Name: 制备及脂质立方相反应蛋白微晶交付串行飞秒晶体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习在脂质立方相中制备膜蛋白微晶的方法，用于同步辐射和X射线自由电子激光的串行晶体学数据采集。该技术可在室温下以极少样品消耗测定膜蛋白结构，显著降低辐射损伤风险。

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本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 R01 GM108635 和 U54 GM094618、梅奥诊所-亚利桑那州立大学合作种子基金奖以及美国国家科学基金会科学与技术中心（STC）奖项 1231306 的支持。我们感谢 A. Walker 在手稿准备过程中提供的帮助。

1. 溶液和脂质的过滤
注意：本实验方案中使用的所有试剂和工具应尽可能洁净，以避免样品中引入颗粒污染物，这些污染物可能会堵塞LCP注射器。
<ol>
	<li>使用5 µm离心过滤器过滤所有沉淀剂溶液和熔融脂质。彻底清洗注射器，并用压缩空气干燥。可选地，在样品制备过程中可使用便携式洁净室罩，以防止灰尘颗粒或纤维混入。</li>
</ol>
2. 在LCP中重建MP
注意：用于结晶的最佳LCP宿主脂质的选择取决于目标膜蛋白（MP），通常在宿主脂质筛选结晶实验过程中确定14。单酰基甘油（MAGs）是LCP结晶中最常用的脂质类别15。本方案基于使用9.9 MAG（单油酸甘油酯）作为宿主脂质，因为迄今为止这是in meso结晶最成功的脂质16。可根据其他LCP宿主脂质或脂质混合物的相行为差异，将其替代9.9 MAG。例如，在G蛋白偶联受体（GPCRs）的情况下，通常将单油酸甘油酯与胆固醇混合以稳定受体。此处，使用9:1（w/w）的9.9 MAG:胆固醇混合物作为宿主脂质。
<ol>
	<li>将纯化于去垢剂胶束溶液中的目标膜蛋白（MP）与适量的LCP宿主脂质使用两支注射器（#1和#2）及一个连接器混合，操作方法如前所述。13.</li>
	<li>简而言之，将熔融脂质装入注射器#1，将MP溶液装入注射器#2。脂质与水相MP溶液的比例应控制在略低于相应LCP宿主脂质最大水合能力的水平。 例如，9.9 MAG 采用 3:2 体积比（v/v）的脂质/MP 溶液，大多数其他短链 MAG（7.9 MAG、9.7 MAG）采用 1:1 体积比（v/v）的脂质/MP 溶液 等等。).</li>
	<li>通过注射器连接器将注射器连通，推动活塞使混合物在注射器之间来回转移，开始混合物质，直至样品变得均一且透明。为进行LCP-SFX完整数据集的采集，准备约50 µl的LCP样品。在样品整合与脂质滴定后（第5节），最终样品体积通常会增加约两倍（至~100 µl）。</li>
</ol>
3. 在注射器中设置结晶
<ol>
	<li>当形成透明且均匀的LCP后，将整个样品转移至注射器#2中。拆下注射器#1，同时保持连接头仍与注射器#2相连。</li>
	<li>将一个可拆卸针头（26号）连接至另一个100 µl洁净注射器（注射器#3），并从中吸取约70 µl的沉淀剂溶液。每种目标膜蛋白（MP）诱导形成高密度微晶的沉淀剂溶液组成均不相同，应在进行本方案前确定。此处使用已优化的沉淀剂溶液组成，可获得大量A2A受体微晶（40 mM硫氰酸钠，100 mM柠檬酸钠，pH 5，26–28% PEG400）。</li>
	<li>将针头从注射器#3上拆下，同时保持聚四氟乙烯（Teflon）卡套保留在注射器内。</li>
	<li>通过连接头将注射器#2和#3连接，确保两个注射器内的聚四氟乙烯卡套均正确就位。小心地将连接头完全拧紧。</li>
	<li>将连接好的注射器垂直放置，注射器#2位于下方，缓慢而稳定地将注射器#2中含蛋白的LCP样品注入注射器#3，直至LCP细丝接触注射器#3的推杆。注入的LCP体积约为注射器#3中初始沉淀剂体积的1/10（约7 µl）。通过两个注射器上的刻度读数确认体积（两个推杆均应移动约7 µl）。</li>
	<li>拆下注射器#2。此时连接头仅与含有样品并浸没于沉淀剂溶液中的注射器#3相连。</li>
	<li>使用Parafilm完全密封注射器#3，包括推杆与注射器接口处、连接头的开口端以及针头螺母。此步骤中密封不完全可能导致沉淀条件改变，样品脱水。</li>
	<li>重复步骤3.3–3.7，在另外6个注射器（#4–#9）中设置结晶实验，共使用约50 µl的LCP样品（每个注射器约7 µl LCP）。</li>
	<li>将密封好的注射器放入可密封的塑料袋中，并在袋内放置一至两张预先用纯水浸湿且无纤维的清洁纸巾，以防止样品脱水。密封塑料袋后，将注射器置于20 °C培养箱中进行晶体生长。</li>
</ol>
4. 晶体检测
<ol>
	<li>每12-24小时将注射器从培养箱中取出，在体视显微镜下使用交叉偏振光直接观察注射器内的LCP样品（#3-#9），识别晶体：晶体表现为紧密堆积的闪亮颗粒，若晶体尺寸较小，则表现为LCP丝中均匀的发光。</li>
	<li>将密封的注射器放回袋中，并于20 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>
5. 使用 7.9 MAG 进行样本合并与滴定
注意：此处所述的脂质滴定步骤具有两个目的：a）吸收过量的沉淀剂溶液，以及 b）防止样品注入XFEL光束时发生脂质冻结。当由9.9 MAG组成的LCP样品被注入真空腔进行数据采集时，剧烈的蒸发可能导致样品冷却至平衡相变温度以下（约18 °C），从而使部分样品转变为层状结晶相（Lc）。当Lc相区域受到光束照射时，会产生强烈的粉末衍射环，可能损坏灵敏的探测器6，例如康奈尔-斯坦福直线加速器中心像素阵列探测器（CSPAD）。通过向9.9单烷酰甘油（MAG）样品中滴加较短链长的脂质（如9.7 MAG或7.9 MAG），可缓解此问题，因为此类混合物具有较低的相变温度。本文描述了以7.9 MAG对由9.9 MAG组成的脂质立方相（LCP）进行滴定的过程。当使用较短链长的MAG（9.7 MAG、7.9 MAG、 等等。) 用于结晶或在常压下收集序列晶体学数据时，步骤 5.11 中的滴定仍然必需，但可使用最初用于结晶的 LCP 宿主脂质进行。
<ol>
	<li>在开始数据收集前约1小时，从20 °C培养箱中取出装有样品的注射器。</li>
	<li>根据晶体外观和结晶条件的相似性，选择2至4个注射器用于样品合并。</li>
	<li>小心移除所选注射器上的Parafilm密封膜。</li>
	<li>取下注射器连接头，并将一根洁净的可拆卸针头（26号）连接到第一个选定的注射器上。轻轻缓慢推动推杆，使沉淀剂通过针头挤出至微量离心管中。此步骤需格外小心，因为若推杆施加压力过大，可能导致部分含晶体的LCP随沉淀剂溶液一起喷出，造成样品部分或完全损失。</li>
	<li>当大部分沉淀剂已被移除且LCP已在针头入口处聚集时，停止推动推杆。</li>
	<li>对其他选定的注射器重复步骤5.4–5.5。</li>
	<li>为合并所得的LCP样品，通过一个洁净的连接头将两个注射器连接在一起。</li>
	<li>按压其中一个注射器的推杆，将整个样品从一个注射器转移至另一个注射器中。</li>
	<li>断开空注射器。</li>
	<li>重复步骤5.7–5.9，将预先选定的2至4个注射器中的所有含晶体LCP材料合并至一个注射器中。尽可能去除多余的沉淀剂。</li>
	<li>向一个空注射器中加入约5 µl的7.9 MAG或原始的短链MAG宿主脂质。通过注射器连接头将该注射器与含有合并样品的注射器相连，交替按压两个注射器的推杆进行混合。重复此操作，直至所有残留溶液被吸收，并形成均一透明的LCP。滴定后的最终LCP体积可能因过量沉淀剂的体积及其组成不同而介于20至35 µl&#160;之间。</li>
	<li>将全部混合后的LCP样品转移至一个注射器中，并断开空注射器。</li>
</ol>
6. 微晶的表征
<ol>
	<li>将LCP-注射器装样针（3型针尖，22号，长度1英寸）连接到装有整合样品的注射器上。</li>
	<li>在玻璃载玻片上小心推出约 1 µl 的 LCP 样品，盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，使样品被夹在中间。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用明场照明和交叉偏振器，以尽可能高的放大倍数（通常为100倍）拍摄LCP样品的图像。如条件允许，另使用紫外荧光显微镜和SONICC（手性晶体的二阶非线性成像）进行额外成像。17 使用成像仪确认样品中蛋白质微晶的存在。</li>
	<li>估算晶体大小和密度10理想的数据收集实验晶体密度取决于晶体大小、X射线束直径以及LCP射流直径，且应使晶体命中率达到约10-40%。</li>
</ol>
7. 晶体密度的调整
注意：如果在步骤6.4中发现晶体密度过高，导致多重晶体命中比例较大，则应按照下述步骤稀释晶体，以优化样品用于数据收集。如果所有制备样品中的晶体密度过低，无法有效进行数据收集，则应重新优化晶体生长条件，因为目前尚无可靠方法可在LCP中浓缩膜蛋白（MP）晶体。
<ol>
	<li>通过模拟含有待稀释晶体的原始样品的LCP组成（相同的脂质和沉淀剂），制备用于稀释的所需量的纯净LCP。</li>
	<li>将所有纯净LCP转移至一支注射器中。取下空注射器，但保留连接器。</li>
	<li>取下含有微晶LCP样品的注射器上的针头，通过连接器将样品注射器与装有纯净LCP的注射器连接。</li>
	<li>通过连接器来回推动注射器内容物，直至混合均匀。</li>
	<li>重复第6节操作，重新评估调整后样品中的微晶密度。</li>
</ol>
8. LCP喷注器装载及LCP-SFX数据收集
<ol>
	<li>将连接样品的耦合器从注射器上拆下，并在注射器上安装一根1&#34;的上样针。</li>
	<li>将20–40 µl样品转移至LCP注射器的储液池中。</li>
	<li>将LCP注射器插入样品室18，启动注射器，调节流速并采集LCP-SFX数据。</li>
</ol>
9. 可溶性蛋白质晶体在LCP中的结合
注意：在序列晶体学实验中，使用高黏性介质（如LCP）输送可溶性蛋白质晶体，可显著减少蛋白质的消耗量。在这些步骤中，我们描述了如何将可溶性蛋白质晶体包埋于LCP中。晶体可通过任意技术获得，汇集形成晶体悬液，必要时进行过滤。
<ol>
	<li>调整悬液中晶体的密度，以确保晶体命中率在约10%-40%之间。</li>
	<li>使用7.9 MAG、9.7 MAG或7.9 MAG与9.9 MAG的1:1混合物作为宿主脂质，测试沉淀剂溶液与LCP的相容性。</li>
	<li>使用注射器混合器将约25 µl晶体悬液与约25 µl宿主脂质混合，直至形成均匀的LCP。</li>
	<li>按照第6节所述评估晶体大小和密度。将样品装入LCP注射器，并按照第8节所述收集数据。</li>
</ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案为使用LCP注射器进行标准LCP-SFX实验的样品制备流程提供了总体概述。根据我们的经验，收集完整数据集所需的最终含微晶LCP样品总量通常为50–100 µl（表1；初始含蛋白LCP样品为25–50 µl），具体用量取决于微晶的尺寸、质量和密度。由于每支100 µl气密玻璃注射器最多可容纳约7 µl LCP，且需以完全伸展的细丝状形式存在，以确保沉淀剂溶液在LCP中充分且均匀地扩散，因此每次LCP-SFX实验应至少准备四至七份注射器样品。
由于样品需通过直径为20-50 µm的狭窄毛细管挤出，因此必须避免样品中混入任何外来颗粒物质。在LCP样品或沉淀剂溶液中可能偶然引入的灰尘和纤维会堵塞注射器毛细管，增加实验过程中的停机时间。因此，在制备样品前，必须通过孔径为5 µm的滤膜对脂质及所有溶液进行过滤。必要时，可使用洁净室或便携式洁净工作台进行样品制备。
这些实验方案基于使用9.9 MAG（单油精）作为膜蛋白（MP）结晶的宿主脂质。然而，这些方案并不局限于9.9 MAG，只要考虑不同脂质相行为的差异，便可轻松适配于其他任何LCP宿主脂质或脂质混合物。大多数在LCP中结晶获得的膜蛋白结构均使用了某种MAG，其中9.9 MAG至今仍是成功率最高的代表15。使用9.9 MAG进行SFX实验的主要缺点是，当温度降至18 °C以下时，它会转变为层状晶体相，这种情况在真空条件下采集数据时常会发生。本方案第5节中所述的7.9 MAG滴定法为此问题提供了良好的解决方案。根据我们的经验，晶体在该滴定过程中可保持完好，无任何不利影响。然而，如果添加7.9 MAG或其他短链MAG不可行，则也可使用9.9 MAG进行滴定。在此情况下，注射LCP进入真空环境时用于稳定流动的气体应从氦气更换为氮气，这可在大多数样品中防止结晶脂质相的形成，但代价是样品流的稳定性有所降低。
LCP 的凝胶状稠度作为晶体载体介质具有显著优势，因为它可以在很宽的范围内调节晶体流速，适用于在现代 X 射线自由电子激光（XFEL）和同步辐射光源上进行序列晶体学数据收集。将晶体流速与 XFEL 脉冲重复频率相匹配，可使晶体消耗量相比液体注射降低数个数量级。LCP 不仅适用于在其内部生长的膜蛋白（MP）晶体的输送，也适用于可溶性蛋白质晶体的输送21。近年来已陆续推出几种替代性的高黏性晶体载体介质22-24，进一步丰富了开展序列晶体学实验所用的工具与试剂库。此外，即使在传统同步辐射光源上，以 LCP 作为晶体输送介质的序列晶体学也已得到验证，至少对于衍射质量良好的晶体是可行的24,25。未来同步辐射光源的升级将使 X 射线强度提升数个数量级，加之探测器技术的进步，将使序列晶体学成为一种更加普及且具有吸引力的结构解析方法。
LCP-SFX 已展现出在膜蛋白结构解析中的强大能力。对于难以生长出大尺寸、可衍射晶体的复杂生物体系（如 G 蛋白偶联受体或大分子复合物），LCP-SFX 可能提供一种极具吸引力、甚至唯一可行的原子分辨率结构解析方案。尽管具有诸多优势， 即，使用LCP作为膜蛋白结晶和晶体递送的基质，蛋白质消耗量低，无辐射损伤，可在室温下收集数据，可进行时间分辨研究26,27 且无需晶体收获步骤，LCP-SFX 应在未来结构生物学中发挥重要作用。

X射线晶体学是迄今为止解析膜蛋白（MPs）原子分辨率结构最成功的技术。从脂质介相中结晶，也称为脂质立方相（LCP）结晶，或in meso结晶，是膜蛋白晶体学领域的一项重要进展，使得诸如G蛋白偶联受体（GPCRs）等具有挑战性的靶标能够实现高分辨率结构解析1。近年来LCP相关工具与技术的进步，已使该技术在全球范围内的结构生物学研究群体中得到广泛应用2。然而，在许多情况下，LCP中形成的膜蛋白晶体过小，即使在最先进的微聚焦同步辐射光束线上也难以使用，因为样品在获得足够高分辨率信号之前，便已遭受严重的辐射损伤和降解3。
一种新的晶体学数据收集方法随着首台X射线自由电子激光器（XFEL）的投入使用而得以实现。该方法基于以下原理： &#34;损毁前衍射&#34;，最初在理论上提出4 然后在直线加速器相干光源（LCLS）的生物样品上通过实验验证3，全球硬X射线自由电子激光（XFEL）领域的先驱。XFEL可产生高亮度、持续时间仅为数十飞秒的X射线脉冲，能够在蛋白质原子因辐射损伤而发生位移之前，从完好的晶体上获得衍射信号。在早期实验中，微晶通过液体喷射器产生的水相流持续输送至XFEL光束的交汇点5该实验装置被称为序列飞秒晶体学（SFX）。使用液体喷射器进行SFX的主要缺点是其高流速，因此需要数十至数百毫克的纯化蛋白才能收集一套完整的数据集。通过采用一种能够处理凝胶状LCP样品的特殊喷射器（LCP微挤出喷射器）6我们成功输送了在LCP基质中生长的多种不同人源GPCR微晶，并获得了它们的高分辨率结构6-9，蛋白质消耗量显著降低，每个数据集的用量减少至0.3 mg以下。该喷注器由一个可容纳20、40或100 µl含晶体LCP样品的储液池组成，样品通过一个直径为10–50 µm的细毛细管，在液压活塞施加的高压（最高达10,000 psi）作用下被挤出；该液压活塞配备压力放大装置，由高效液相色谱（HPLC）泵提供的液体驱动。从毛细管喷嘴流出的LCP液流由一股平行的非反应性气体（通常为氦气或氮气）稳定。
本文提供了制备和表征LCP-SFX实验样品所需步骤的可视化演示。更多细节可参见已发表的实验方案10。以腺苷A2A受体11为例，我们将制备该蛋白在LCP中的晶体，并用于SFX方法的X射线数据收集。尽管我们的实验流程适用于任何能够在XFEL和同步辐射光源下进行序列晶体学数据采集的LCP注射装置，但为便于说明，本文将采用参考文献6中描述的LCP注射器。在开始本实验流程前，应通过高通量结晶筛选12,13确定可产生高密度微晶的优化沉淀条件。本实验流程的典型流程图见图1。

<table><tbody><tr><td>LCP 宿主脂质单油酸甘油酯（9.9 MAG）</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>用于待结晶蛋白的宿主脂质</td></tr><tr><td>LCP 宿主脂质单油酸甘油酯（9.9 MAG）</td><td>Sigma</td><td>M7765&amp;nbsp;</td><td>用于待结晶蛋白的宿主脂质</td></tr><tr><td>LCP 宿主脂质单棕榈油酸甘油酯（9.7 MAG）</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>用于待结晶蛋白的宿主脂质</td></tr><tr><td>LCP 宿主脂质 7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>用于滴定以避免样品注入过程中形成层状晶体相（Lc）</td></tr><tr><td>纯化蛋白溶液，浓缩至 20–50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>目标蛋白</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>用于溶解脂质</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>用于清洗注射器</td></tr><tr><td>11 支 100 &amp;#956;l Hamilton 气密式注射器（无针头）</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>用于 LCP 制备</td></tr><tr><td>8 个注射器连接器</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>用于 LCP 制备</td></tr><tr><td>LCP 注射器装样针头</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 point style 3, length 1 inch</td><td>用于 LCP 分配和注射器装样</td></tr><tr><td>可拆卸针头</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>用于移除沉淀剂溶液</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>用于注射器密封</td></tr><tr><td>无尘镜头清洁纸巾</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>离心滤膜管，Ultrafree-MC，0.5 ml，Durapore 5 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>用于过滤沉淀剂溶液和脂质</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，1 英寸 × 3 英寸&amp;nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>两个带细口的冲洗瓶。一个装有 milli-Q 水或蒸馏水，另一个装有甲醇</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>用于清洗注射器、针头和连接器。&amp;nbsp; 先用甲醇，再用水。</td></tr><tr><td>手套</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>用于吹干注射器、针头、套管和连接器</td></tr><tr><td>护目镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加压空气罐</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>用于清洗注射器</td></tr><tr><td>带数字温度控制器的干式恒温加热器</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&amp;nbsp;</td><td>用于融化脂质</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>用于离心沉淀溶液</td></tr><tr><td>洁净室小型正压罩 - 12 英寸便携式，带 HEPA 滤膜</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>用于样品制备过程中的清洁</td></tr><tr><td>配备线性偏振片和旋转分析器的体视变倍显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>用于晶体密度检测</td></tr><tr><td>紫外显微镜</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>可选，用于晶体成像</td></tr><tr><td>SHG 成像仪</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>可选，用于晶体成像</td></tr></tbody></table>

用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

膜蛋白（MPs）是细胞膜的重要组成成分，也是主要的药物靶点。合理药物设计依赖于精确的结构信息，这些信息通常通过晶体学方法获得；然而膜蛋白难以结晶。近年来，膜蛋白结构解析的进展在很大程度上得益于立方相脂质（LCP）结晶技术的发展，该方法通常可获得衍射质量良好但尺寸较小的晶体，而这些微小晶体在同步辐射光源进行传统晶体学数据收集时容易受到辐射损伤。新一代X射线自由电子激光（XFEL）光源的出现，能够产生极亮的飞秒脉冲，使得在室温下对微晶进行数据收集成为可能，且几乎不产生辐射损伤。我们近期将LCP技术与序列飞秒晶体学（LCP-SFX）相结合的研究工作，成功解析了多种人源G蛋白偶联受体的高分辨率结构，而这类受体一直是结构解析领域中极具挑战性的目标。在LCP-SFX技术中，LCP既作为膜蛋白微晶生长的基质，也用于将微晶输送至注射流与XFEL光束的交汇点，以进行晶体学数据收集。已有研究表明，当仅有尺寸小于10 µm的晶体可用时，或在室温下使用较小晶体可克服较大冷冻晶体所伴随的各种问题（如缺陷积累、高镶嵌性及冷冻假象）时，LCP-SFX可显著提高衍射分辨率。未来X射线光源和探测器技术的进步，有望使序列晶体学不仅在XFEL设施中具有高度吸引力和可行性，也能在更易获取的同步辐射光束线上广泛应用。本文提供了用于序列晶体学实验的LCP中微晶制备、表征与输送的详细可视化操作流程，包括在注射器中进行结晶实验的方法、晶体样品的检测与表征、晶体密度优化、将含微晶的LCP装入注射装置，以及将样品输送至光束进行数据收集等步骤。

以下是我们采用上述方案制备样品所获得的代表性结果，这些结果使我们能够收集SFX数据，并解析出五种人源G蛋白偶联受体（GPCR）的高分辨率结构：5-羟色胺受体5-HT2B与激动剂麦角胺复合物8（PDB编号4NC3）、平滑受体（SMO）与拮抗剂环巴胺复合物6（PDB编号4O9R）、δ-阿片受体与双功能肽配体DIPP-NH2复合物7（PDB编号4RWD）、血管紧张素受体与阻断剂ZD7155复合物9（PDB编号4YAY），以及视紫红质与阻遏蛋白复合物19（PDB编号4ZWJ）；此外还包括两种测试用可溶性蛋白：溶菌酶（PDB编号4ZIX）和藻蓝蛋白（PDB编号4ZIZ）。
5-HT2B 介导神经递质5-羟色胺的多种中枢和外周生理功能。该受体被用于建立并验证LCP-SFX方法，通过比较在LCLS获得的室温结构与在先进光子源（APS）通过传统微晶晶体学解析的低温冷冻结构。共制备并使用了约100 µl含有蛋白质微晶（平均尺寸约为5 µm）的LCP样品进行SFX数据收集，成功解析了5HT2B的LCP-SFX结构，分辨率达到2.8 Å（图2）8。有关样品制备和数据收集的更多有用细节见表1。
平滑受体（SMO）属于F类G蛋白偶联受体（GPCR），是致畸剂环杷明（cyclopamine）的分子靶点，在胚胎发育和肿瘤生长中具有明确的功能。最初获得了平均尺寸为120×10×5 µm的较大SMO/环杷明晶体，并利用同步辐射光源结合传统的基于测角仪的晶体学方法进行数据收集。然而，这些大尺寸晶体在微聚焦光束线（直径10 µm）上衍射质量较差，且存在较大的镶嵌度（超过2–3度），这可能是由于晶体生长缺陷的积累，或与低温冷冻过程相关效应所致。然而，利用LCP-SFX技术，我们能够在室温条件下从5 µm大小的晶体中于LCLS获得高质量的衍射数据。该结构通过分子置换法解析，沿三个主轴的各向异性分辨率达到3.4、3.2和4.0 Å，清晰地确定了环杷明在结合口袋中的位置6（图3）。
以 µ-阿片受体（µ-OR）为靶点的生物碱类阿片药物（如吗啡）广泛用于重度疼痛管理。然而，其长期使用会导致耐受性和成瘾性。研究表明，将吗啡与 δ-阿片受体（δ-OR）拮抗剂联合使用，可防止上述副作用的发生，从而推动了兼具 δ-OR 拮抗活性和 µ-OR 激动活性的化合物的探索。我们最初利用低温冷冻晶体，在同步辐射X射线源上采用传统的基于测角仪的数据收集策略，获得了δ-OR与双功能四肽DIPP-NH2复合物的衍射数据，分辨率达到3.3 Å。这些数据中肽配体的电子密度部分模糊不清。随后，我们在室温下利用X射线自由电子激光（XFEL）获得了衍射数据，并解析出分辨率为2.7 Å的结构，清晰地显示了配体与受体的电子密度7。该结构为深入理解阿片受体的功能与选择性提供了契机，也为新型镇痛药的开发提供了重要启示。
血管紧张素II 1型受体（AT1R）是一种G蛋白偶联受体（GPCR），在血压调节中起主要作用。我们利用LCP（脂立方相）法将AT1R与拮抗剂ZD7155形成复合物并进行结晶。优化后的晶体最大尺寸达到40×4×4 µm3，在同步辐射光源下获得的最佳衍射分辨率仅为约4 Å。通过改变结晶条件，我们获得了大量较小的晶体（10×2×2 µm3），并利用X射线自由电子激光（XFEL）辐射在室温下解析出分辨率为2.9 Å的结构。总共收集了2,764,739张探测器图像，数据集来源于约65 µl含晶体的LCP，对应约0.29 mg蛋白9。在所有采集的图像帧中，有457,275帧被识别为晶体衍射信号，命中率为17%；其中73,130帧（占命中信号的16%）成功完成指标化与积分。
G蛋白偶联受体（GPCR）通过两条主要通路进行信号转导，分别由G蛋白或arrestin介导。几年前，人们解析了β2-肾上腺素能受体与异源三聚体Gs蛋白结合状态的结构20，而GPCR与arrestin复合物的结构却一直难以获得。我们通过脂质立方相（LCP）获得了视紫红质-arrestin融合蛋白的微小晶体，其最长尺寸仅为25–30 µm，尽管进行了大量优化，但在同步辐射光源下衍射分辨率仅达到约7 Å。采用LCP-SFX方法，在12小时的X射线自由电子激光（XFEL）机时内，我们收集到22,262个晶体衍射信号，其中18,874张图谱成功完成指标化和积分，各向异性分辨率极限达到3.8 Å / 3.8 Å / 3.3 Å19。视紫红质-arrestin是一个极具挑战性的蛋白复合物，传统方法始终无法解析其结构。该结构的成功解析充分展示了LCP-SFX方法在解决难题方面的巨大潜力，也为深入研究GPCR中arrestin偏向性信号转导机制提供了独特机会。
最后，除了在脂相中生长的膜蛋白晶体外，我们的样品制备和递送方法还成功应用于可溶性蛋白晶体，其中使用LCP作为晶体递送的载体介质，使我们能够显著降低结构测定所需的蛋白质用量。利用该方法，仅使用每种蛋白质不足0.1 mg的样品，即分别以1.89 Å和1.75 Å的分辨率解析了两种模型蛋白——溶菌酶和藻蓝蛋白的结构21。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5-羟色胺受体2B</td>
			<td>Smoothened受体</td>
			<td>δ-阿片受体</td>
			<td>血管紧张素II受体1型</td>
			<td>视紫红质-阻遏蛋白</td>
			<td>溶菌酶</td>
			<td>藻蓝蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDB ID</td>
			<td>4NC3</td>
			<td>4O9R</td>
			<td>4RWD</td>
			<td>4YAY</td>
			<td>4ZWJ</td>
			<td>4ZIX</td>
			<td>4ZIZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>使用的总样本量*，μl</td>
			<td>100</td>
			<td>83</td>
			<td>50</td>
			<td>65</td>
			<td>75</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>使用的总蛋白量，μg</td>
			<td>300</td>
			<td>500</td>
			<td>300</td>
			<td>290</td>
			<td>340</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均晶体尺寸，μm</td>
			<td>5×5×5</td>
			<td>&lt;5</td>
			<td>5×2×2</td>
			<td>10×2×2</td>
			<td>5-10</td>
			<td>5×2×2</td>
			<td>10×10×5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>命中率，%</td>
			<td>3.6</td>
			<td>7.8</td>
			<td>5.9</td>
			<td>17</td>
			<td>0.45</td>
			<td>40</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总数据收集时间，hr</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
			<td>4.6</td>
			<td>6.4</td>
			<td>12</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>索引化图谱数量</td>
			<td>32,819</td>
			<td>61,964</td>
			<td>36,083 </td>
			<td>73,130</td>
			<td>18,874</td>
			<td>54,544</td>
			<td>6,629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空间群</td>
			<td>C 2 2 21</td>
			<td>P 21</td>
			<td>C 2</td>
			<td>C 2 </td>
			<td>P 21 21 21</td>
			<td>P 43 21 2</td>
			<td>H 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率，Å</td>
			<td>2.8</td>
			<td>3.2 / 3.4 / 4.0</td>
			<td>2.7</td>
			<td>2.9</td>
			<td>3.3 / 3.8 / 3.8</td>
			<td>1.89</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*脂质滴定后
表1. 使用LCP-SFX方法解析的代表性结构的样品制备与数据收集统计摘要。
进行LCP-SFX实验所需的样品量取决于晶体衍射质量、晶体密度、注射器喷嘴直径，以及XFEL光束尺寸、强度和脉冲重复频率。
<img alt="蛋白质结晶流程图；步骤包括LCP重构、晶体检测、SFX数据采集。" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. LCP-SFX典型样品制备流程图。 样品制备始于在密封玻璃注射器中进行目标蛋白的LCP结晶。获得晶体后，将含晶体的LCP合并至一支注射器中，并滴加额外脂质以吸收过量沉淀剂溶液。在进行XFEL数据采集前，需使用多种显微镜技术对晶体进行表征。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结晶对比；光学显微镜与分子结构，50μm比例尺。" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 一个代表性结果：5-HT2B 与麦角胺形成复合物的结构。(a) 使用明场显微镜模式拍摄的5-HT2B/麦角胺微晶图像8。本图已从参考文献8重用，经Science版权许可。(b) 使用交叉偏振显微镜模式拍摄的5-HT2B/麦角胺微晶图像8。本图已从参考文献8重用，经Science版权许可。(c) 通过LCP-SFX方法获得的5-HT2B/麦角胺结构的卡通表示图。模型中构建的脂质以棍状表示，配体麦角胺以球状表示。实线表示近似的膜边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构比较与荧光显微镜、生物分子分析、结构可视化。" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 代表性结果：SMO与环杷明复合物的结构。 左图：使用交叉偏振显微镜模式拍摄的SMO/环杷明微晶图像6。该图已获Nature Communications版权许可，引自参考文献6。右图：通过LCP-SFX方法获得的SMO/环杷明结构的卡通表示图。配体环杷明以球状模型显示。实线表示近似的膜边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们描述了用于在X射线自由电子激光器和同步辐射光源上进行序列晶体学实验的脂质立方相中膜蛋白微晶的制备与递送方法。这些方案也可应用于可溶性蛋白微晶的包埋与递送，与液体注射相比，可显著减少样品消耗。

膜蛋白（MPs）是细胞膜的重要组成成分，也是主要的药物靶点。合理药物设计依赖于精确的结构信息……

本实验的总体目标是制备用于在同步辐射和自由电子激光X射线源上进行序列晶体学数据收集的膜蛋白晶体脂立方相样品。该方法有助于解答膜蛋白结构生物学领域中的关键问题，例如跨膜运输和信号转导。该技术的主要优势在于，可在室温下以天然脂质环境中实现膜蛋白的结构解析，同时样品消耗极低，并且辐射损伤可忽略不计。初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为脂质立方相是一种黏稠的凝胶状物质，若无特殊工具和先前经验则难以操作。按照文字版实验方案所述，使用一号和二号注射器，从膜蛋白在脂质立方相（Lipidic Cubic Phase，LCP）中的重组开始本实验操作。待形成透明且均匀的LCP后，将全部样品转移至二号注射器中。保持连接器与二号注射器相连的同时，取下一号注射器。将可拆卸针头连接至另一个100微升洁净注射器（称为三号注射器）。吸取约70微升沉淀剂溶液至其中。将针头从3号注射器上取下，同时保持聚四氟乙烯小球保留在注射器内。通过连接器将2号和3号注射器连接，确保两个注射器内的聚四氟乙烯小球位置正确。小心地将连接器完全拧紧到位。将耦合的注射器垂直放置，二号注射器在下方，然后缓慢而稳定地将二号注射器中含蛋白的LCP样品注入三号注射器，直至LCP细丝接触三号注射器的推杆。注入的LCP体积约为三号注射器中初始沉淀剂体积的1/10。通过两个注射器上的刻度读数确认体积。然后，断开第二注射器。此时，连接器仅与第三注射器相连，该注射器内含有浸没在沉淀剂溶液中的样品。使用Parafilm将第三注射器完全密封，包括推杆与注射器的接口处、连接器的开口端以及针头螺母处。此步骤中密封不完全可能导致沉淀条件改变以及样品脱水。重复蛋白负载的LCP样品注射步骤，在另外六个注射器中设置结晶，共使用约50 µL的LCP样品。将密封的注射器存放在塑料密封袋中，并放入一至两张预先用纯水浸湿且无纤维的清洁纸巾，以防止样品脱水。密封袋子，并将注射器置于20°C的培养箱中，用于晶体生长。为检测晶体，每隔12至24小时将注射器从培养箱中取出，在体视显微镜下使用交叉偏振光直接观察注射器内的LCP样品。晶体可被识别为紧密排列的闪亮颗粒；若晶体较小，则表现为LCP细丝中均匀的发光现象。将密封的注射器放回袋中，并于20摄氏度保存以备后续使用。脂质滴定步骤是必要的，用于吸收过量的沉淀剂溶液，并防止样品在注入X射线自由电子激光束时发生脂质冻结。在开始数据采集前约一小时，从20摄氏度培养箱中取出装有样品的注射器。根据晶体外观和结晶条件的相似性，选择两到四个注射器用于样品合并。小心移除所选注射器上的Parafilm封口膜。取下注射器连接器，并将洁净的可拆卸针头连接至第一个选定的注射器上。轻轻缓慢推动柱塞，使沉淀剂通过针头挤出至微量离心管中。此步骤需格外小心，因为对柱塞施加过大的压力可能导致部分含晶体的LCP与沉淀剂溶液一同喷出，造成样品部分或完全损失。当大部分沉淀剂已被移除且LCP已在针头入口处积聚时，停止推动柱塞。对其他选定的注射器重复此操作。为合并所得的LCP样品，通过一个洁净的连接器将两个注射器连接在一起。按下一个注射器的推杆，将其中一个注射器中的全部样品转移至另一个注射器中。取下空的注射器。重复此步骤，将所有含晶体的LCP材料合并至一支注射器中。尽可能去除沉淀剂。向一支空注射器中加入约五微升7.9 MAG或原始的短链MAG宿主脂质。通过注射器连接头将该注射器与装有合并样品的注射器相连，交替推动两个注射器的推杆进行混合。重复此操作，直至所有残留溶液完全吸收，形成均一透明的脂立方相（LCP）。将混合后的LCP样品全部转移至一支注射器中，并取下空的注射器。将LCP注射器装样针连接至装有合并样品的注射器上。小心地将约一微升LCP样品挤出至载玻片上，并用盖玻片覆盖。轻轻按压盖玻片以夹紧样品。使用体视显微镜，在尽可能高的放大倍数下，结合明场照明和交叉偏振器对LCP样品进行成像。如条件允许，进一步使用紫外荧光显微镜及成像系统拍摄图像，以确认样品中是否存在蛋白质微晶。估算晶体大小和密度。用于数据收集实验的理想晶体密度取决于晶体尺寸、X射线束直径以及LCP射流的直径，且应使晶体命中率达到约10%至40%。最后，装载LCP注射器，并按照文本方案所述进行LCP串行飞秒晶体学（LCP SFX）数据收集。图中显示的是5-羟色胺受体与麦角胺复合物的微晶，分别采用明场显微模式和交叉偏振光显微模式成像。通过LCP SFX方法获得了血清素受体与麦角胺复合物的结构。图中显示的是与环杷明形成复合物的平滑素受体微晶，采用交叉偏振显微镜模式成像。该受体与环杷明复合物的结构亦通过LCP SFX方法获得。一旦掌握，若操作得当，该实验流程可在两小时内完成。尽管该方法主要用于研究膜蛋白靶标的结构，但经过轻微修改后，也可应用于其他蛋白质。该技术的应用前景涵盖药物发现领域；因为高分辨率结构可为标准木脂素类蛋白质相互作用提供优良的模板，并有助于设计出更高效的药物。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内...

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

本文介绍了一种用于可控生产蛋白质微晶的实验方案。该过程采用自动化设备，可对多个结晶参数进行精确调控。通过在监测结晶液滴中颗粒半径分布的同时，进行受控且自动化的结晶溶液添加，从而实现蛋白质结晶。...

使用自动化结晶技术培养具有不同尺寸的蛋白质晶体 原位 动态光散射

本方案详细描述了在室温下用于X射线衍射数据收集的微流控器件的制备与操作方法。此外，还介绍了如何通过动态光散射监测蛋白质结晶过程，以及如何处理和分析所获得的衍射数据。...

微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射

时间分辨序列飞秒晶体学实验的成功依赖于高效的样品递送。本文介绍了优化从高黏度微挤出注射器中挤出紫膜蛋白微晶的实验方案。该方法依赖于使用一种新型三通耦合器对样品进行均质化处理，并通过高速相机实现可视化观察。...

提高高粘度微晶挤出效率以用于X射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

本实验方案的目的是演示如何制备用于在澳大利亚同步加速器新近投入使用的高粘性喷射器Lipidico上进行数据采集的序列晶体学样品。...

澳大利亚同步辐射光源上用于序列晶体学测量的脂质注射方案

本文的目的是使读者充分理解如何将小体积蒸气扩散法用于生长大尺寸单晶蛋白晶体的实验方案，转变为适用于序列晶体学的大体积批量微晶结晶方法。...

优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

本方案介绍了一种利用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件及晶体生长的简便方法。同时展示了使用透析管进行微晶大规模生长，适用于序列晶体学和微晶电子衍射（MicroED）应用。...

高通量蛋白质结晶的微透析方法 via Microdialysis

本方案描述了一种用于甾醇转运蛋白ABCG5/G8结晶的实验设置。将ABCG5/G8重组到双层脂质盘（bicelles）中，用于悬滴法结晶。该方案无需特殊材料或底物，因此可在任何实验室中便捷地采用和调整，以通过X射线晶体学方法测定蛋白质结构。...

ABCG5/G8 在脂质双层胶束环境中的X射线晶体学结晶

学习在脂质立方相中制备膜蛋白微晶的方法，用于同步辐射和X射线自由电子激光的串行晶体学数据采集。该技术可在室温下以极少样品消耗测定膜蛋白结构，显著降低辐射损伤风险。

用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

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