用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

本实验的总体目标是制备用于在同步辐射和自由电子激光X射线源上进行序列晶体学数据收集的膜蛋白晶体脂立方相样品。该方法有助于解答膜蛋白结构生物学领域中的关键问题，例如跨膜运输和信号转导。该技术的主要优势在于，可在室温下以天然脂质环境中实现膜蛋白的结构解析，同时样品消耗极低，并且辐射损伤可忽略不计。

初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为脂质立方相是一种黏稠的凝胶状物质，若无特殊工具和先前经验则难以操作。按照文字版实验方案所述，使用一号和二号注射器，从膜蛋白在脂质立方相（Lipidic Cubic Phase，LCP）中的重组开始本实验操作。待形成透明且均匀的LCP后，将全部样品转移至二号注射器中。

保持连接器与二号注射器相连的同时，取下一号注射器。将可拆卸针头连接至另一个100微升洁净注射器（称为三号注射器）。吸取约70微升沉淀剂溶液至其中。

将针头从3号注射器上取下，同时保持聚四氟乙烯小球保留在注射器内。通过连接器将2号和3号注射器连接，确保两个注射器内的聚四氟乙烯小球位置正确。小心地将连接器完全拧紧到位。

将耦合的注射器垂直放置，二号注射器在下方，然后缓慢而稳定地将二号注射器中含蛋白的LCP样品注入三号注射器，直至LCP细丝接触三号注射器的推杆。注入的LCP体积约为三号注射器中初始沉淀剂体积的1/10。通过两个注射器上的刻度读数确认体积。

然后，断开第二注射器。此时，连接器仅与第三注射器相连，该注射器内含有浸没在沉淀剂溶液中的样品。使用Parafilm将第三注射器完全密封，包括推杆与注射器的接口处、连接器的开口端以及针头螺母处。

此步骤中密封不完全可能导致沉淀条件改变以及样品脱水。重复蛋白负载的LCP样品注射步骤，在另外六个注射器中设置结晶，共使用约50 µL的LCP样品。将密封的注射器存放在塑料密封袋中，并放入一至两张预先用纯水浸湿且无纤维的清洁纸巾，以防止样品脱水。

密封袋子，并将注射器置于20°C的培养箱中，用于晶体生长。为检测晶体，每隔12至24小时将注射器从培养箱中取出，在体视显微镜下使用交叉偏振光直接观察注射器内的LCP样品。晶体可被识别为紧密排列的闪亮颗粒；若晶体较小，则表现为LCP细丝中均匀的发光现象。

将密封的注射器放回袋中，并于20摄氏度保存以备后续使用。脂质滴定步骤是必要的，用于吸收过量的沉淀剂溶液，并防止样品在注入X射线自由电子激光束时发生脂质冻结。在开始数据采集前约一小时，从20摄氏度培养箱中取出装有样品的注射器。

根据晶体外观和结晶条件的相似性，选择两到四个注射器用于样品合并。小心移除所选注射器上的Parafilm封口膜。取下注射器连接器，并将洁净的可拆卸针头连接至第一个选定的注射器上。

轻轻缓慢推动柱塞，使沉淀剂通过针头挤出至微量离心管中。此步骤需格外小心，因为对柱塞施加过大的压力可能导致部分含晶体的LCP与沉淀剂溶液一同喷出，造成样品部分或完全损失。当大部分沉淀剂已被移除且LCP已在针头入口处积聚时，停止推动柱塞。

对其他选定的注射器重复此操作。为合并所得的LCP样品，通过一个洁净的连接器将两个注射器连接在一起。按下一个注射器的推杆，将其中一个注射器中的全部样品转移至另一个注射器中。

取下空的注射器。重复此步骤，将所有含晶体的LCP材料合并至一支注射器中。尽可能去除沉淀剂。

向一支空注射器中加入约五微升7.9 MAG或原始的短链MAG宿主脂质。通过注射器连接头将该注射器与装有合并样品的注射器相连，交替推动两个注射器的推杆进行混合。重复此操作，直至所有残留溶液完全吸收，形成均一透明的脂立方相（LCP）。

将混合后的LCP样品全部转移至一支注射器中，并取下空的注射器。将LCP注射器装样针连接至装有合并样品的注射器上。小心地将约一微升LCP样品挤出至载玻片上，并用盖玻片覆盖。

轻轻按压盖玻片以夹紧样品。使用体视显微镜，在尽可能高的放大倍数下，结合明场照明和交叉偏振器对LCP样品进行成像。如条件允许，进一步使用紫外荧光显微镜及成像系统拍摄图像，以确认样品中是否存在蛋白质微晶。

估算晶体大小和密度。用于数据收集实验的理想晶体密度取决于晶体尺寸、X射线束直径以及LCP射流的直径，且应使晶体命中率达到约10%至40%。最后，装载LCP注射器，并按照文本方案所述进行LCP串行飞秒晶体学（LCP SFX）数据收集。图中显示的是5-羟色胺受体与麦角胺复合物的微晶，分别采用明场显微模式和交叉偏振光显微模式成像。

通过LCP SFX方法获得了血清素受体与麦角胺复合物的结构。图中显示的是与环杷明形成复合物的平滑素受体微晶，采用交叉偏振显微镜模式成像。该受体与环杷明复合物的结构亦通过LCP SFX方法获得。

一旦掌握，若操作得当，该实验流程可在两小时内完成。尽管该方法主要用于研究膜蛋白靶标的结构，但经过轻微修改后，也可应用于其他蛋白质。该技术的应用前景涵盖药物发现领域；因为高分辨率结构可为标准木脂素类蛋白质相互作用提供优良的模板，并有助于设计出更高效的药物。