Name: 使用克隆测定神经干细胞的计数。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习利用克隆条件下神经球形成与分化技术，在13天内快速测定神经干细胞频率。该方法可评估候选标记物、纯化细胞并区分神经干细胞与祖细胞。

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感谢新加坡科技研究局（A*STAR）对本研究的资助。

动物处理遵循 IACUC 和 NACLAR 指南，并由动物部门批准（(http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11)。 
注意：神经球培养物取自胚胎期（E14）C57BL/6 小鼠的前脑，制备方法如前所述5。
1. 克隆样本神经球的培养（第1天）
<ol>
	<li>通过将DMEM/F12培养基与B27添加剂（终浓度：1x）、EGF（终浓度：20 ng/mL）、bFGF（终浓度：10 ng/mL）以及青霉素/链霉素（终浓度：1x）混合，配制NSC生长培养基。</li>
	<li>解离E14.5小鼠神经球于1 mL中&#160;NSC 生长培养基和 1 mL&#160;0.05 N 氢氧化钠，室温处理 7 分钟。期间偶尔用移液器轻轻吹打细胞，以保持细胞悬浮状态。加入 1 mL&#160;0.05 N 盐酸以中和碱。 
	注意：神经球细胞以每毫升20,000个细胞的密度接种于10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下培养5天2预期产量在……之后&#160;约为每10 cm培养皿1000万个细胞。随后按照步骤1.2和1.3所述方法将细胞解离并以克隆密度接种。
	<ol>
		<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以每毫升50个细胞的密度接种单个E14.5小鼠神经球细胞&#160;或在100 µL中低于此值&#160;NSC生长培养基于96孔板中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 培养1周以生成克隆性神经球。 
	注意：在此密度下，细胞不相互接触，从而在神经球形成过程中确保克隆性。</li>
</ol>
2. 神经球培养以制备条件培养基（第3天）
<ol>
	<li>按照步骤1.2所述方法解离E14.5小鼠神经球。</li>
	<li>将E14.5小鼠神经球的单细胞以20,000 cells/mL&#160;的密度接种于10 mL神经干细胞生长培养基中，置于10&#160;cm培养皿内。于37 °C、5% CO2条件下培养5天，以获得大量培养的神经球。</li>
</ol>
3. 神经球条件培养基的制备（第8天）
<ol>
	<li>通过混合700 µL的0.01%聚-L-赖氨酸（PLL）和70 µL&#160;1 mg/mL 层粘连蛋白和 6,230 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）</li>
	<li>用7 mL包被10 cm培养皿&#160;PLL/层粘连蛋白溶液孵育 2 小时&#160;在 37 °C 下。</li>
	<li>使用一个10 mL&#160;血清移液管，将所有大量培养的神经球转移至15 mL&#160;锥形离心管。在室温下以171 × g离心1分钟，收集神经球，并彻底移除上清液。</li>
	<li>通过将DMEM/F12培养基与B27（终浓度：&#160;1×）和胎牛血清（FBS）（终浓度：0.5%）&#160;加入10 mL&#160;将NSC分化培养基加入神经球中，轻轻吹打数次以重悬神经球。</li>
	<li>吸出10 cm培养皿中的PLL/层粘连蛋白溶液，用10 mL洗涤一次&#160;PBS。将所有神经球转移至PLL/Laminin包被的10&#160;cm 培养皿中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养2 使神经球贴附于培养皿。</li>
</ol>
4. 样品神经球NFU的测定（第8天）
<ol>
	<li>在显微镜下计数每个孔中形成的神经球数量（第1天接种；第1节）。 
	注意：确定每接种100个细胞所形成的神经球数量，以此计算神经球形成单位（NFU）。</li>
</ol>
5. 将神经球样本转移至50孔板载玻片（第8天）
<ol>
	<li>在37 °C条件下，用10 µL&#160;PLL/层粘连蛋白包被液对50孔板载玻片的每个孔进行包被，孵育2&#160;h&#160;。 
	注意：包被液的配制方法见步骤3.1。</li>
	<li>准备3个50 mL&#160;锥形离心管，每管加入30 mL&#160;PBS。使用无菌镊子取出已包被的50孔板载玻片，依次浸入第一管、第二管和第三管PBS中，以洗去残留的包被液。</li>
	<li>吸去50孔板载玻片各孔中残留的液体。</li>
	<li>轻轻吸取96孔板中每个孔内的全部培养基和神经球，并将其&#160;转移至一个10 cm培养皿中。</li>
	<li>在显微镜下，使用装有10 µL&#160;吸头的P10移液器挑取一个神经球样本。每次仅挑取单个神经球，可通过将移液器体积设为2 µL来确保。每个神经球均需使用新的吸头。</li>
	<li>将神经球转移至已包被的50孔板载玻片的某一孔中央。</li>
	<li>重复步骤5.5和5.6，直至50孔板载玻片的每个孔中均含有一个神经球。 
	注意：神经球的挑选可在超净台内的显微镜下或在台面上的显微镜下进行。</li>
	<li>向50孔板载玻片的每个孔中加入10 µL&#160;NSC分化培养基。将50孔板载玻片放入一个10 cm培养皿中，并沿培养皿边缘加入PBS以防止NSC分化培养基干燥。每个10 cm培养皿中最多可放置两个50孔板载玻片。将50孔板载玻片（置于10&#160;cm培养皿中）在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
6. 样本神经球的分化（第9天）
<ol>
	<li>将大量培养的神经球（来自第3节）中的分化培养基转移至15 mL&#160;锥形离心管中。确保培养皿中残留2–3 mL&#160;分化培养基，以防止贴壁细胞脱落。使用20 mL&#160;无菌注射器，将分化培养基通过0.2 µm滤膜过滤，以去除任何细胞或碎片。</li>
	<li>将过滤后的分化培养基重新转移至含有贴壁细胞的10&#160;cm培养皿中。</li>
	<li>使用无菌镊子，将带孔盖玻片轻轻倒置放入含有分化培养基的培养皿中，使待测神经球朝下。将带孔盖玻片在37 °C、5% CO2条件下与分化培养基共同孵育3天。 
	注意：待测神经球与分化培养基接触，但不与下方正在分化的细胞接触。</li>
</ol>
7. 分化神经球的固定（第12天）
<ol>
	<li>使用无菌镊子轻轻将带孔的盖玻片从10 cm培养皿中取出。将盖玻片轻轻浸入PBS中，以洗去条件培养基。</li>
	<li>小心地将硅胶垫圈从盖玻片上剥离。操作时应轻柔缓慢，避免损坏盖玻片。注意记录神经球附着的一侧。</li>
	<li>吸取1 mL&#160;4%多聚甲醛（PFA）溶液，滴加至一块裁剪成盖玻片大小的石蜡膜上。将盖玻片轻轻放置在石蜡膜上，使神经球朝下接触PFA溶液。在室温下固定神经球20分钟。 
	注意：PFA在液体和蒸气状态下均有毒性，且具有可燃性。避免吸入其蒸气，防止接触皮肤和眼睛。操作PFA时务必在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>吸取1 mL&#160;PBS溶液，滴加至一块石蜡膜上。将盖玻片轻轻放置在石蜡膜上，使神经球朝下接触PBS溶液，在室温下清洗10分钟。</li>
	<li>重复步骤7.4两次。</li>
</ol>
8. 分化神经球的O4染色（第12天）
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 3% 牛血清白蛋白（BSA）。取 1 mL&#160;3% BSA 滴加至一片石蜡膜上。将盖玻片（神经球面朝下）轻轻置于 BSA 液滴中，在室温下封闭 30 分钟。</li>
	<li>取 1 mL&#160;小鼠抗 O4 IgM 抗体（用 3% BSA 按 1:300 稀释）滴加至一片石蜡膜上，将盖玻片（神经球面朝下）置于石蜡膜上，使神经球与抗体接触。室温孵育 2 h&#160;以完成 O4 染色。</li>
	<li>按照步骤 7.4 所述方法，用 PBS 洗涤盖玻片两次。</li>
	<li>取 1 mL&#160;绿色荧光染料标记的抗小鼠 IgM 二抗（用 3% BSA 按 1:500 稀释）滴加至一片石蜡膜上，将盖玻片（神经球面朝下）置于石蜡膜上，使神经球与二抗接触。室温避光孵育 1 h&#160;。 
	注意：从本步骤开始，所有免疫染色操作均需在避光环境中进行。</li>
	<li>按照步骤 7.4 所述方法，用 PBS 洗涤盖玻片两次。</li>
</ol>
9. 分化神经球（第12天）的Tuj1和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
<ol>
	<li>通过加入 Triton-X 100（终浓度：&#160;0.5%）加入至3% BSA中。用移液器吸取1 mL&#160;将透化溶液滴加到一片石蜡膜上。将载玻片置于石蜡膜上，使神经球朝下接触透化溶液，室温孵育20分钟。</li>
	<li>按照步骤7.4所述，用PBS清洗盖玻片两次。</li>
	<li>移液1 mL&#160;小鼠抗Tuj1 IgG2a 抗体（1:500 稀释度在&#160;3% BSA）和兔抗 GFAP IgG 抗体（1:1,000 稀释于 3% BSA 中），将一张石蜡膜置于其上，并将载玻片盖在石蜡膜上，使神经球朝下接触抗体。室温下避光孵育 2 小时以完成 Tuj1 和 GFAP 染色。 
	注意：两种抗体可配制为单一溶液。</li>
	<li>按照步骤7.4所述，用PBS清洗盖玻片两次。</li>
	<li>移液1 mL&#160;红色荧光染料偶联的抗小鼠IgG2a （在3% BSA中按1:500稀释）以及远红荧光染料标记的抗兔IgG（在3% BSA中按1:500稀释）二抗，滴加于一片石蜡膜上，将含有神经球的盖玻片倒置放在石蜡膜上，使神经球与抗体接触。室温孵育1小时。 
	注意：两种抗体可配制成单一溶液。</li>
	<li>按照步骤7.4所述，用PBS清洗盖玻片两次。</li>
	<li>将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储存液用PBS稀释至300 nM。移液1 mL&#160;将DAPI滴加到一片石蜡膜上，将含有神经球的盖玻片倒置放在石蜡膜上，使神经球与DAPI接触，室温下孵育2分钟以进行细胞核染色。</li>
	<li>用 PBS 清洗盖玻片一次，再用去离子水清洗两次，操作同 7.4 步骤所述。使用适当的封片介质将盖玻片封于载玻片上，室温避光干燥过夜。</li>
</ol>
10. 分化神经球的成像（第13天）
<ol>
	<li>使用40倍物镜在共聚焦显微镜下观察神经球。分别采用488 nm、594 nm和647 nm的激光检测少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞。</li>
	<li>确定单能、双能和三能神经球所占的百分比。 
	注：神经球的分化潜能由其能否分化为三种神经谱系——少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞来确定5,14,15,26。少突胶质细胞通过O4阳性染色鉴定（第8节）。神经元通过Tuj1阳性染色鉴定（第9节）。星形胶质细胞通过GFAP阳性染色鉴定（第9节）。单能神经球仅分化为一种谱系，应仅对O4、GFAP或Tuj1之一呈阳性染色。双能神经球可分化为任意两种谱系，应对O4与GFAP、O4与Tuj1、或GFAP与Tuj1呈阳性染色。三能神经球可分化为全部三种谱系，应对O4、GFAP和Tuj1均呈阳性染色。</li>
	<li>利用以下公式计算目标细胞群体中的神经干细胞（NSC）频率： 
	NSC频率 = （神经球形成单位数NFU × 三能神经球百分比）/ 100%。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了在克隆条件下对神经干细胞（NSCs）进行计数的方法。关键步骤包括使用新鲜的NSC生长与分化培养基，以及使用新配制的PLL/层粘连蛋白（Laminin）溶液对腔室载玻片和培养皿进行包被，以确保神经球处于最佳的生长和分化状态。使用高质量的抗体以有效检测神经元和胶质细胞，同时选择性地挑取未与其他神经球接触的单个克隆性神经球，是实验成功的关键。此外，必须确保挑取的神经球不会干燥&#160;。建议每挑取10个神经球后，向每个孔中加入10 µL&#160;分化培养基。每个10 cm培养皿中应仅使用一个腔室载玻片，每个样本独立使用一个培养皿，以避免不同样本来源的神经球之间发生交叉干扰。若将两个腔室载玻片（各自含有不同样本的神经球）置于同一个10 cm培养皿中，一个载玻片上的神经球可能释放某些因子，影响另一个载玻片上神经球向特定谱系分化的倾向。同一10 cm培养皿中放置两个载玻片还可能导致样本之间的混&#160;淆。
如果NFU或NSC的频率低于预期，应确保使用低代次的神经球。此外，生成条件培养基时也必须使用健康的低代次神经球。其次，若将神经球培养在孔径较小的孔板中（例如96孔板），则使用移液器操作和挑选神经球会较为困难。此时，可在挑选前将神经球转移至较大的培养皿中，例如6孔板。在培养和免疫染色过程中，部分已挑选的神经球可能会从带孔盖玻片上脱落。在培养期间尽量减少带孔盖玻片的移动，以及在免疫染色时减少剧烈洗涤，有助于防止神经球脱落。
早期研究仅使用NFA7,11,13对神经干细胞（NSCs）进行定量。然而，由于NSCs和早期神经前体细胞（NPs）均可形成神经球，NFA会高估NSCs的频率5。Louis et al. 开发了另一种用于定量NSCs的方法，称为NCFCA21,22。NCFCA通过将单个细胞培养在基于胶原的基质中以确保克隆性，并已证明直径超过2 mm的神经球仅由NSCs形成。与NCFCA类似，本实验方案在整个过程中均保证了克隆性。这是通过在克隆密度下生成神经球，并在带腔室的盖玻片上对神经球进行分化实现的。使用带腔室的盖玻片具有多项优势。该装置可使每个样本神经球在分化过程中不与其他样本神经球发生物理接触，从而确保分化阶段的克隆性。带腔室的盖玻片可悬浮于分化培养基中，使样本神经球持续处于适宜条件，以确保最大程度的分化。若在分化过程中缺乏条件培养基和血清，神经球的存活率会下降，且主要分化为星形胶质细胞（Tham M 和 Ahmed S，未发表）。此外，免疫染色后的神经球可方便地长期保存，且带腔室的盖玻片可直接安装在显微镜载玻片上。同时，由于可在小型腔室孔中快速定位神经球、拍摄图像后立即进入下一个孔，免疫染色神经球的成像操作也更为简便。
我们采用本论文所述方案27和神经干细胞频率半克隆形成分析法（NCFCA）28，测定了E14.5小鼠神经球培养物中的NSC频率。两种方法测定的E14.5小鼠神经球中NSC频率具有可比性。NCFCA可计数具有多向分化潜能和长期自我更新能力的NSC。由于本方法所得NSC频率与NCFCA结果相当，表明本方案的检测结果似乎并未高估NSC频率。NCFCA需耗时三周，主要涉及细胞接种和培养基更换。而本文所述方案需13天完成，涉及一系列不同的操作步骤，e.g.，神经球挑选和免疫染色。该方案可作为计数NSC的替代方法。研究人员可同时使用NCFCA和本方案来验证其样本中的NSC频率。
本方案的一个局限性在于，一系列重要步骤必须全部在第8天完成。条件培养基的制备、待测神经球的NFU测定以及将待测神经球转移至50孔腔室盖玻片等操作均需在第8天进行。完成这些步骤可能需要较长时间，此外，要高效地执行这些操作也需要一定的实践经验。
神经球已被广泛用于研究神经干细胞（NSC）的功能和行为。然而，神经球由神经干细胞（NSC）和神经前体细胞（NP）共同组成。因此，为了研究神经干细胞的生物学特性，从神经球中富集神经干细胞至关重要。目前，已利用细胞表面标志物、染料排斥特性以及细胞大小和粒度等方法来富集神经干细胞6,7,9-13,29,30。本实验方案可用于量化潜在神经干细胞标志物对神经干细胞的富集效果，并有助于寻找明确的神经干细胞标志物。已有四项近期研究采用该方案来测定神经干细胞的频率5,14,15,26。

神经干细胞（NSCs）是中枢神经系统（CNS）中具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。NSCs 最初在胚胎前脑发育过程中被确定，并持续存在于成年大脑的特定区域，例如侧脑室的室下区（SVZ）和海马体的齿状回（DG）。目前，多种神经干细胞系正在用于治疗中风及其他神经系统疾病（如巴滕病）的临床试验中1。
神经干细胞（NSCs）和神经前体细胞（NPs）在体外培养中以悬浮的三维球状结构——神经球的形式进行扩增。神经球培养体系由 Reynolds 和 Weiss 在20世纪90年代初期建立，他们发现胚胎期和成年期的皮层细胞在表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）存在的条件下能够发生分裂。2-4神经球由处于不同发育阶段的多种亚类细胞组成的异质性细胞混合物5由于神经球中存在神经前体细胞（NPs），利用神经球获得的数据特异性研究神经干细胞（NSCs）具有挑战性。因此，从神经球中富集NSCs至关重要。目前已有四种主要方法用于NSCs的富集。 体外首先是细胞表面标志物的使用。Lewis-X（LeX）和CD133（也称为Prominin1）是最为显著的神经干细胞（NSC）细胞表面标志物。6-9Syndecan-1、Notch-1 和 Integrin-beta1 是其他可富集神经干细胞的表面蛋白10第二是染料排除法。已有研究表明，具有独特能力将荧光DNA结合染料Hoechst 33342泵出的侧群细胞中，神经干细胞（NSCs）富集程度较高。11第三是利用形态学筛选。已证明，细胞体积和颗粒度增大的细胞所含神经干细胞（NSCs）数量多于其对应细胞。5,12,13第四步是在培养基中添加神经干细胞存活因子。已有研究表明，添加硫酸软骨素蛋白聚糖和载脂蛋白E可增强神经干细胞的存活，从而提高神经干细胞的频率14,15尽管已有多种标志物（包括转录因子）被发现与神经干细胞相关16,17，这些标记物均无法将神经干细胞（NSCs）富集至纯度。由于缺乏明确的NSC特异性标记物，定量NSCs并将其与神经前体细胞（NPs）区分开来仍然是一个挑战 体外.
早期研究采用神经球形成实验（NFA）来定量神经干细胞（NSCs）7,11,13。在该实验中，将解离的细胞进行培养以形成神经球，并测定每接种100个细胞所生成的神经球数量。该数值被称为神经球形成单位（NFU）。如果所有神经球均来源于神经干细胞，则NFU等于神经干细胞的频率。然而，已有研究表明，由于神经球可由神经干细胞和早期神经前体细胞（NPs）共同形成，因此NFU会高估神经干细胞的实际频率5。因此，仅依据神经球的形成来计数神经干细胞是不准确的。可根据神经干细胞的自我更新能力、广泛增殖能力以及生成多能性神经球的特性来对其进行定量分析。
NSCs 具有对 EGF 和 bFGF 的响应性，通常可在体外培养中存活至少十代，因而表现出强大的自我更新能力4,18-20纳米颗粒（NPs），其为&#160;EGF 和 bFGF 也有响应性，也可生成神经球并传代数次，但无法长期维持。因此，这一现象已被广泛接受 真正有效的 神经干细胞（NSCs）可通过神经球形成法在至少十代传代中进行相对准确的计数。然而，在大多数研究中，由于十代传代所需实验时间较长，自我更新能力通常基于二次或三次神经球形成来测定。因此，二次神经球形成分析（NFA）可用于 broadly 比较不同细胞群体间的自我更新能力，但不能用于精确测定NSC频率。
与神经前体细胞（NPs）相比，神经干细胞（NSCs）具有更强的增殖能力。Louis et al. 利用 NSCs 的这一特性建立了一种用于计数 NSCs 的检测方法——神经集落形成细胞检测法（neural colony-forming cell assay, NCFCA）21,22。在该检测中，单个细胞被培养于含有胶原蛋白的半固体基质中，持续培养 3 周。研究表明，在此类培养条件下，所形成的神经球直径超过 2 mm 的细胞具有三向分化潜能，并能长期自我更新。这些细胞被定义为神经干细胞（NSCs）。因此，该方法可有效区分 NSCs 与 NPs。
神经干细胞（NSCs）具有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的能力。为了诱导神经球分化，需从培养基中去除生长因子并添加血清。&#160;如果在一个神经球中观察到全部三种神经谱系细胞，则可认定该神经球起源于一个神经干细胞。然而，分化实验存在一定局限性。首先，用于分化的培养条件可能并非三种神经谱系细胞生成的最佳条件。事实上，在单个神经球的分化过程中，常出现明显的细胞死亡，且主要生成星形胶质细胞（Tham M 和 Ahmed S，未发表数据）。其次，存在克隆性问题。为准确计数神经干细胞，神经球的形成与分化必须在克隆条件下进行，即每个神经球均由单个细胞发育而来。而在批量悬浮培养中，细胞和神经球层面均可能发生聚集现象23-25。因此，每个神经球可能来源于多个细胞或多个神经球的融合，这使得神经球计数和多能性评估变得复杂。最新研究表明，在接种密度低于或等于0.5个细胞/µL&#160;且神经球形成过程中不移动培养板的条件下，细胞聚集现象不会发生15。因此，在如此低的密度下培养细胞可确保克隆性。
目前，神经集落形成细胞分析法（NCFCA）是最常用于区分神经干细胞（NSCs）与神经前体细胞（NPs）并测定NSC频率的方法。然而，该方法需要相对较长的时间&#160;三周时间。本文描述了一种基于神经干细胞（NSCs）形成多能性神经球能力来定量NSC频率的实验方案。该方案仅需13天即可完成。神经干细胞频率检测法（NCFCA）通过胶原基质限制神经球的移动，从而确保克隆性。本方案所采用的培养条件亦可全程维持克隆性。例如，使用50孔腔室盖玻片可确保神经球在分化过程中互不接触。此外，我们在分化阶段使用含神经营养因子的条件培养基，以最大化神经球的分化潜能（图1).

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 无菌注射器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>300141</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>300144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Tuj1 IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt; 抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-100</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFAP IgG 抗体</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>配备于层流罩的显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Marienfeld-superior</td><td>1000200</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 O4 IgM 抗体&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100-F</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>NuAire</td><td>NU-543</td><td></td></tr><tr><td>96 孔培养板</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>NUNC</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤器&amp;nbsp;</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534-K</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 滤器</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555-K</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N 氢氧化钠（NaOH）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N 盐酸（HCl）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）粉末&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>有毒</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）粉末&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>50 孔板载玻片&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7735</td><td></td></tr><tr><td>带加热功能的搅拌器&amp;nbsp;</td><td>Stuart</td><td>UC152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 1× 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgM 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt; 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6&amp;rsquo;-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;RT1 75002383</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10006021</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抽吸装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用克隆实验计数神经干细胞

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

神经干细胞（NSCs）具有自我更新的能力，并能生成三大主要神经谱系——星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。NSCs和神经前体细胞（NPs）通常在体外培养 体外 作为神经球。本方案详细描述了如何在克隆条件下测定特定细胞群体中的神经干细胞（NSC）频率。该方案首先以适当的细胞密度接种细胞，以确保形成克隆性神经球。随后将神经球转移至带腔室的盖玻片中，在条件培养基中进行克隆条件下的分化，以最大化神经球的分化潜能。最后，根据神经球的形成能力及其多向分化潜能计算NSC频率。该方案的应用包括评估候选NSC标志物、纯化NSC，以及区分NSC与神经前体细胞（NP）。本方法需13天完成，显著短于目前用于测定NSC频率的其他方法。

关键词：神经干细胞，NSC频率，克隆培养，神经球，多向分化潜能，条件培养基，神经前体细胞

我们已使用本方案评估LeX（一种已知的神经干细胞表面标志物7）对神经干细胞的富集能力。本研究的数据将用于说明如何利用本方案中的克隆实验对神经干细胞进行计数。将E14.5小鼠神经球细胞与抗LeX抗体孵育，随后通过荧光激活细胞分选（FACS）将表达LeX的细胞（LeX+）和不表达LeX的细胞（LeX-）以50个细胞/mL的密度接种，并培养1周以形成克隆性神经球。延时成像显示，在50个细胞/mL密度下生成的神经球具有克隆性（图2）。测定LeX+和LeX-细胞的神经球形成单位（NFU）。结果显示，LeX+细胞的神经球形成能力显著高于LeX-细胞（图3g）。随后在克隆条件下对生成的神经球进行分化，并进行免疫染色和成像（图3a-e）。LeX+细胞生成的三向分化潜能神经球数量显著多于LeX-细胞（图3f）。然后根据NFU和三向分化神经球所占百分比计算神经干细胞频率（图3g）。基于LeX的筛选可使神经干细胞频率富集超过14倍，从而验证了LeX作为神经干细胞标志物的有效性。我们还利用本方案27和NCFCA28测定了E14.5小鼠神经球中的神经干细胞频率。两种方法报告的神经干细胞频率相近，均约为2%。
<img alt="克隆神经球分化的示意图；盖玻片、培养基过滤、神经球贴附。" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 克隆条件下神经球分化的实验方案。 在克隆条件下培养的神经球被分别转移至经多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的50孔腔室盖玻片的每个孔中，并于室温过夜贴附。同一天，将大量培养的神经球接种于经多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的10 cm培养皿中，加入分化培养基并过夜贴附。次日，收集大量培养神经球的条件培养基，经滤膜过滤后重新加入该10 cm培养皿中。随后将含有样本神经球的腔室盖玻片倒置在该条件培养基上，使其分化3–4天28。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="克隆神经球生长过程、显微镜图像、随时间推移的细胞聚集情况；比例尺 100 µm。" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 克隆性神经球的生长。 来源于E14.5神经球的细胞经解离后以每毫升50个细胞的密度接种于96孔板中。通过延时成像技术对单个细胞连续追踪6天。图中显示了一个单细胞发育为神经球的过程。请注意，该神经球始终保持克隆性。(a) 第0天；(b) 1.19.45；(c) 2.95.37；(d) 3.32.76；(e) 4.46.53；(f) 5.61.44；其中第一个数字表示天数，第二个数字表示该天的时间分数，第三个数字表示小时的时间分数。10X 放大倍数。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="神经球分化、荧光显微镜图像、神经前体细胞百分比的柱状图。" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 单克隆神经球的分化及神经干细胞频率的计数。 挑取单个神经球，在50孔腔室盖玻片中培养3天以诱导其分化。图中显示一个具有三向分化潜能的神经球的代表性图像，分别用(a) DAPI染色，以及通过免疫荧光染色标记(b) GFAP、(c) Tuj1 和 (d) O4。(e) 为(a)至(d)的叠加图像。比例尺：65 µm。(f) LeX+ 和 LeX- 细胞生成的单能、双能和三能神经球所占百分比（均值 ± 标准误；n = 3）。(g) LeX+ 和 LeX- 细胞中的神经干细胞频率，计算方式为神经球形成单位（NFU）与三能神经球百分比的乘积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

神经干细胞（NSCs）是指一类细胞&#160;具有自我更新能力并可分化为三种神经谱系。本文介绍一种在克隆条件下通过神经球形成与分化来测定特定细胞群体中神经干细胞频率的实验方案。

神经干细胞（NSCs）具有自我更新的能力，并能生成三大主要神经谱系——星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。

本实验的总体目标是通过在克隆条件下进行神经球形成与分化，以定量分析特定细胞群体中神经干细胞的频率。该方法在神经干细胞研究领域具有重要应用价值，可用于评估候选神经干细胞标志物、纯化神经干细胞以及区分神经干细胞与神经前体细胞。该方法的优势在于操作周期为13天，短于目前其他用于测定神经干细胞频率的技术，且实验在克隆条件下进行。开始此操作时，在第一天，通过将DMEM F12培养基与B27、EGF、bFGF和青霉素-链霉素混合，制备NSC生长培养基。接着，在1毫升NSC生长培养基和1毫升0.05正常氢氧化钠中解离E14.5小鼠神经球，室温孵育7分钟。期间偶尔用移液器吹打细胞，以保持细胞悬浮状态，然后加入1毫升0.05正常盐酸以中和碱性环境。随后，使用台盼蓝染色法和血细胞计数板进行细胞计数。接着，在96孔板中，每孔加入100微升神经干细胞生长培养基，以每毫升50个细胞或更低的密度接种单个E14.5小鼠神经球细胞。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养一周，以生成单克隆神经球。为了培养用于条件培养基的神经球，在第3天解离E14.5小鼠神经球，并将单细胞以每毫升20,000个细胞的密度接种于10厘米培养皿中，加入10毫升NSC生长培养基。随后将细胞在37°C、5%CO₂条件下孵育5天，以生成大量培养的神经球。在第8天，通过混合700微升0.01%多聚-L-赖氨酸、70微升层粘连蛋白（添加至1毫克/毫升）以及6,230微升PBS来制备包被溶液。接下来，在37摄氏度条件下，用7毫升聚-L-赖氨酸-层粘连蛋白溶液对10厘米培养皿包被2小时。使用10毫升血清移液管，将所有大量培养的神经球转移至15毫米锥形离心管中。在室温下以171 × g离心1分钟，然后彻底去除上清液。随后，通过将DMEM F12培养基与B27和FBS混合配制NSC分化培养基。向神经球中加入10毫升NSC分化培养基，轻轻吹打数次以重悬神经球。然后吸除10厘米培养皿中的多聚赖氨酸-层粘连蛋白，并用10毫升PBS洗涤一次。将所有神经球转移至预先包被多聚-L-赖氨酸-层粘连蛋白的10厘米培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜，使神经球贴附于培养皿表面。第8天，在显微镜下计数每个孔中形成的神经球数量，随后在50孔腔室盖玻片的每个孔中加入10微升多聚-L-赖氨酸-层粘连蛋白包被液，于37摄氏度孵育2小时。接着，准备三个50毫升锥形离心管，每管加入30毫升PBS。使用无菌镊子取出包被的50孔盖玻片，将带孔的盖玻片依次浸入第一管PBS、第二管PBS，然后浸入第三管PBS，以洗去包被液。随后，吸去盖玻片各孔中残留的液体。轻柔地将96孔板中每个孔内的全部培养基和神经球转移至一个10厘米的培养皿中。每次操作时，通过将移液器柱设置为两微升，在显微镜下使用装有10微升吸头的P10微量移液器挑选单个神经球，以确保每次仅挑取一个神经球。可在显微镜下进行神经球的挑选，操作位置可置于超净工作台内或实验台面上。随后，将神经球转移至包被过的50孔腔室盖玻片中某一孔的中央位置。重复上述操作，直至每个腔室载玻片的孔中均含有一个神经球。随后，向腔室载玻片的每个孔中加入10 µL NSC分化培养基。将腔室载玻片置于10 cm培养皿中。最多可将两个带腔室的盖玻片放入一个10厘米培养皿中。沿培养皿边缘加入PBS，以防止神经干细胞分化培养基干燥。将带腔室的盖玻片置于37摄氏度、5%CO2条件下过夜培养。第9天，将大量培养的神经球中的条件培养基转移至15毫升锥形离心管中。使用20毫升无菌注射器将条件培养基通过0.2微米滤膜过滤，以去除任何细胞或碎片。然后，将过滤后的条件培养基重新转移至10厘米培养皿中。随后，使用无菌镊子轻轻将带孔盖玻片以倒置方式放入已预处理的培养基中，使样本神经球朝下。将带孔盖玻片在37°C、5%CO₂条件下培养三天。第12天时，使用无菌镊子轻轻将带孔盖玻片从10厘米培养皿中取出。轻轻将盖玻片浸入PBS中，以洗去条件培养基。随后，小心缓慢地从盖玻片上剥离硅胶垫圈，操作时需轻柔缓慢，避免损坏盖玻片。注意记录分化神经球所附着的一侧。随后，取一毫升4%多聚甲醛滴加到一块裁剪成盖玻片大小的石蜡膜上。将盖玻片轻轻放置在石蜡膜上，使神经球朝下与多聚甲醛接触，并在室温下固定20分钟。此处，挑取单个神经球并在50孔板盖玻片中培养三天以进行分化。这是三向分化神经球的代表性图像，使用 DAPI 以及针对 GFAP、TUJ1 和 O4 的免疫染色进行标记。该图像显示了 DAPI、GFAP、TUJ1 和 O4 染色信号的叠加结果。本方案用于评估 LeX（一种已知的神经干细胞标志物）对神经干细胞富集的能力。该图表展示了 LeX 阳性细胞与 LeX 阴性细胞所产生的单向分化、双向分化和三向分化神经球所占的百分比。LeX 阳性细胞产生的三向分化神经球显著多于 LeX 阴性细胞。该表格显示，LeX阳性细胞与LeX阴性细胞的神经干细胞频率是通过NFU与三向分化神经球百分比的乘积计算得出的。观看本视频后，您应能够充分理解如何在克隆条件下培养和诱导神经球分化，以定量神经干细胞频率。在实施该方法时，务必使用新鲜配制的生长与分化培养基，以及新鲜配制的包被溶液，以确保神经球获得最佳的生长和分化条件。掌握该方法后，可在13天内完成操作，相较于目前用于计数神经干细胞频率的方法，耗时更短。该方法可与现有的神经集落形成细胞检测等技术联合使用，以富集新型干细胞并鉴定明确的神经干细胞标志物。

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