Name: 移植到小鼠卵巢脂肪垫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习小鼠卵巢脂肪垫移植技术，用于研究女性生殖道上皮组织的分化、再生和肿瘤潜能。该方法为生殖生物学和卵巢癌研究提供了可靠的体内实验模型。

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我们感谢堪萨斯大学医学中心的 Andrew K. Godwin 博士提供了人源 HIO118 细胞。本研究得到了纽约干细胞计划（NYSTEM；T028095）和美国国立卫生研究院/国立儿童健康与人类发展研究所（P50HD076210）向 AFN 提供的资助，以及纽约干细胞计划（C028125、C024174 和 T028095）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（CA182413）和卵巢癌研究基金（327516）向 AYN 提供的资助。

所述所有体内实验均已获得康奈尔大学机构动物照护与使用委员会批准。
1. 卵巢脂肪垫实验的样品制备
<ol>
	<li>原代输卵管上皮细胞的分离与培养
	<ol>
		<li>处死6至8周龄未交配的供体 β-肌动蛋白-增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 或 β-actin-Discosoma 红色荧光蛋白（DsRed） 小鼠通过一氧化碳2 安乐死后立即进行颈椎脱位。通过脚趾夹捏法确认安乐死是否成功。</li>
		<li>将一只小鼠置于吸水布上，腹面朝上，用70%乙醇擦拭腹部。沿身体正中线做一侧向切口以切开皮肤，然后用手指将切口上下方的皮肤分别向小鼠头部和尾部方向拉开。</li>
		<li>用钝头镊子夹住腹膜，用精细剪刀剪开以打开体腔。轻轻将盘绕的肠管推开，找到生殖器官。</li>
		<li>用精细镊子夹起一侧子宫角，在子宫角分叉点上方0.5 cm处剪断。在持握子宫角的同时，剥离附着于子宫角、输卵管、卵巢及卵巢脂肪垫的结缔组织。将解剖完毕的生殖道置于含有6 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。对另一侧生殖道进行相同操作。</li>
		<li>将培养皿转移至生物安全柜中，用6 ml无菌PBS清洗组织3次。在生物安全柜内的解剖显微镜下继续操作。用精细镊子夹住子宫角，并在子宫-输卵管交界处剪断，分离子宫角与输卵管。使用25 G针头切除包裹卵巢的卵巢囊。 
		注意：在去除卵巢囊后，解剖即已完成，单独的输卵管仍保留在PBS溶液中。</li>
		<li>将单根输卵管转移至3.5 cm培养皿中的50 µl PBS液滴中，使用28号针头将其剪切成约0.1 mm大小的组织块。转移至200 µl消化缓冲液1（DMEM/F12（Ham's）培养基，添加300单位/ml胶原酶Ⅳ和2.4单位/ml中性蛋白酶）中-1 胶原酶和100单位/毫升-1 透明质酸酶）在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时2 培养箱</li>
		<li>孵育后，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），用1 ml移液器吸头（即蓝色吸头）吹打悬浮液20次，持续3分钟。随后加入5 ml 4 °C的含2%胎牛血清的DMEM/F12（Ham's）培养基。</li>
		<li>通过离心收集组织（600 rcf，5 分钟，室温（RT）），加入 1 ml 消化缓冲液 2（DMEM F12（Ham's）培养基，添加 7 mg/ml 胶原酶 I、1 mg/ml 中性蛋白酶和 10 μg/ml DNase I）-1 Dispase II 和 10 µg/ml-1 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)。借助1 ml移液器吸头将组织沉淀重悬20次。</li>
		<li>加入5 ml无血清完全小鼠输卵管上皮细胞培养基（M-TE-GM，表1）。</li>
		<li>通过离心收集细胞（600 rcf，5 分钟，室温）。加入 1 ml M-TE-GM，重悬细胞并用血细胞计数板计数。接种 1 × 10⁶ 细胞5 24孔低吸附培养板中每孔1 ml，于37°C、5% CO₂条件下在M-TE-GM培养基中培养2 培养箱中孵育4天。</li>
		<li>每天更换培养基。</li>
		<li>制备培养的原代悬浮TE细胞的单细胞悬液 β-actin-EGFP 或 β-actin-DsRed 小鼠
		<ol>
			<li>从24孔低吸附培养板中收集TE悬浮培养物。离心（600 rcf，5 min，室温），用1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA重悬细胞沉淀。在37°C、5% CO₂条件下孵育10 min2 培养箱</li>
			<li>通过加入 5 ml 含 5% 胎牛血清的 DMEM/F12 (Ham's) 培养基终止胰蛋白酶活性。离心收集细胞沉淀（600 rcf，5 分钟，室温）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 4 ml 冷的 PBS（4°C）洗涤细胞沉淀两次，每份细胞沉淀加入 1 ml PBS 重悬。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并转移至 1.7 ml 离心管中。冰上操作，每 1 × 10⁶ 个细胞加入 100 μl 的 1× PBS 重悬液。5 将细胞重悬于10 µl PBS中，然后加入10 µl基底膜基质。冰上悬浮并运输至动物房。 
		注意：所有解剖和组织培养操作均须在生物安全柜中无菌条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>永生化人细胞系的制备
	<ol>
		<li>分别在37°C、5% CO₂条件下，于10 cm培养皿中培养携带lentivirus-EGFP和lentivirus-mCherry标记的人永生化卵巢表面上皮细胞系HIO118，直至细胞融合度达80–90%2 培养箱</li>
		<li>用 10 ml PBS 清洗培养皿两次，每皿加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 10 分钟2 培养箱。加入10 ml含5%胎牛血清的DMEM/F12（Ham's）培养基以终止反应。离心收集细胞沉淀（600 rcf，5 min，室温）。</li>
		<li>用10 ml冷的PBS（4°C）洗涤细胞沉淀两次，每份细胞沉淀加入1 ml PBS并重悬。使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后转移至1.7 ml离心管中。</li>
		<li>在冰上操作，加入 1.0 x 106 Lenti-mCherry 标记的细胞 + 1.0 × 106 将Lenti-EGFP标记的细胞加入10 µl PBS中，再加入10 µl基底膜基质。混匀后置于冰上，运输至动物房。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫输卵管的制备
	<ol>
		<li>从6至8周龄未交配的β-actin-DsRed小鼠中，在PBS中解剖分离单个输卵管，操作步骤如1.1.1–1.1.5所述。将单个输卵管转移至解剖显微镜下200 µl PBS液滴中。借助镊子和28号针头，小心去除支持输卵管各段的阔韧带部分——即输卵管系膜，使输卵管逐渐舒展。将舒展后的单个输卵管置于200 µl冰冷PBS液滴中，直至受体小鼠卵巢脂肪垫暴露并准备接受移植。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵巢脂肪垫移植
注意：每次动物手术之间需对器械进行消毒。所有设备应提前准备并摆放妥当。建议将移植物背侧移植至右侧卵巢脂肪垫，以避免触及脾脏。然而，受体动物的双侧卵巢脂肪垫均可进行移植。
<ol>
	<li>使用同源小鼠或重度联合免疫缺陷（SCID/NCr）小鼠作为原代细胞的受体。对于人源细胞（如HIO118细胞），使用Nod/SCID/gamma（NSG）小鼠或SCID小鼠。</li>
	<li>通过腹腔注射2,2,2-三溴乙醇对受体小鼠进行麻醉，剂量为每10克体重0.15 ml。将动物置于加热垫上，在动物操作台中通过脚趾夹捏测试确认足底反射消失以判断麻醉效果。在动物麻醉期间，于眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。&#160;皮下注射镇痛药酮洛芬，剂量为每克体重4 mg，用于术后镇痛。 
	注意：可选用异氟烷作为替代麻醉剂。将动物放入诱导室，调节氧气流量计至0.8–1.5 L/min，异氟烷挥发器至2–3%。待动物麻醉后将其移出诱导室，通过面罩吸入异氟烷维持麻醉，调节氧气流量计至0.4–0.8 L/min，异氟烷挥发器至1.5%，随后开始手术。</li>
	<li>使用#40剃毛刀头剃除手术区域的毛发，去除范围应为手术区域面积的两倍；依次使用聚维酮碘进行三次消毒擦洗，再用70%乙醇处理，最后覆盖无菌手术巾。</li>
	<li>将动物转移至生物安全柜内的解剖显微镜下。在卵巢脂肪垫正上方的背内侧位置做切口，暴露生殖道。 
	注意：关键步骤：精确的皮肤切口有助于伤口愈合，建议在步骤2.4中使用手术刀。</li>
	<li>使用钝头精细镊子小心地将卵巢脂肪垫经切口拉向中线，尽量减少对神经和主要血管的损伤。 
	关键步骤：若出现出血，应立即停止手术，并考虑更换其他宿主动物进行移植。</li>
	<li>在解剖显微镜下，借助28号斜面针头，在卵巢上方3–4 mm处的卵巢脂肪垫上做2–4 mm深的切口。 
	关键步骤：确保切口仅穿透脂肪垫的一半深度；若完全穿透至底部会导致泄漏。此步骤完成后应迅速进行后续操作，不得延误。</li>
	<li>进行细胞移植时，用注射器（30号针头）吸取10–20 µl细胞-基底膜基质混合物，并注入脂肪垫切口内。进行输卵管移植时，用精细镊子夹取输卵管，置于冰上保存的10–20 µl基底膜基质中。使用0.1–10/20 µl XL带刻度滤芯吸头（缩短3 mm）吸取组织与基底膜基质悬浮液，并释放至脂肪垫切口内。</li>
	<li>等待5分钟使基底膜基质凝固，然后将生殖道复位至腹腔内。用两针外科缝线缝合肌肉层，皮肤则使用两个小型伤口夹或外科缝线闭合。</li>
	<li>重复步骤2.4–2.8，在动物对侧脂肪垫内移植PBS-基底膜基质混合物，作为对照。 
	关键步骤：手术后应将动物置于加热垫上，因为麻醉小鼠体温流失迅速。</li>
	<li>让动物在原饲养笼内的加热垫上恢复，并持续观察直至完全从麻醉中苏醒。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。动物未完全恢复前，不得将其放回与其他动物共同饲养的笼中。</li>
	<li>术后除笼内常规干饲料外，另在笼中放置少量预先润湿的饲料颗粒。根据需要在术后数日内给予镇痛药物，并每日检查伤口情况。如发生伤口感染，应根据批准的动物实验方案使用抗生素。术后10天，当伤口完全愈合后拆除伤口夹。</li>
</ol>
3. 组织学与图像采集
<ol>
	<li>移植物采集与保存
	<ol>
		<li>通过混合26 ml ddH2O、4 ml 10x PBS 和 10 ml 16% 多聚甲醛溶液，配制 4% 多聚甲醛溶液。</li>
		<li>按照步骤 1.1.1–1.1.4 所述，整体解剖移植的卵巢脂肪垫、卵巢、输卵管及 0.5 cm 子宫组织。立即放入 2 ml 4% 多聚甲醛中，在室温下固定 2 小时。从同一动物中解剖未移植的对侧卵巢脂肪垫系统（移植 PBS-基底膜基质混合物作为对照，见步骤 2.9），以相同方式固定和处理。</li>
		<li>固定后，用 PBS 洗涤组织三次，每次 5 分钟，随后在 4 °C 的 PBS 中过夜孵育。</li>
		<li>如需进行卵巢脂肪垫的整体成像，请进入步骤 3.2.1。 
		注：图像采集后，组织可进行冷冻保存（3.3.1）或石蜡包埋处理（3.3.2）。在 4 °C 下用含 30% 蔗糖的 PBS 过夜孵育，可提高冷冻组织的质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>将整体卵巢脂肪垫系统置于盛有 PBS 的培养皿中，使用配备落射荧光附件和高清彩色相机的倒置显微镜（物镜为 4× 和 10×）以及配备荧光附件、彩色相机和 Plan Apo 1xWD70、ED Plan 1.5xWD45 物镜的体视显微镜进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织学处理
	<ol>
		<li>完成整体成像（3.2.1）后，将 200–500 µl 冷冻组织包埋介质滴加在一块 2 × 1 cm 的实验室薄膜上。用镊子将组织转移至液滴中。提起薄膜一端，将组织-介质液滴转移至 1.8 ml 冻存管中。盖紧管盖后迅速浸入液氮。将冷冻组织储存在 -80 °C 下。</li>
		<li>或者，采用标准石蜡包埋法处理。每一步使用组织体积的 20–40 倍体积试剂。
		<ol>
			<li>在 65% 乙醇中浸渍组织一次，室温轻摇 30 分钟。</li>
			<li>在 70% 乙醇中浸渍组织一次，室温轻摇 30 分钟。此阶段样品可在室温下保存数月。</li>
			<li>在 90% 乙醇中浸渍组织一次，室温轻摇 30 分钟。</li>
			<li>在 95% 乙醇中浸渍组织一次，室温轻摇 30 分钟。</li>
			<li>在无水乙醇（200 proof）中浸渍组织两次，每次 30 分钟，室温轻摇。</li>
			<li>在氯仿中浸渍组织两次，每次 30 分钟，室温轻摇。</li>
			<li>在石蜡中浸渍组织一次，58 °C 轻摇 30 分钟。</li>
			<li>在石蜡中浸渍组织一次，58 °C 轻摇 12 小时。</li>
			<li>在石蜡中浸渍组织一次，58 °C 下 3 小时。</li>
			<li>将组织放入金属组织学模具中，并用 58 °C 石蜡填充模具。在石蜡上方放置塑料组织学盒，冷却至 +4 °C。取出石蜡-组织块，室温保存。 
			注：为保证组织适用于免疫组织化学染色，石蜡温度不应超过 58 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>或者，使用标本处理凝胶进行石蜡包埋准备。
		<ol>
			<li>吸除 PBS，将整体组织转移至 70% 乙醇中，室温孵育 2 小时。在水浴中将标本处理凝胶预热至 60 °C。</li>
			<li>将 200 µl 标本处理凝胶滴加至铺有实验室薄膜的培养皿中。用精细解剖镊将整体组织系统转移至凝胶液滴中。</li>
			<li>让标本处理凝胶凝块在室温下自然固化，或在 4 °C 下固化 10 分钟。</li>
			<li>将含标本处理凝胶的组织置于组织学组织盒中，夹在活检泡沫垫之间。按步骤 3.3.2–3.3.2.10 进行石蜡包埋。 
			注：标本处理凝胶包埋可防止组织丢失，适用于保存小型脆弱组织样本。 
			注：通过冷冻或石蜡包埋保存的组织均适用于免疫组织化学染色14,15。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们建立了一种卵巢脂肪垫移植检测方法，可实现上皮细胞和组织的精确定位与检测。与囊内注射10-12相比，卵巢脂肪垫移植操作在技术上更为简便，且与腹腔内注射9相比，能够实现移植细胞更均匀、更精确的定位。该方法也适用于整个器官（如输卵管）的长期移植。
重要的是，卵巢脂肪垫为女性生殖系统的上皮细胞提供了熟悉的微环境。它特别适用于研究人和小鼠卵巢及输卵管上皮细胞在再生和恶性转化过程中的分子与细胞特性。与其他器官相比，目前针对女性生殖道上皮中干细胞的鉴定与特征分析的研究较少18,19。这类研究尤为重要，因为许多癌症被认为起源于成体干细胞20。然而，上皮性卵巢癌的细胞起源仍存在很大争议18。上皮性卵巢癌占卵巢癌的大多数，在美国女性癌症相关死亡中位居第五21。因此，开发一种在多个方面优于现有移植技术的原位检测方法9-12，将极大促进该领域的研究进展。
由于卵巢脂肪垫位置表浅，可利用小动物成像系统对携带强荧光或生物发光报告基因的移植组织进行追踪观察。此外，也有望建立微创的高分辨率活体成像检测方法，例如非线性显微成像22。卵巢脂肪垫还可用于器官培养，从而在接近体内细胞排列和细胞外基质结构的条件下，实现正常及肿瘤上皮组织的三维培养。未来的研究应进一步探索这些具有前景的可能性。
必须考虑若干关键步骤。在手术过程中提供加热垫并保持啮齿类动物体温，可显著提高存活率。处理脂肪垫的器械必须保持无菌，以确保移植系统处于无菌状态。根据我们的经验，明显的出血会导致移植物生长迟缓。重要的是，脂肪垫切口应精确操作，因为撕裂脂肪垫或穿透其组织会造成出血。必要时应使用止血剂控制出血。如果移植物未能发育，应考虑增加注射细胞的浓度。首次成功的外生长最早可在移植后一周内观察到，大多数移植物在手术后一个月内应可见。进行移植时，可使用较大直径的针头（23-25 G），以防止对较大细胞（直径超过10 µm）造成剪切损伤。然而，此类针头可能对脂肪垫造成更大的创伤，因此其使用应预先进行测试。在我们的实验中，供体和受体小鼠的年龄为6至8周，但更年轻或更年老的小鼠也可用于此目的。不过，注射细胞的数量可能需要相应调整。此外，还需考虑年轻供体卵巢脂肪垫体积较小的情况。
与任何方法一样，小鼠卵巢脂肪垫移植实验也存在一些局限性。尽管同源免疫健全小鼠可用于小鼠原代细胞/组织的实验，但我们的技术在移植人源材料时需要使用NSG或SCID小鼠。理论上有可能通过“人源化”脂肪垫来支持人上皮细胞的生长，但我们尚未测试这一方法。使用较年轻的雌性小鼠可能有助于降低繁殖成本；然而，成年未交配雌性小鼠（8至10周龄）具有更大的脂肪垫，因而可容纳更大尺寸的移植样本。最后，实验人员应接受过动物手术培训，以确保该操作能够及时且成功地完成。

移植实验涉及将细胞和组织引入小鼠特定的体内部位，是研究组织再生和癌变过程的重要方法。将细胞进行原位移植，即将其置于天然微环境中，对于成体干细胞的鉴定尤为重要。乳腺干细胞的存在最初是通过将乳腺上皮组织片段移植到无腺体的小鼠乳腺脂肪垫中而提出的1。将人源化小鼠脂肪垫用于移植实验，成功重现了人原代乳腺上皮细胞的再生潜能和正常发育过程2。此外，将表型不同的细胞类型连续地或进行极限稀释后移植至去除了内源组织的乳腺脂肪垫，对于检测乳腺干细胞的自我更新能力及多向分化潜能至关重要3-5。结合遗传谱系示踪技术的移植实验为乳腺癌发生中起源细胞的身份提供了证据5。肾包膜下移植常用于检测潜在的前列腺干细胞特性6。对正常及肿瘤性小鼠和人类胰腺类器官进行原位移植，揭示了癌症进展过程中发生改变的基因与信号通路7。将汗腺移植至不同部位（如乳腺脂肪垫、肩部脂肪垫和背部皮肤）后观察到的多样化再生能力，也进一步支持了天然微环境的重要性8。
腹腔和卵巢囊通常被用作女性生殖道上皮细胞原位移植的部位9-12。这两种方法均存在若干局限性。将细胞注入腹腔后，细胞会在腹腔的不同区域发生种植，从而增加监测细胞生长的难度。此外，腹腔不同区域的微环境差异可能较为显著，例如血管化程度、神经支配以及免疫细胞分布等。卵巢囊的容积非常有限，最多只能注入10 µl液体，这显著限制了可接种的细胞数量。此外，向卵巢囊内注射在技术上具有较高难度，且操作过程耗时较长。
为解决这些局限性，我们利用了小鼠卵巢脂肪垫的特性。小鼠卵巢脂肪垫体积较大，紧邻卵巢和输卵管，且易于通过手术途径接触。已有报道称，马的滋养层细胞可被移植至小鼠卵巢脂肪垫中13，但该方法的具体操作细节并未被描述，也未见报道该方法是否适用于成体细胞和组织。本文中，我们描述了一种可靠的小鼠及人类女性生殖道细胞移植技术，并证明该方法同样适用于长期的器官移植。

<table><tbody><tr><td>25号针头</td><td>BD 贝克顿·迪金森</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>28号针头（带针头的皮下注射器）</td><td>肯德尔</td><td>30339</td><td>货号：8881500014</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Geltrex）</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白-DsRed 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>6051</td><td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白-EGFP 转基因小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/透明质酸酶</td><td>干细胞技术</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispase II</td><td>沃辛顿</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12（HAM's）</td><td>康宁</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI（脱氧核糖核酸酶 I）</td><td>干细胞技术</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>冷冻组织标本包埋剂（O. C. T.）</td><td>Sakura Finetek&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 proof</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>制备70%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头 0.1-10/20 &amp;micro;l XL&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>FOXJ1 抗体</td><td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>以1:1,000浓度使用（无需抗原修复）</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>硕腾</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>实验室用封口膜（Parafilm M）</td><td>美国国家罐业公司</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>康宁</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，250 ml</td><td>Santa Cruz Animal Health</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>低吸附24孔板</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>康宁</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>金属组织学模具</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>62527-22</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，体视</td><td>尼康</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/gamma (NSG) 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>05557</td><td>NOD.Cg-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;Il2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;/SzJ</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>石蜡（Paraplast，X-TRA）</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>PAX8 抗体</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>以1:1,000浓度使用（无需抗原修复）</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水）</td><td>康宁</td><td>&amp;nbsp;21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>重症联合免疫缺陷（SCID/NCr）小鼠，BALB/C 背景</td><td>美国国家癌症研究所-弗雷德里克动物生产项目</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>康宁</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>标本处理凝胶（HISTOGEL）</td><td>理查德-艾伦科学公司</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，25%</td><td>康宁</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr></tbody></table>

移植至小鼠卵巢脂肪垫

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

小鼠原位移植实验对于研究细胞再生和肿瘤转化具有重要价值。目前对卵巢表面和输卵管上皮进行原位移植的常用方法包括细胞的腹腔内注射和卵泡囊内注射。这些方法各自的局限性在于注射细胞的位置不明确以及可容纳空间有限。此外，这些方法难以实现移植器官长期的结构完整性保存。为解决这些问题，我们开发了一种替代方法，即将细胞和组织碎片植入小鼠脂肪垫中。小鼠卵巢脂肪垫位于卵巢和子宫输卵管（又称输卵管、输卵管）的邻近区域，为这些器官的细胞和组织提供了相似的微环境。在本方法中，通过微创的背部切口手术，将荧光标记的小鼠和人类细胞以及输卵管组织碎片进行移植。移植后的细胞及其生长产物可在卵巢脂肪垫中稳定存在并易于定位，持续时间超过40天。对完整输卵管进行长期移植可准确保留所有主要组织成分，且不会引起纤维化、炎症等不良副作用。本方法特别适用于研究特定细胞群体的分化能力、再生潜能及肿瘤形成潜能等重要生物学问题，同时也适用于正常发育和癌症过程中微环境因素的研究。

在解剖显微镜下，可将实验用细胞和组织精确移植至卵巢脂肪垫中（图1）。示例包括来源于普遍表达EGFP的小鼠的原代小鼠输卵管上皮细胞（图2A）或表达DsRed的小鼠（图2B），以及用mCherry和EGFP慢病毒标记的人永生化卵巢表面上皮细胞HIO11816,17细胞（图2C–F）。该方法也适用于器官的长期移植，例如小鼠输卵管（图3）。根据免疫组织化学染色结果，在移植组织的输卵管上皮中，纤毛细胞（FOXJ1阳性14）和分泌细胞（PAX8阳性15）均得以保留（图3D和E）。
<img alt="卵巢组织操作系列，包括荧光图像；发育生物学研究。" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：卵巢脂肪垫移植。（A）移植区域暴露（箭头所示）。（B）使用28 G针头进行穿刺（箭头所示）。（C）通过移液器尖端将UT/基底膜基质混合物植入（箭头所示）。（D）UT已成功植入（箭头所示，亮红色，来自β-actin-DsRed 小鼠的UT）。FP，脂肪垫；Ov，卵巢；UT，输卵管。比例尺 = 2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="组织荧光显微镜图像；图A-F显示细胞结构和蛋白质定位。" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：移植的小鼠原代输卵管上皮细胞和人永生化卵巢表面上皮细胞的检测。（A，B）将来自β-actin-EGFP小鼠的原代小鼠输卵管上皮细胞（箭头，A，绿色）和β-actin-DsRed小鼠（B，红色）移植至同系小鼠后第8天的细胞生长情况。（C，D）将混合标记的HIO118细胞（箭头）分别用Lenti-EGFP（绿色）或Lenti-mCherry（红色）标记后，移植至NSG小鼠体内第10天的移植物情况。（D）为（C，箭头）区域的放大图。（E，F）将与C、D组相同的细胞移植至SCID小鼠后第43天形成的移植物（箭头）。A-D、F为荧光图像；E为明场图像。FP，脂肪垫；Ov，卵巢；UT，输卵管。（A、B、D-F）比例尺 = 500 µm；（C）比例尺 = 1,600 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光与组织学方法分析生殖组织，重点标记 PAX8 和 FOXJ1。" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 子宫输卵管移植的表征 (A完整的输卵管（箭头） β-actin-DsRed 移植至卵巢脂肪垫后6天的小鼠（箭头，亮红色）。B) 移植脂肪垫的荧光冰冻切片如图所示（A）。红色，DsRed；蓝色，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）细胞核复染。C) 输卵管移植物（箭头所示），移植至NSG受体小鼠后40天。石蜡切片。注意所有主要输卵管结构成分均得到良好保存，且无移植相关纤维化和炎症。苏木精-伊红染色。D, E) 移植物中细胞（箭头所示）的输卵管上皮标志物配对盒基因 8（PAX8）和叉头框 J1（FOXJ1；棕色核染色，箭头）的检测结果如图（C）。免疫过氧化物酶系统。甲基绿复染。FP，脂肪垫；Ov，卵巢；UT，输卵管。（A）比例尺 = 1,000 µm；（B）比例尺 = 200 µm；（C-E）比例尺 = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>1x DMEM F12 (Ham’s) 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>表皮生长因子</td>
			<td>10 ng ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碱性成纤维细胞生长因子-2</td>
			<td>10 ng ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氢化可的松</td>
			<td>500 ng ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰岛素</td>
			<td>5 µg ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转铁蛋白</td>
			<td>5 µg ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亚硒酸钠</td>
			<td>5 ng ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>100 units ml-1 / 100 µg ml-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最低必需培养基伊格尔（MEM）非必需氨基酸</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>10-4 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：小鼠输卵管上皮细胞生长培养基（M-TE-GM）。 左列列出的组分以右列所示浓度溶解于1x DMEM F12（Ham's）培养基中。最终培养基不含血清。

我们描述了一种适用于女性生殖道正常及转化上皮研究的卵巢脂肪垫移植实验方法。小鼠脂肪垫可实现大块组织片段的移植，手术和成像操作便捷，并为苗勒氏管来源的组织提供了最有利的天然微环境。

小鼠原位移植实验对于细胞再生和肿瘤性转化的研究具有重要价值。常见的原位移植方法包括……

本卵巢脂肪垫移植实验的总体目标是为在最适宜的天然环境中研究女性生殖道的正常及转化上皮提供便利。该方法有助于解答本领域中的关键问题，例如女性生殖道特定细胞群体的分化潜能、再生潜能以及肿瘤形成潜能。该技术的主要优势在于，小鼠卵巢脂肪垫可支持细胞和大块组织片段的移植。手术和成像操作便捷。腹腔和卵巢囊常被用作女性生殖道上皮细胞原位移植的部位。这些方法存在多种局限性。根据文本方案处死β-actin EGFP或β-actin DS red小鼠后，将一只小鼠置于吸水铺巾上，腹侧朝上。沿腹中线做一横向切口以切开皮肤，用手指将切口上下方的皮肤分别向小鼠头部和尾部方向牵拉。用钝头镊夹住腹膜，使用精细剪刀打开体腔。然后，轻轻拨开肠管，找到生殖器官。用精细镊子夹住一侧子宫角，在两侧子宫角分叉点上方0.5厘米处剪断。接着，在固定子宫角的同时，剥离附着在子宫角、输卵管、卵巢及卵巢脂肪垫上的结缔组织。将解剖得到的生殖道组织置于含有六毫升无菌 PBS 的培养皿中，并在按照文本方案培养原代输卵管上皮（TE）细胞之前，先对第二个生殖道组织进行相同操作。根据文本方案，在解剖显微镜下，将六至八周龄未交配的 beta-actin DS red 小鼠的子宫角中分离出单个输卵管，并将其转移至含有 200 微升 PBS 的液滴中。使用镊子和 28 号针头，通过去除支持输卵管各段的阔韧带部分——即输卵管系膜，轻柔地将输卵管展开解旋。将单个部分解旋的输卵管置于200微升冰冷PBS液滴中，直至受体小鼠的卵巢脂肪垫暴露并准备接受移植。将动物转移至生物安全柜中进行脂肪垫移植。按照文本所述方案麻醉同系小鼠后，使用40号剪刀剃除手术区域面积两倍大小的毛发。使用聚维酮碘进行消毒，随后使用70%乙醇，完成三次外科刷洗。接着，将动物置于解剖显微镜下。然后，用手术刀在卵巢脂肪垫正上方的背内侧位置做一切口，暴露生殖道。随后，用无菌手术巾覆盖该区域。接着，用钝头精细镊子小心地将卵巢脂肪垫通过切口向中线方向牵拉，尽量减少对神经和主要血管的损伤。为防止移植物生长受阻，脂肪垫切口应尽可能精确，因为将脂肪垫完全撕裂或穿孔会导致出血。必要时应使用止血剂控制出血。使用28号斜面针头，在卵巢上方3至4毫米处的卵巢脂肪垫内做一个2至4毫米深的切口，确保针头仅穿透脂肪垫约一半深度。对于细胞移植，用30号针头的注射器吸取10至20微升细胞基底膜基质混合物，注入脂肪垫切口内。进行输卵管移植时，使用精细镊子夹取输卵管，并将其置于冰上预冷的10至20微升基底膜基质中。然后，用0.1至10至20微升XL带刻度滤芯吸头吸取组织与基底膜基质悬浮液，将其释放至脂肪垫切口内。等待五分钟，使基底膜基质凝固，随后将生殖道复位至腹膜腔内。使用两针外科缝线缝合肌肉，并用小型伤口夹或外科缝线闭合皮肤。移植后，按照文本方案让动物恢复。为收集和保存移植物，通过将26毫升双蒸水与4毫升10X PBS及10毫升16% PFA溶液混合，配制4%多聚甲醛（PFA）溶液。将移植的卵巢脂肪垫、卵巢、输卵管和子宫整体解剖取出后，立即放入 2 毫升 4% PFA 中，在室温下固定 2 小时。从同一动物体内，以相同方式固定并处理未移植的对侧卵巢脂肪垫作为对照。固定完成后，用 PBS 洗涤组织三次，每次 5 分钟，随后在 4 摄氏度下置于 PBS 中过夜孵育。根据文本方案进行整体成像和组织学分析。在本实验中，来自β-actin DS red小鼠的输卵管被移植并植入同系小鼠的卵巢脂肪垫中，如本荧光图像所示。图中显示的是将β-actin EGFP小鼠和β-actin DS red小鼠的原代小鼠输卵管上皮细胞移植到同系小鼠体内八天后的细胞生长情况。此图像显示了将携带Lenti-eGFP或Lenti-mCherry标记的混合HI0118细胞移植到NSG小鼠体内10天后的移植情况。在这些图中，箭头指示的是将混合HI0118细胞移植到SCID小鼠体内后形成的43天龄移植物。在此荧光图像中，显示了移植到卵巢脂肪垫六天后来自β-actin DS red小鼠的完整输卵管。本图中，荧光脂肪垫的冰冻切片经DAPI复染。移植至NSG受体小鼠体内40天后的输卵管移植物显示输卵管各组分完全保留，且无纤维化和炎症表现。最后，切片经输卵管上皮标志物Pax8和FOXJ1染色，并以甲基绿复染，以分别显示纤毛细胞和分泌细胞的保留情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在20至30分钟内完成。在实施该操作时，预先准备好手术器械、试剂和仪器至关重要。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如活体成像和抗癌药物注射，以回答有关癌症形成及抗癌治疗效果的更多科学问题。该技术为生殖生物学和卵巢癌领域的研究人员探索女性生殖道组织中正常干细胞功能及癌症发生机制铺平了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离细胞和输卵管组织，并将其移植至脂肪垫中。请务必注意，在无菌条件下进行动物活体手术操作对于获得成功结果至关重要。为啮齿类动物提供加热垫以保持其体温，可显著提高存活率。

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大鼠乳腺上皮细胞移植至肩胛间白色脂肪垫

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移植至小鼠卵巢脂肪垫

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