与听觉HEI-OC1细胞工作

该方案的总体目标是描述使用 HEI-OC1 细胞的基本程序，可用于研究药物对听觉细胞的影响，并协助运动蛋白 Prestin 的功能表征。HEI-OC1 细胞被世界各地的许多研究人员用于具有不同目标和不同技术的不同实验中。希望这里描述的程序将为使这些研究具有可比性提供一个共同的基础。

当然，这些实验程序可能会进一步改进。但是，与此处描述的差异可能是理解和解释可能相互矛盾的结果的关键。在本演示中，我们将介绍如何使用 HEI-OC1 细胞，从冷冻等分试样开始，到使用广泛可用的技术准备好样品以进行不同的研究。

要开始此过程，请从液氮中取出一小瓶冷冻保存的 HEI-OC1 细胞，并将其放入 37 摄氏度的水浴中。仅浸入样品瓶的下半部分，并使其解冻，直到样品瓶中只剩下少量冰。在生物安全柜中，用 70% 酒精擦拭样品瓶的外部。

然后，从小瓶中吸取细胞，将整个体积逐滴缓慢地输送到含有 10 mL 预热生长培养基（如补充有 10%FBS 的 DMEM）的 15 mL 锥形管中。接下来，离心试管 5 分钟，去除 DMSO。5 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 9 mL 新鲜生长培养基中。

通过在移液管和培养基之间通量和回流悬浮细胞 3 到 4 次，使移液管尖端接触管底，从而解聚细胞团块或片状细胞。然后，将悬浮在生长培养基中的细胞总体积放入直径为 100 毫米的未经处理的塑料细胞培养皿中。在 33 摄氏度和 10% CO 2 下孵育细胞。

在此步骤中，去除旧培养基并用 2 毫升 PBS 洗涤细胞。然后，用 0.25% 胰蛋白酶覆盖细胞单层。当 40% 的细胞已分离时，使用倒置显微镜检查细胞。

如有必要，轻轻摇动培养皿以释放任何剩余的贴壁细胞 重悬细胞，并通过离心试管 5 分钟去除胰蛋白酶。然后，弃去上清液，将细胞重悬于 9 mL 新鲜生长培养基中。接下来，通过在移液管和培养基之间通量和回流悬浮细胞来解聚细胞团块或片状细胞，移液管尖端接触管底 3 到 4 次。

继续将细胞接种在直径为 100 毫米的细胞培养皿中。将它们在 33 摄氏度下用 10% CO2 孵育，并根据计划的实验或生成新库存的需要将它们分成尽可能多的次。为了分化，在允许的条件下孵育 HEI-OC1 细胞，直到它们达到约 80% 汇合。

然后，将细胞在 39 摄氏度和 5% CO2 下孵育 2 到 3 周，并每隔一天更换一次培养基以去除死细胞。通过使用自动细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数来开始此过程，并将细胞浓度调整到所需的值。接下来，将细胞接种在 96 孔透明平底板、白壁 96 孔板或 6 孔板中。

如果特定检测需要，在用目标药物处理细胞之前，将细胞孵育过夜以进行底物附着。然后，通过流式细胞术或其他适当的技术测量治疗结果。要收获细胞，请用 10 毫升不含钙和镁的 PBS 洗涤两次。

加入 2 毫升无酶分离剂溶液，将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 3 分钟。使用倒置显微镜检查细胞的分离情况。如有必要，轻轻移动细胞培养皿以分离更多细胞，并注意不要摇晃。

接下来，加入 10 毫升 DMEM 和 10% FBS，轻轻上下移液细胞 5 次。之后，在显微镜下观察细胞。如果超过 80% 的细胞已经分离，则无需进一步移液。

如果细胞仍然成簇，请继续轻轻移液，直到超过 80% 的细胞不再成簇。细胞的光学控制应显示许多具有光滑膜边缘的单个圆形细胞。之后，按照文本协议中的说明继续进行膜片钳和 NLC 测量。

在非允许条件下培养的 HEI-OC1 细胞显示细胞活力高度显着降低，与在允许条件下培养的细胞相比，细胞死亡同样显着增加。由于药物对已经死亡或活力降低的细胞的影响可能与相同药物对健康细胞的影响不同，因此在对 NP-HEI-OC1 细胞进行的任何细胞毒性研究中，应付出相当大的努力来区分药物效应与培养条件的影响。因此，我们建议在宽松条件下培养的 HEI-OC1 细胞用于不特别需要分化细胞的实验。

此处显示的共聚焦图像证实了在 33 摄氏度和 39 摄氏度下培养的 HEI-OC1 细胞中听觉运动蛋白 prestin 的表达。请注意，prestin 免疫定位于在允许条件下生长的 HEI-OC1 细胞的细胞质上，并且在分化程度更高的细胞中，它更集中在质膜上。流式细胞术研究表明，在这两种情况下，prestin 表达均明显增加，表明易位伴随着更多 prestin 分子的合成。

另一方面，电生理学研究表明，在 33 摄氏度下生长的 HEI-OC1 细胞中具有稳健的 NLC，当细胞移动到非允许条件 1 周和 2 周时，峰值降低，峰值电容处的电压转变为更去极化的值。有趣的是，这些结果表明，如果质膜中 prestin 分子的密度过高，运动功能可能会受到影响。重要的是要记住，此处描述的方案需要正确使用成熟的细胞培养技术。

另外，请记住避免使用抗生素。此外，请记住，HEI-OC1 细胞的表型和反应在很大程度上取决于培养参数。