗毛细胞的多种重要标志物中，HEI-OC1细胞内源性表达prestin蛋白，即外毛细胞的典型马达蛋白。因此，该细胞系在揭示这一重要听觉蛋白的新功能特性方面具有重要价值。HEI-OC1细胞生命力强，常规培养通常无显著困难，但需满足特定条件：避免使用含链霉素或其他抗生素的常见抗菌混合液，培养增殖阶段需在33 °C孵育，而诱导分化则需在39 °C孵育。本文详细描述了HEI-OC1细胞的培养方法，及其在细胞增殖、活力、死亡、自噬与衰老等典型实验中的应用，同时介绍了膜片钳和非线性电容测量的操作流程。

在最近的几篇论文中，我们报道了一系列全面的研究，旨在评估HEI-OC1细胞对几种常用药理学药物的反应，并研究prestin蛋白的功能8,9。在这些研究中，我们采用了前述各节中描述的全部实验方案。
这些先前研究的结果之一是，在非许可条件下培养的 HEI-OC1 细胞（39 °C/10% CO2 = NP-HEI-OC1）与在许可条件下培养的细胞（33°C/10% CO2 = P-HEI-OC1）相比，细胞活力显著下降，同时细胞死亡显著增加（图 1）。因此，针对 NP-HEI-OC1 细胞开展的任何细胞毒性研究，都应投入大量努力以区分药物效应与培养条件本身的影响。此外，由于药物对已处于死亡状态或活力降低的细胞的作用可能不同于其对健康细胞的作用，我们建议在并非特别需要分化细胞的实验中使用 P-HEI-OC1 细胞。
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House Ear研究所-耳蜗器1（HEI-OC1）是目前可用于研究目的的少数小鼠听觉细胞系之一。本实验方案描述了如何培养和使用HEI-OC1细胞，以研究药物的细胞毒性作用以及内耳蛋白质的功能特性。

使用听觉HEI-OC1细胞进行实验

HEI-OC1 是为数不多可用于研究的鼠源听觉细胞系之一。最初被提出作为体外筛选耳毒性药物的模型系统……

本方案的总体目标是描述使用HEI-OC1细胞的基本操作流程，这些流程可用于研究药理学药物对听觉细胞的影响，并协助对运动蛋白prestin的功能特性进行表征。全球许多研究人员在不同目的、采用不同技术的实验中均使用HEI-OC1细胞。希望本文所述的操作步骤能够为这些研究提供一个共同的基础，使其结果具有可比性。当然，这些实验步骤仍有进一步优化的空间。但与本文所述方法的任何差异，都可能是理解与解释潜在矛盾结果的关键。在本演示中，我们将描述如何从冻存的HEI-OC1细胞 aliquot 开始操作，直至获得可用于多种常用技术进行不同研究的样本。开始此操作时，从液氮中取出一管冻存的 HEI-OC1 细胞，放入 37 摄氏度的水浴中。仅将试管下半部分浸入水中，使其融化至试管内仅剩少量冰块。在生物安全柜内，用 70% 酒精擦拭试管外壁。然后，用移液器将细胞从冻存管中吸出，并缓慢地逐滴加入含有10毫升预热培养基（如添加10%FBS的DMEM）的15毫升锥形管中。接着，通过离心5分钟去除DMSO。5分钟后，弃去上清液，并将细胞重悬于9毫升新鲜培养基中。用移液管尖端接触管底，将悬浮细胞在移液管与培养基之间反复吹打3至4次，以分散细胞团块或片状聚集体。随后，将含有细胞的全部培养液体积转移至直径100毫米的未处理塑料细胞培养皿中。在33摄氏度、10% CO2条件下培养细胞。在此步骤中，移除旧的培养基，并用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。然后，用0.25%胰蛋白酶覆盖细胞单层。当40%的细胞脱落时，使用倒置显微镜观察细胞。如有必要，轻轻晃动培养皿以释放任何残留的贴壁细胞。重悬细胞后，将离心管以5分钟离心去除胰蛋白酶。随后弃去上清液，并将细胞重悬于9毫升新鲜培养基中。接下来，通过移液枪头在培养基中反复吹打悬浮细胞3至4次，使细胞团块或细胞片层分散，吹打时枪头应接触管底。将细胞接种至直径100毫米的细胞培养皿中。在33摄氏度、10%CO2条件下培养，并根据计划实验的需要或建立新细胞库的需要进行多次传代。对于诱导分化，在允许条件下培养HEI-OC1细胞，直至细胞汇合度达到约80%。然后，在39摄氏度、5%CO2条件下培养细胞2至3周，每隔一天更换一次培养基以去除死细胞。开始此操作前，使用自动细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至所需值。接着，将细胞接种于96孔透明平底板、96孔白色壁板或6孔板中。如果特定实验有需要，先将细胞在底物上孵育过夜以促进贴附，然后再用目标药物进行处理。随后通过流式细胞术或其它适当的技术检测处理结果。收集细胞时，用 10 毫升无钙无镁的 PBS 洗涤细胞两次。加入 2 毫升无酶解离液，将细胞在 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育 3 分钟。使用倒置显微镜检查细胞解离情况。如有必要，可轻轻移动细胞培养皿以促进更多细胞脱落，注意避免剧烈摇晃。接着，加入 10 毫升 DMEM 培养基（含 10% FBS），轻轻吹打细胞上下 5 次。之后，在显微镜下观察细胞。如果已有超过 80% 的细胞脱离，无需进一步吹打。如果细胞仍处于簇状状态，则继续轻柔吹打，直至超过80%的细胞不再成簇。对细胞进行光学观察时，应可见大量单个、圆形且细胞膜边缘光滑的细胞。随后，按照文中所述实验方案进行膜片钳和非线性电容（NLC）测量。在非许可条件下培养的HEI-OC1细胞，其细胞活力显著下降，细胞死亡率亦显著升高，与在许可条件下培养的细胞相比差异明显。由于药物对已处于死亡状态或活力降低的细胞所产生的作用，可能不同于其对健康细胞的作用，因此在对NP-HEI-OC1细胞进行的任何细胞毒性研究中，均应投入充分努力以区分药物效应与培养条件效应。因此，我们建议在非特定需要分化细胞的实验中，使用在许可条件下培养的HEI-OC1细胞。此处展示的共聚焦图像证实了在 33 摄氏度和 39 摄氏度培养的 HEI-OC1 细胞中听觉运动蛋白 prestin 的表达。请注意，在允许性条件下生长的 HEI-OC1 细胞中，prestin 主要定位于细胞质；而在分化程度更高的细胞中，其在细胞膜上的分布更为集中。流式细胞术分析显示，在两种培养条件下 prestin 的表达均显著增加，表明其转位过程伴随着更多 prestin 分子的合成。另一方面，电生理学研究显示，在33摄氏度下培养的HEI-OC1细胞具有显著的非线性电容（NLC），当细胞在非许可条件下培养一周和两周后，其峰值降低，且峰值电容对应的电压向更去极化的方向偏移。有趣的是，这些结果提示，如果细胞膜中prestin分子的密度过高，其运动功能可能会受到影响。需要牢记的是，本文所述的实验方案依赖于标准细胞培养技术的正确操作。此外，请注意避免使用抗生素。同时需牢记，HEI-OC1 细胞的表型和反应将高度依赖于培养条件。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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