使用听觉HEI-OC1细胞进行实验

本实验方案的总体目标是描述使用HEI-OC1细胞的基本操作流程，这些流程可用于研究药理学药物对听觉细胞的影响，并协助对运动蛋白prestin的功能特性进行表征。全球许多研究人员在不同目的、采用不同技术的实验中均使用HEI-OC1细胞。希望本文所述的操作步骤能够为这些研究提供一个共同的基础，使其结果具有可比性。

当然，这些实验步骤仍有进一步优化的空间。但与本文所述方法之间的差异，可能是理解并解释可能出现的矛盾结果的关键。在本演示中，我们将介绍如何从冻存的HEI-OC1细胞开始操作，直至获得可用于多种常用技术进行不同研究的样本。

开始此操作时，从液氮中取出一管冻存的 HEI-OC1 细胞，放入 37 摄氏度的水浴中。仅将试管下半部分浸入水中，使其融化至试管内仅剩少量冰块。在生物安全柜内，用 70% 酒精擦拭试管外表面。

然后，用移液器吸取冻存管中的细胞，将全部体积缓慢地逐滴加入含有10毫升预热的生长培养基（如添加了10% FBS的DMEM）的15毫升锥形管中。接着，以离心方式去除DMSO，离心时间为5分钟。5分钟后，弃去上清液，并将细胞重悬于9毫升新鲜生长培养基中。

用移液枪尖端接触管底，将悬浮细胞在移液枪与培养基之间来回吹打三到四次，以分散细胞团块或片状结构。然后，将悬浮于生长培养基中的全部细胞转移至直径为100毫米的未处理塑料细胞培养皿中。在33°C、10%CO2条件下培养细胞。

在此步骤中，移除旧的培养基，并用两毫升 PBS 洗涤细胞。然后，用 0.25% 胰蛋白酶覆盖细胞单层。当 40% 的细胞脱落时，使用倒置显微镜观察细胞。

如有必要，轻轻晃动培养皿以释放任何残留的贴壁细胞。重悬细胞，并通过离心（5 分钟）去除胰蛋白酶。随后弃去上清液，将细胞重悬于 9 mL 新鲜培养基中。接下来，通过移液枪头在培养基中反复吹打悬浮细胞 3 至 4 次（枪头接触管底），以分散细胞团块或细胞片层。

将细胞接种至直径为100毫米的细胞培养皿中。在33°C、10%CO2条件下培养，并根据计划的实验需要或新细胞库的制备要求进行多次传代。对于分化实验，将HEI-OC1细胞在允许条件下培养，直至细胞融合度达到约80%。

然后，在39摄氏度、5%CO2条件下培养细胞2至3周，每隔一天更换一次培养基以去除死细胞。开始此操作前，使用自动细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至所需值。接着，将细胞接种于96孔透明平底板、96孔白色壁板或6孔板中。

如果特定实验有需要，可将细胞在药物处理前过夜孵育，以实现底物贴附。随后通过流式细胞术或其他适当技术检测处理后的结果。收集细胞时，用10毫升无钙无镁的PBS洗涤细胞两次。

加入 2 毫升无酶解离液，在 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育细胞 3 分钟。使用倒置显微镜观察细胞解离情况。如有必要，可轻轻移动细胞培养皿以促进更多细胞解离，注意避免剧烈震荡。

接着，加入 10 毫升 DMEM 培养基（含 10% FBS），轻轻吹打细胞 5 次。之后，在显微镜下观察细胞。如果已有超过 80% 的细胞脱离，无需进一步吹打。

如果细胞仍处于团块中，需继续轻柔吹打，直至超过80%的细胞不再处于团块状态。在光学显微镜下观察细胞时，应可见大量单个圆形细胞，其细胞膜边缘光滑。随后，按照文本方案中的描述进行膜片钳和非线性电容（NLC）测量。

在非许可条件下培养的HEI-OC1细胞表现出细胞活力显著下降，同时细胞死亡率显著升高，与在许可条件下培养的细胞相比差异极为明显。由于药物对已处于死亡状态或活力降低的细胞的作用可能不同于其对健康细胞的作用，因此在对NP-HEI-OC1细胞进行的任何细胞毒性研究中，均应投入充分努力以区分药物效应与培养条件效应。因此，我们建议在实验无需特异性使用分化细胞时，采用在许可条件下培养的HEI-OC1细胞。

此处展示的共聚焦图像证实了在 33 摄氏度和 39 摄氏度培养的 HEI-OC1 细胞中听觉运动蛋白 prestin 的表达。请注意，在允许性条件下生长的 HEI-OC1 细胞中，prestin 主要定位于细胞质；而在分化程度更高的细胞中，其在细胞膜上的分布更为集中。流式细胞术分析显示，在两种培养条件下 prestin 的表达均显著增加，表明其转位过程伴随着更多 prestin 分子的合成。

另一方面，电生理学研究显示，在33摄氏度下培养的HEI-OC1细胞具有显著的非线性电容（NLC），当细胞在非许可条件下培养一周和两周后，其峰值降低，且电容峰值对应的电压向更去极化的方向偏移。有趣的是，这些结果提示，如果细胞膜中prestin分子的密度过高，其运动功能可能会受到影响。需要牢记的是，本文所述的实验方案依赖于标准细胞培养技术的正确操作。

此外，请注意避免使用抗生素。同时，请记住HEI-OC1细胞的表型和反应将高度依赖于培养条件。