通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

本实验方案的总体目标是制备具有可控长度尺度和几何形状的可降解温敏性水凝胶。该方法有助于应对生物医学材料领域中的若干关键挑战，例如实现长期、微创的局部药物递送，构建用于组织工程的响应性支架，或设计靶向性纳米治疗剂。本技术的主要优势在于采用了一种快速的逆向生物腙化学反应，通过改变聚合物前体的混合几何构型，即可调控可降解水凝胶的尺寸与形状。

这种灵活性使我们能够使用相同的起始材料制备叶酸凝胶、微凝胶、纳米凝胶以及纳米纤维。首先，分别制备约两毫升的酰肼基和醛基功能化的温敏性前体聚合物溶液，其质量浓度为5%至40%，并溶于10毫摩尔磷酸盐缓冲盐水。使用单腔注射器将前体聚合物溶液分别装入2.5毫升1:1双腔注射器的两个独立腔室中。

接下来，将一个1.5英寸的静态混合器连接至一个2.5毫升的1:1双筒注射器。如需要，可在静态混合器上安装一根18或20号、1.5英寸长的针头。然后，从所需厚度的柔软硅胶橡胶片上裁切材料。

大小与标准显微镜载玻片相当。使用打孔工具组在硅橡胶片上打出至少一个所需形状的孔。将硅橡胶模具放置在洁净的载玻片上，确保所有孔均被玻璃支撑。

轻轻将模具按压在载玻片上以固定其位置。也可使用硅橡胶片作为背衬，以确保基底良好粘附。通过静态混合器将酰肼和醛基功能化的聚合物溶液共挤出至模具孔中，直至孔完全充满。

用另一块干净的玻璃载玻片覆盖模具，静置至凝胶完成。随后移除上层载玻片，使用刮铲将水凝胶从硅橡胶模具上分离。将模具从载玻片上提起，以回收水凝胶。

在实验开始前，制备用于微粒生成的微流控芯片。合成带有酰肼基和醛基功能化的聚NIPAM。首先，分别配制2毫升浓度为6%（质量分数）的酰肼基和醛基功能化聚NIPAM水溶液，溶剂为去离子水。

将聚合物前体溶液分别装入两个5毫升注射器中。接着，配制150毫升浓度为1%（质量分数）的司盘-80重质石蜡油溶液，并将该溶液装入两个标准的60毫升注射器中。

将四个注射器分别安装在输注式注射泵中。接着，将一段45厘米长的硅胶管连接至微流控芯片的出口。将出口管的末端放入废液容器中。

将装有聚合物溶液的注射器通过30厘米长的硅胶管连接至微流控芯片的聚合物入口通道。将一个石蜡油溶液注射器通过硅胶管连接至上游油相入口通道。使用硅胶管和U形注射器接头，将另一个油相注射器同时连接至两个下游油相入口通道。

将装有油注射器的泵的流速设置在每小时1.1至5.5毫升之间。以油溶液至少持续流经微流控芯片30分钟，以润洗芯片并确认芯片无缺陷。随后，以每小时03毫升的流速同时向已润洗的芯片输送两种聚合物溶液。

让聚合物和油相流动平衡30分钟至1小时。为防止前体聚合物在微流控喷嘴处过早发生凝胶化，必须仔细预润管路，并同时精确启动聚合物的流动，以防止聚合物倒流进入任一聚合物储液池。一旦微流控芯片喷嘴处形成均匀的凝胶微粒，立即将微粒收集至含有活性磁力搅拌子的塑料离心管中。

当油相消耗完毕后，停止注射泵和搅拌电机。待凝胶微粒在管中沉降后，用移液管吸出石蜡油。向烧瓶中每5 mL微粒加入10 mL戊烷。

剧烈搅拌乳液约一分钟。静置一至两小时使颗粒沉降，然后用移液管小心倾去戊烷。至少重复此戊烷洗涤步骤五次。

将洗涤后的凝胶微粒转移至一个小的玻璃闪烁瓶中。用一到两毫升去离子水重悬微粒。开始此操作前，分别配制5毫升1%的酰肼和醛基功能化聚NIPAM水溶液，溶剂为去离子水。

在搅拌的同时，将 5 毫升酰肼基团修饰的聚 NIPAM 溶液加热至 70 摄氏度。观察溶液逐渐变浑浊，并确认无可见沉淀生成。随后，在 5 至 10 秒内，将 0.25 毫升醛基修饰的聚 NIPAM 溶液逐滴加入已加热的酰肼基团修饰的聚 NIPAM 溶液中。

在70摄氏度下搅拌混合物15分钟。然后将混合物从油浴中取出，静置过夜，使其冷却至室温，从而得到用于纯化的纳米凝胶。将纳米凝胶混合物置于截留分子量为3500千道尔顿的透析膜中。

将纳米凝胶在去离子水中透析，每六小时更换一次透析液，共透析六次，以去除未交联的聚合物。如有需要，可将纯化后的纳米凝胶冻干保存。开始制备凝胶纳米纤维时，分别配制1 mL质量分数为15%的酰肼基和醛基功能化POEGMA水溶液。

然后，配制2毫升质量分数为5%的高分子量聚环氧乙烷水溶液，溶剂为去离子水。将每种POEGMA前体溶液与1毫升聚环氧乙烷溶液混合。将前体溶液分别装入双筒注射器的两个筒中。

接下来，将一个1.5英寸的静态混合器和一个钝头18号针头连接至一个2.5毫升、1:1双筒注射器上。将双筒注射器安装在推注式注射泵上。然后，在针头末端10厘米处安装一个铝盘电纺丝收集器。

将高压电源的收集端接地，并将电源连接至针头。将注射泵设置为0.48毫升每小时，电源设置为10千伏。同时启动注射泵和电源，开始静电纺丝。

继续操作直至达到所需厚度或前体耗尽。纳米纤维制备完成后，关闭并断开静电纺丝装置。将收集到的凝胶纳米纤维浸泡在去离子水中24小时，以去除聚环氧乙烷。

双筒注射器输送法制备了腙键交联的POEGMA块状水凝胶，其力学性能、凝胶时间及透明度随前体聚合物浓度、反应性官能团密度以及单体上环氧乙烷重复单元数量的不同而变化。石蜡油和聚合物前体溶液的流速影响了利用微流控装置制备的腙键交联聚NIPAM水凝胶微粒的尺寸。通过热台光学显微镜观察到材料具有可逆的温度依赖性溶胀行为。

凝胶微粒随时间降解为其寡聚前体。自组装腙键交联聚NIPAM纳米凝胶的尺寸随醛基与肼基功能化聚合物前体的质量比而变化，但均保持高度单分散性。随着质量比的增加，热致收缩程度降低。

与凝胶微粒类似，纳米凝胶随时间逐渐降解为寡聚前体。通过反应性静电纺丝技术制备了由腙键交联的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯（POEGMA）水凝胶纳米纤维，其直径约为300纳米。纳米纤维的水合速度比具有相同聚合物组成的块状凝胶快约两个数量级。

纳米纤维在生理条件下可保持其纳米纤维形态超过八周，随后才开始降解。在酸性环境中降解速度更快。纳米纤维在干燥和溶胀状态下均具有良好的机械强度。

观看本视频后，我们希望您能够充分理解如何通过控制凝胶前体聚合物的制备几何结构，来制备可降解且具有温度响应性的水凝胶。请务必确保聚合物前体的凝胶化时间符合每种颗粒的具体需求。若凝胶化过程过快，将抑制微凝胶和纳米纤维的制备。

凝胶化过程过慢将导致完全凝固的形态。这些技术为药物递送和组织工程领域的研究人员提供了新的途径，并可设计出结构明确的水凝胶支架，以控制药物释放的速率或位置，或刺激组织再生。