Name: 高通量，矿化组织的多图像Cryohistology (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习高通量冷冻组织学技术用于矿化组织的多轮荧光成像分析。该方法实现观察者独立的全数字化处理，帮助骨骼肌肉生物学研究者高效关联多种分子信号与特定细胞。

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作者谨此致谢以下资助来源：NIH R01-AR063702、R21-AR064941、K99-AR067283 和 T90-DE021989。

康涅狄格大学健康中心机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验操作。
1. 固定与包埋
<ol>
	<li>通过 CO2 窒息或其他经批准的方法处死动物。</li>
	<li>取下目标组织（例如，肢体、椎骨等），并置于 4 °C 的 10% 中性缓冲甲醛溶液中，直至充分固定。在固定前需特别注意保持一致的解剖位置。例如，固定肢体时应使关节保持一致的屈曲、内旋和外旋角度11。通常，完整的小鼠肢体固定时间为 1 - 3 天。 
	警告：甲醛具有毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。 
	注意：固定时间取决于样本大小。若实验条件允许，切开骨组织有助于骨髓腔的充分固定。某些样本可能需要灌注固定15，以减少荧光背景（例如，骨髓内的微弱荧光信号）。</li>
	<li>将样本从甲醛溶液转移至用 1× PBS 配制的 30% 蔗糖溶液中，于 4 °C 孵育 12 - 24 小时。 
	注意：孵育 12 - 24 小时后，可将样本置于 -80 °C 长期保存。此保存方法适用于研究人员计划将多个样本包埋于同一蜡块中，但无法同时获取所有样本的实验（例如，包含多个时间点的实验）。</li>
	<li>从蔗糖溶液中取出样本，并剔除多余组织。</li>
	<li>取一个冷冻模具（模具尺寸根据样本大小选择），部分填充冷冻包埋介质。将样本放入模具中，使目标区域的切面与模具底部平行。 
	注意：具体的组织放置与方向示例见 图 2A - B。</li>
	<li>将冷冻模具置于干冰上，待包埋介质表面形成一层薄薄的冻结层，从而固定样本位置。随后，在保持模具始终处于干冰上的同时，填充剩余的冷冻包埋介质。</li>
	<li>将冷冻模具放入装有经干冰预冷的 2-甲基丁烷的容器中。待样本完全冻结后，取出模具并抖掉多余的 2-甲基丁烷。用玻璃纸包裹模具，置于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中保存。 
	注意：样本在冷冻包埋介质中长期储存时可能发生干燥，尤其是在 -20 °C 条件下。建议将样本在 -80 °C 下保存于冷冻包埋介质中超过 1 - 2 个月，或保存于 -80 °C 的 30% 蔗糖溶液中（见步骤 1.3）。</li>
</ol>
2. 胶带稳定的组织切片
<ol>
	<li>从冰箱中取出样本块，并放入冷冻切片机中，将温度设定在 -20 至 -25 °C 之间。</li>
	<li>将样本块从冷冻模具中取出，用剃刀片修去多余的冷冻包埋介质。</li>
	<li>在样本托盘上放置少量冷冻包埋介质，然后调整样本块的位置，使样本托盘表面与样本块底面平行，从而确定目标区域的正确切面。</li>
	<li>将样本托盘放入冷冻切片机中，使冷冻包埋介质完全冻结。</li>
	<li>将样本托盘安装到样本头，调节样本头，使刀片切割方向与样本块表面平行。</li>
	<li>将样本块修切至目标区域所在层面，并用刷子清除样本块表面的碎屑。</li>
	<li>裁取一段足够覆盖目标区域的冷冻转移膜（cryotape），并预先在冷冻切片机中冷却。 
	注意：可在切片过程中预先裁剪多个尺寸一致的冷冻转移膜，并保存于冷冻切片机内。</li>
	<li>用镊子夹住冷冻转移膜的非黏性银色/金色标签端，揭去非黏附性背衬，然后将转移膜黏性面向下贴附到样本块表面。</li>
	<li>使用滚轮对冷冻转移膜施加压力（图 2C）。</li>
	<li>使用冷冻切片机的自动马达或手动切片轮进行切片（5 - 8 μm）。 
	注意：切片过程中建议用手扶住冷冻转移膜边缘，防止切片滑落切片台（图 2D）。</li>
	<li>将切片 组织面朝上 转移至冷冻切片机内的塑料载玻片上。</li>
	<li>将塑料载玻片从冷冻切片机中取出，待冷冻包埋介质融化，使切片牢固附着于载玻片表面。</li>
	<li>根据需要重复切片，以获取连续切片或其他目标区域的切片。</li>
	<li>切片完成后，根据储存时间及后续检测要求，将切片存放于 4、-20 或 -80 °C 的切片盒中。例如，若储存于 4 °C，计划用于酶活性染色的切片（见 5.2 - 5.3）应在一个月内使用。</li>
</ol>
3. 组织切片在显微镜载玻片上的贴附
<ol>
	<li>紫外光固化胶粘剂法。
	<ol>
		<li>标记载玻片。 
		注意：为提高自动化程度，样本和载玻片可使用条形码进行标记。</li>
		<li>将一滴紫外光活化光学胶粘剂涂于两张玻璃载玻片上，并用塑料推片的边缘将胶粘剂在载玻片表面铺展成一层薄层。</li>
		<li>剪去胶带上的银色/金色标签，将带有组织的一面朝上放置在第一张载玻片的胶粘剂上。以滚动方式从一端向另一端压贴组织，以尽量减少胶带下方气泡的形成。 
		注意：第一张载玻片用于在将胶带转移至第二张（永久性）载玻片之前，预先润湿胶带的底面（见步骤3.1.4）。</li>
		<li>将带组织的胶带从第一张载玻片上取下，转移至第二张载玻片的胶粘剂层上（图3A）。同样需小心操作，避免产生气泡。 
		注意：此步骤需要反复练习才能掌握。</li>
		<li>当每张载玻片上放置了实验所需数量的组织切片后，擦去周围区域多余的胶粘剂。</li>
		<li>仔细检查每张切片，观察胶带下方是否存在气泡或纤维。可在显微镜或放大镜下进行检查。若发现有障碍物，应将该切片取下，清除障碍物后重新贴附于载玻片上。</li>
		<li>确认胶带下的组织切片无任何障碍物后，将载玻片置于紫外黑光灯下照射5–10分钟，使胶粘剂发生交联固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>壳聚糖胶粘剂法。
	<ol>
		<li>配制1%壳聚糖胶粘剂。将0.25 ml浓乙酸溶于100 ml去离子水中（0.25% v/v），制成乙酸溶液。将1 g壳聚糖粉末溶于100 ml乙酸溶液中，搅拌过夜或直至壳聚糖完全溶解。 
		注意：该溶液在室温下稳定。</li>
		<li>在载玻片上为每个待贴附的组织切片滴加一滴壳聚糖溶液。</li>
		<li>剪去胶带上的银色/金色标签，将每张带组织的胶带组织面朝上贴附于胶粘剂上（图3A）。操作时需格外小心，避免产生气泡。</li>
		<li>当所有切片均放置到位后，将载玻片沿其长边之一倾斜竖起，用镊子将多余的壳聚糖溶液刮至底边。</li>
		<li>将载玻片保持此倾斜方向，放置于装有纸巾的玻片盒内。重力作用会使多余的壳聚糖溶液流下并被纸巾吸收，从而形成平整且均匀的壳聚糖层。</li>
		<li>将玻片盒盖子撑开，置于冰箱中过夜，使壳聚糖充分干燥。 
		注意：两种胶粘剂方法的比较见表1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在载玻片上应用参考标记
<ol>
	<li>通过将50 μl绿色微球和50 μl红色微球溶解于100 μl水中，制备参考标记溶液。将该溶液置于4 °C避光保存。</li>
	<li>将10 μl或20 μl移液枪头插入微球溶液中，然后在每个靠近目标区域的切片位置上添加少量微球溶液（图3C）。注意避免将微球滴加至目标区域内。</li>
	<li>若当天处理切片，则在室温（避光）下干燥30分钟；若不立即处理，则将切片放入切片盒中，置于4 °C保存。 
	注意：只要在切片水化前使微球溶液完全干燥，微球即可在多轮染色/成像过程中牢固附着于切片上。</li>
</ol>
5. 多轮染色
注意：通过选择兼容的成像、染色和重新成像步骤序列，可以在同一组织切片上检测并共定位多种生物信号。每一轮成像/染色/重新成像均需根据特定的组织学问题进行优化。成像/染色/重新成像序列通常包括获取内源性荧光信号（例如细胞GFP、矿化染料 体内 成像探针）进行第一轮成像，随后进行荧光多重免疫染色以及多轮酶活性染色。最后，切片可使用显色染料染色（例如，H&amp;#38;E，甲苯胺蓝，番红O， 等等。）以突出显示组织结构。本节介绍的方法是在商用试剂盒方案基础上改进的定制化方法。
<ol>
	<li>钙黄绿素蓝染色检测矿化沉积 
	注意：与暗场或微分干涉差（DIC）成像相比，钙黄绿素蓝染色可产生一致的矿化表面，适用于自动化图像分析。钙黄绿素蓝染色的问题在于其荧光光谱与四环素和去甲金霉素标记重叠。因此，若样本含有这些矿化标记物，应在钙黄绿素蓝染色前的第一轮成像中先完成这些标记物的成像。
	<ol>
		<li>若在本染色步骤前已对组织内源性信号进行成像，将上一轮成像后的载玻片浸入盛有1×PBS的考普林瓶中，直至盖玻片从载玻片脱落。取下并干燥盖玻片。</li>
		<li>在2% NaHCO3中配制30 mg/ml的钙黄绿素蓝溶液（将2 g NaHCO3溶于100 ml H2O中，用HCl调节pH至7.4）。分装后于-20°C保存。</li>
		<li>若载玻片未因上一轮操作而保持湿润，则将其浸入含1×PBS的考普林瓶中15分钟以水化组织切片。</li>
		<li>取出载玻片，用纸巾擦干背面和边缘。</li>
		<li>每张载玻片上加100–500 μl钙黄绿素蓝溶液，在室温湿度箱中孵育10分钟。</li>
		<li>用1×PBS冲洗载玻片，每次10分钟，共更换3次缓冲液。</li>
		<li>每张载玻片上加约200 μl含50%甘油的1×PBS溶液，加盖盖玻片。</li>
		<li>去除多余甘油，并擦干载玻片底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）酶活性染色 
	注意：TRAP由造血谱系中的多种细胞类型表达，包括破骨细胞。此处介绍的TRAP染色使用一种黄色荧光酸性磷酸酶底物。某些荧光信号会与定制的黄色滤光片组发生重叠，包括四环素/去甲金霉素矿化标记、钙黄绿素蓝染色以及DAPI复染信号。
	<ol>
		<li>将上一轮成像后的载玻片浸入盛有1×PBS的考普林瓶中，直至盖玻片脱落。取下并干燥盖玻片。</li>
		<li>通过将9.2 g无水醋酸钠和11.4 g二水合酒石酸钠溶于水中，并定容至1,000 ml，配制缓冲液1。用浓冰醋酸（约1.5–2 ml）调节pH至4.2。该溶液可在4 °C下保存长达12个月。</li>
		<li>通过将40 mg亚硝酸钠溶于水中并定容至1 ml，配制缓冲液2。该溶液可在4 °C下保存最多1周。</li>
		<li>在染色当天，将7.5 ml缓冲液1与150 µl缓冲液2混合，配制反应缓冲液。</li>
		<li>将不含底物的反应缓冲液加至载玻片上，孵育10–15分钟，使组织在较低pH条件下达到平衡。 
		注意：通常用量约为200 μl，但需足够覆盖所有组织区域。</li>
		<li>将黄色荧光酸性磷酸酶底物以1:50至1:100的比例溶于反应缓冲液中。 
		注意：稀释比例取决于样本中TRAP的活性水平。</li>
		<li>倒掉载玻片上的反应缓冲液，加入含黄色荧光底物的反应缓冲液。</li>
		<li>将载玻片置于紫外黑光灯下约5分钟以激活底物。 
		注意：孵育时间可能因样本中TRAP活性不同而有所变化。</li>
		<li>用1×PBS冲洗载玻片，每次10分钟，共更换3次缓冲液。</li>
		<li>每张载玻片上加约200 μl含50%甘油的1×PBS溶液，加盖盖玻片。</li>
		<li>去除多余甘油，并擦干载玻片底部。 
		注意：酸性TRAP缓冲液会导致组织脱钙。脱钙的附加优势是可使某些颜色在后续染色中重新可用（例如，矿化标记物）。例如，钙黄绿素蓝染色将在TRAP染色过程中被去除。因此，在后续成像轮次中，可在该通道中对DAPI复染信号进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碱性磷酸酶（AP）酶活性染色 
	注意：参与矿化的多种细胞类型（包括成骨细胞和矿化软骨细胞）均表达AP。本方案中使用的Fast Red底物可同时产生荧光红色和显色红色信号。由于该特性，底物沉淀区域会淬灭荧光信号。因此，建议在对可能被AP底物淬灭的荧光信号完成成像后，再进行本染色。
	<ol>
		<li>将上一轮成像后的载玻片浸入盛有1×PBS的考普林瓶中，直至盖玻片脱落。取下并干燥盖玻片。</li>
		<li>通过将12.1 g Tris溶于100 ml水中，再用1 M NaOH调节pH至9.5，配制1 M Tris溶液。</li>
		<li>通过将20.33 g MgCl2六水合物溶于100 ml去离子水中，配制1 M MgCl2六水合物溶液。</li>
		<li>通过将11.68 g NaCl溶于100 ml去离子水中，配制2 M NaCl溶液。</li>
		<li>通过将1 g Fast Red TR盐粉末溶于50 ml去离子水中，配制100×（20 mg/ml）储备液。分装为100 μl每份，于-20°C保存。</li>
		<li>通过将500 mg Naphthol AS-MX磷酸盐粉末溶于50 ml N,N-二甲基甲酰胺中，配制100×（10 mg/ml）储备液。分装为100 μl每份，于-20 °C保存。</li>
		<li>在染色当天，向去离子水中加入1 ml 1 M Tris、0.5 ml 1 M MgCl2、0.5 ml 2 M NaCl，并定容至10 ml，配制AP缓冲液（终浓度：100 mM Tris、50 mM MgCl2、100 mM NaCl）。</li>
		<li>将AP缓冲液加至每张载玻片上，在湿度箱中室温孵育10分钟。</li>
		<li>通过将Fast Red TR盐和Naphthol AS-MX的100×储备液按1:100比例稀释于AP缓冲液中，配制AP底物缓冲液。</li>
		<li>倒掉载玻片上的AP缓冲液，替换为AP底物缓冲液。在湿度箱中室温孵育5–10分钟。 
		注意：孵育时间取决于样本的AP活性。</li>
		<li>用1×PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。</li>
		<li>使用含DAPI的复染溶液（将DAPI以1:1,000比例稀释于含50%甘油的1×PBS溶液中）封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲苯胺蓝O（TB）显色染色 
	注意：由于此前所有步骤均在50%甘油/PBS溶液的临时水性封片条件下进行成像，本显色步骤也需在水性条件下成像。然而，染色液可能随时间推移发生渗出。因此，建议染色后尽快完成甲苯胺蓝成像。
	<ol>
		<li>将上一轮成像后的载玻片浸入盛有去离子水的考普林瓶中，直至盖玻片脱落。取下并干燥盖玻片。</li>
		<li>取下盖玻片后，更换新鲜去离子水，将载玻片至少孵育10分钟，以充分去除组织中的PBS盐分。</li>
		<li>用去离子水配制0.025% TB溶液。</li>
		<li>将载玻片置于TB溶液中染色1–5分钟。 
		注意：孵育时间取决于操作者偏好，但应在所有样本间保持一致。</li>
		<li>将载玻片放入盛有去离子水的考普林瓶中，洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用溶解于去离子水中的30%甘油封片（不可使用1×PBS，因其会导致染料从组织中渗出）。注意：可用果糖糖浆替代甘油封片介质，有助于防止染料在组织中扩散。配制方法：将30 g果糖溶于10 ml去离子水中，加热至60 °C至完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 多轮成像
<ol>
	<li>将载玻片装入显微镜载物盘中（图3D）。 
	注意：载物盘具有弹簧加载设计。</li>
	<li>将载物盘插入切片扫描显微镜的载物盘堆栈中（图3E）。</li>
	<li>点击配置文件列表，为每张载玻片加载针对各荧光染料设置适当曝光时间的配置文件。点击载玻片名称，可手动命名每张载玻片，或让软件读取载玻片标签上提供的条形码。点击“开始预览扫描”按钮，以获取载玻片的预览图像。</li>
	<li>在组织检测向导中设定感兴趣区域，并将其保存以用于后续成像轮次。每张载玻片设置完成后，点击“开始扫描”按钮启动扫描过程。 
	注意：该系统一次最多可容纳100张载玻片。</li>
	<li>成像完成后，将来自各个独立通道及成像轮次的图像导出为 .tif 或 .jpg 文件，用于图像拼接与分析。</li>
</ol>
7. 图像拼接
<ol>
	<li>使用 Photoshop（或具备生成分层图像功能的类似图像编辑软件）的手动方法。
	<ol>
		<li>从每轮成像中分别打开各个通道图像。</li>
		<li>将各个图像作为图层组合到一个合成图像中。具体操作为：在图层面板中点击某一图像的图层，然后将其拖动至另一幅图像上。此拖放操作将在目标图像中创建一个新图层。对所有其他图像重复此步骤。或者，可使用脚本（文件&#62;脚本&#62;使用“载入文件到堆栈…”功能，通过将多个图像文件作为图层载入图像堆栈来自动化此过程。</li>
		<li>当每幅图像作为独立图层列在复合图像中后，双击图层名称，根据需要重命名图层，以区分不同的通道。</li>
		<li>为了穿透每一层并生成真正的复合图像，将每一层的混合模式从 &#34;正常&#34; 到 &#34;屏幕&#34; 在图层调板中。 
		注意：为加快此步骤，可将单个图层更改为屏幕模式，然后右键单击该图层，选择 &#34;复制图层样式&#34;，然后选中所有其他图层并选择 &#34;粘贴图层样式&#34; 将屏幕样式应用到其他图层。</li>
		<li>如需要，可降低显色层的不透明度（将数值调整为10–40%）即，甲苯胺蓝）以通过显色层更清晰地观察荧光信号。 
		注意：本实验方案中使用的拼接扫描显微镜通过三边固定载玻片，从而最大限度地减少每轮成像过程中载玻片可能发生的旋转。因此，用户在手动对齐不同成像轮次所获得的图像时，无需进行图像旋转，操作更为简便。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此，我们介绍了一种详细的冷冻组织学实验方案，通过将单个组织切片上多轮染色/成像所获得的图像进行对齐，实现多种生物学指标的共定位与定量分析。本方案中采用的冷冻胶带技术尤为实用，因其可有效维持难以切片的组织的形态结构例如，矿化的骨和软骨）。此外，切片组织牢固地附着在玻璃载片上，可对同一组织切片进行多轮染色和成像；而传统方法则需使用连续切片，每张切片采用不同的染色方案。当需要在不同切片间进行信号共定位时，连续切片法可能会带来问题，而对同一张切片进行多轮染色和成像则可避免此类问题。
市场上首个采用胶带稳定的组织切片产品是一种胶带转移系统16, 17。该系统使用涂有低温黏合剂的塑料胶带，将其贴附于组织冷冻块表面。当冷冻切片机刀片在胶带下方进行切割时，切片会完整地保留在胶带上并随之被转移。随后将胶带带有样本的一面朝下放置于涂有紫外光固化胶水的载玻片上，使组织牢固地附着于载玻片。待胶带从切片上剥离后，载玻片即可用于荧光或显色组织学检测。该黏合剂的背景荧光较低，大多数软组织均可耐受多轮染色与成像。然而，在处理矿化组织切片时，将组织从黏合胶带转移至玻璃载玻片...

生物学研究通常需要高效的表型分析，而这往往涉及某种形式的组织学分析1-3。随着雄心勃勃的小鼠基因组全基因敲除项目的发展，这一需求变得更加明显4。这些组织学分析的范围可从评估细胞形态和/或解剖特征，到将特定基因或蛋白质的表达定位至单个细胞。事实上，组织学对基因组学领域的一项基本贡献在于，能够将特定的分子信号与特定的组织区域或细胞类型相关联。
传统的组织学方法，尤其是针对肌肉骨骼组织的方法，通常耗时且繁琐，有时需要数周时间来完成样本的固定、脱钙、切片、染色和成像，随后还需通过人工判读对图像进行分析。若要分析多种分子信号，无论是通过免疫组织化学、原位杂交还是特殊染色，通常都需要制备多个切片，甚至多个样本才能恰当完成。此外，这些不同的信号反应无法在同一细胞中共定位，有时甚至无法在同一样本的特定区域内实现共定位。随着基因组学和表观基因组学领域迈入数字化时代，组织学领域也必须随之发展，以实现在单个组织切片中对多种分子信号进行高效、高通量且自动化的分析。
事实上，人们迫切需要改进组织学技术，以将多种分子信号与特定样本中的具体细胞关联起来。最近，我们发表了一种新的高通量冷冻组织学方法，可用于评估矿化组织切片内多个响应指标5-14。该方法包括用冷冻胶带固定冷冻切片，将带胶带的切片牢固地粘附在显微镜载玻片上，并对每个切片进行多轮染色和成像。随后在图像分析之前，通过人工或计算机自动对这些成像轮次进行对齐（图1）。本文中，我们详细介绍了该方法的操作流程，并提供了若干实例，展示这些技术如何增进我们对不同生物学过程的理解。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>多个供应商可提供。有毒。可用 4% 多聚甲醛替代。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>可根据组织选择不同尺寸</td></tr><tr><td>冷冻基质</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>可用其他冷冻基质替代。然而，PVA/PEG 基树脂在我们实验中效果最佳。</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>样本盘</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>冷冻胶带</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>滚轮</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>塑料显微镜载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71890-01</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>可用其他品牌/型号替代。</td></tr><tr><td>Norland 光学胶 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>紫外黑光灯</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>InSpeck 红色微球</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck 绿色微球</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&amp;nbsp;</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>茜素络合酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&amp;nbsp;</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>去甲金霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&amp;nbsp;</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>ELF 97 黄色荧光酸性磷酸酶底物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>多个供应商可提供。可用 Hoechst 33342 或其他细胞核染料替代。</td></tr><tr><td>TO-PRO-3（Cy5 细胞核复染剂）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>无水乙酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>酒石酸钠二碱二水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>快红 TR 盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>多个供应商可提供。也可用其他底物试剂盒替代，例如 Vector Blue（Vector Laboratories，货号 SK-5300）</td></tr><tr><td>萘酚 AS-MX&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>也可使用其他线性或拼接扫描仪。</td></tr><tr><td>DAPI 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFP 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>定制黄色（ELF 97）滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>定制；HQ409sp，HQ555/30m，425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane 胶带转移系统</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-10</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>CryoJane 胶带窗口</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-72</td><td>多个供应商可提供。</td></tr><tr><td>CryoJane 黏附载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-4X</td><td>多个供应商可提供。</td></tr></tbody></table>

矿化组织的高通量多图像冷冻组织学

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

目前，对多种组织进行高效表型分析和组织病理学研究的需求日益增长。这一需求在旨在敲除小鼠基因组中每一个基因的宏伟项目中尤为明显。科研界迫切需要一种快速且低成本的方法，通过组织学手段对组织进行表型分析。骨骼组织的组织学分析通常耗时较长，且最多只能达到半定量水平，往往需要经过培训的专业人员对切片进行主观判读。本文介绍一种用于矿化组织高效且低成本表型分析的冷冻组织学新范式。首先，我们提出一种基于胶带稳定的冷冻切片新技术，可有效保持矿化组织的形态结构。这些切片被牢固地贴附于玻璃载玻片上，可在多轮染色过程中反复成像。所得图像可通过人工或计算机软件进行对齐，生成包含多个层次信息的复合图像堆栈。该方案可实现多种分子信号在特定细胞内的共定位分析。此外，这些荧光信号还可通过计算机软件进行客观定量。本方案克服了传统矿化组织组织学分析中的诸多局限性，有望成为未来肌肉骨骼组织高通量、高内涵表型分析的通用平台。

高通量、多图像冷冻组织学的一般工作流程
图1 代表了该技术所采用的通用工作流程。该流程包括从固定到多轮成像，最终进行图像配准与分析的多个步骤。从样本固定到完成4轮成像，整个过程最短可耗时约一周，相比此类样本的脱钙所需时间更短。成像顺序通常首先采集标本中已有的内源性信号（例如，绿色荧光蛋白，矿化标记 等等。），然后进行多重荧光免疫染色，接着进行荧光酶活性检测（例如., TRAP, AP, 等等。）以及细胞周期分析实验（例如，EdU），最后以显色染色结束（例如甲苯胺蓝O，苏木精，番红O 等等。).
来自青少年踝关节的代表性示例</...

在本论文中，我们介绍了一种高通量、半自动化的冷冻组织学平台，该平台能够对矿化组织冷冻切片进行多轮荧光成像，并生成多种反应指标的配准复合图像。

高效地对多种组织进行表型分析和组织病理学检测的需求日益增长。这一表型分析需求在雄心勃勃的……中尤为明显。

该技术的目标是提供一种组织学工具，能够以高通量、无观察者偏差且完全数字化的方式整合复杂的模型系统，同时兼顾成本效益，并对肌肉骨骼生物学研究者具有实际意义。组织学对大多数生物研究人员至关重要，但通常耗时耗力且难以量化。因此，亟需能够实现高效、高通量和自动化分析的组织学技术。利用我们的冷冻组织学平台，研究人员可通过高通量方式对同一张载玻片进行多次成像和染色，从而将多种分子信号与特定样本中的具体细胞关联起来。本实验操作由我实验室的研究助理江 Xi 和陈 Li 示范展示，她们率先开发并实施了这些技术。开始该操作时，先将样本从福尔马林中取出，剥离多余的组织，然后转移至用 1×PBS 配制的 30%蔗糖溶液中。将标本在蔗糖中于 4 摄氏度孵育 12 至 24 小时。接着，用冷冻包埋介质填充冷冻模具，并将标本放入模具中。然后，调整模具中的样品方向，使目标区域的切面与模具底部平行。随后，将冷冻模具置于干冰上，直至冷冻包埋介质形成一层薄薄的冻结层，使样本固定到位。然后，在保持冷冻模具位于干冰颗粒上的同时，用冷冻包埋介质填充模具的剩余空间。接着，将冷冻模具放入装有经干冰预冷的2-甲基丁烷的容器中。待标本完全冻结后，取出冷冻模具并抖去多余的2-甲基丁烷。用玻璃纸包裹冷冻模具，并在负20摄氏度或负80摄氏度下保存。在此步骤中，将标本组织块从冰箱转移至设定温度为负20至负25摄氏度的冷冻切片机中。接下来，将组织块从冷冻模具中取出，并用刀片修去多余的包埋剂。然后，在样品盘上添加一些包埋剂，将组织块对准放置，使样品盘表面与组织块底面平行。等待包埋剂完全冻结。随后，将样本片放置在样本头上，并调整样本头，使刀片与样本块表面平行切割。接下来，裁剪适当大小的低温胶带以覆盖目标区域，并将其预先在冷冻切片机中冷却。然后，修整样本块至目标区域内的适当水平，根据需要持续进行调整。到达目标区域并可进行切片后，先将块表面的碎屑刷去。接着，捏住冷冻胶带非黏性部分的银金色标签，移除其非黏附性背衬。然后将胶带黏性面向下贴到样本块上。使用滚轮对冷冻胶带施加压力，并利用冷冻切片机的自动马达或手动切片轮进行切片。随后，将组织面朝上的切片放置于冷冻切片机内的塑料载玻片上。将塑料载玻片从冷冻切片机中取出，静置使冷冻包埋介质融化，从而使切片黏附于载玻片表面。对连续切片或其他感兴趣区域重复切片操作。完成后，将切片放入载玻片盒中，并根据所需的保存时间及后续检测方法，于 4、-20 或 -80 摄氏度条件下保存。进行紫外光固化胶粘剂法时，首先标记载玻片。在两张载玻片上各滴加一滴紫外光活化光学胶，用另一张载玻片的边缘将胶均匀涂抹成一层薄层。随后，剪下银金导电标签，将带有组织的一面朝上放置于第一张载玻片的胶层上。以滚动方式从一端向另一端压平切片，以尽量减少胶带下方气泡的产生。随后，将第一条载玻片上粘贴的切片取下，转移至第二条载玻片的粘合层上，注意避免产生气泡。当每张载玻片上放置了符合实验要求的切片数量后，擦去周围区域多余的粘合剂。接着，仔细检查切片下方是否存在气泡或纤维。然后将载玻片置于紫外黑光下照射5至10分钟，以交联粘合层。在此步骤中，通过将50 µL绿色微球和50 µL红色微球溶解于100 µL水中，制备参考标记物溶液。将该溶液避光保存于4 °C条件下。然后将移液器吸头浸入微球溶液中，将微球溶液点样至每个组织切片上，靠近目标区域。接着，若当天处理切片，则在室温下干燥切片，并用铝箔包裹以避光，静置30分钟；若不立即处理，则将切片置于切片盒中，于4摄氏度保存。染色完成后，使用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。进行成像时，将载玻片放入显微镜载物盘中，并将载物盘插入切片扫描显微镜的载物盘堆栈内。随后，在显微镜软件中点击轮廓列表，为每张载玻片加载相应的荧光染料曝光时间参数配置文件。然后，单击“开始预览扫描”按钮，以获取每张载玻片的预览图像。软件将通过读取载玻片标签上的条形码自动分配文件名。或者，也可以为每张载玻片手动指定文件名。通过进入组织检测向导，使用绘图工具绘制每个感兴趣区域，进行必要的调整，并保存这些区域以用于后续成像轮次来设定感兴趣区域。每个载玻片设置完成后，单击“开始扫描”按钮启动扫描过程。每轮成像结束后，将载玻片浸入盛有1×PBS的考普林瓶中，直至盖玻片从载玻片上脱落，再进行下一步染色操作。完成所有成像轮次后，将各独立通道的图像导出为 TIF 或 JPG 文件，用于图像拼接与分析。本图中，来自一只三个月大小鼠股骨的切片经钙黄绿素蓝染色，用于显示矿化沉积（第一轮成像中呈白色）以及矿化标记物（第一轮成像中呈绿色和红色）。随后，载玻片进行 trap 活性成像（第二轮成像中呈黄色）和碱性磷酸酶（AP）活性成像（第三轮成像中呈红色）。最后，在第四轮中用甲苯胺蓝对切片进行染色。在每一轮成像过程中（包括显色成像轮次）均对参考标记物进行成像，并使用定制软件进行图像对齐。一旦掌握，该技术所需时间比脱钙一个典型样本的时间更短。观看本视频后，您应能充分掌握如何获取高质量的矿化组织高内涵图像，我们希望这些方法能够被肌肉骨骼研究领域更广泛地应用。

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科研

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生物学

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