Name: 通过反应挤出、微流体、自组装和电纺丝制备多长尺度可降解 Thermoresponsive 水凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习利用反应挤出、微流体、自组装和电纺丝技术制备可降解热响应水凝胶的方法。该方法通过控制聚合物前驱体混合几何形状，实现块体凝胶、微凝胶、纳米凝胶和纳米纤维的灵活制备，适用于药物递送和组织工程应用。

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感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、NSERC CREATE-IDEM（细胞外基质综合设计）项目、20/20：NSERC 眼科生物材料研究网络以及安大略省研究与创新部早期研究员奖项目的资助。

1. 肼基功能化聚合物的合成
注意：以下提供的是具有30 mol% 肼基官能团的聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）模拟性温敏性POEGMA前体聚合物（PO10）的具体配方。通过该通用方法，仅需调整所用核心单体的种类和比例，即可制备具有不同相变温度的PNIPAM和POEGMA前体聚合物（有关不同POEGMA聚合物的调整方法，请参见第1.2节）21,25,27。
<ol>
	<li>称取 37 mg 的 2,2'-偶氮双(2-甲基丙酸) (AIBMe, 引发剂)、3.1 g 二乙二醇甲基丙烯酸酯 (M(EO)2MA)、0.9 g 寡乙二醇甲基丙烯酸酯 (OEGMA475, 475 g/mol，n=7-8 个环氧乙烷重复单元)、523 µL 丙烯酸 (AA, 共聚单体) 和 7.5 µL 巯基乙酸 (TGA, 链转移剂)，加入至一个 20 mL 玻璃闪烁瓶中。</li>
	<li>对于 PO0（室温相变温度的 POEGMA），使用 4.0 g M(EO)2MA（不加 OEGMA475）；对于 PO100（无相变温度的 POEGMA），使用 4.0 g OEGMA475 （不加 M(EO)2MA）。 
	注意：根据 Lutz 等23 的方法，通过调节 M(EO)2MA 与 OEGMA475 的中间配比，可获得具有中间相变温度的聚合物。</li>
	<li>将所有试剂溶于二噁烷中（每克总单体使用 5 mL 二噁烷），置于一个带有一个或多个颈口的圆底烧瓶中。</li>
	<li>用高纯氮气（UHP 级）通入反应体系中吹扫 30 分钟。</li>
	<li>吹扫完成后，将烧瓶置于预热至 75 °C 的油浴中，在氮气氛围下以 400 rpm 的速度磁力搅拌反应 4 小时。</li>
	<li>反应 4 小时后，使用旋转蒸发仪（设定温度为 50 °C，转速为 200 rpm）除去溶剂。</li>
	<li>将所得聚合物产物溶解于 150 mL 去离子水中。</li>
	<li>加入己二酸二酰肼 (ADH)，其摩尔量为聚合物中引入的 AA 残基数的五倍（在本示例中，根据电导滴定结果，AA 占所制备聚合物单体单元的 29 mol%）。</li>
	<li>使用 0.1 M HCl 将溶液 pH 调节至 4.75。</li>
	<li>pH 稳定后，加入 N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺 (EDC)，其摩尔量为 AA 残基数的五倍。</li>
	<li>在随后的 4 小时内，通过逐滴加入 0.1 M HCl 维持反应体系 pH 为 4.75。</li>
	<li>让反应体系继续搅拌过夜。</li>
	<li>将产物溶液通过漏斗小心倒入三根长约 30 cm 的透析袋中（截留分子量为 3500 Da，厚度为 1 英寸），以尽量减少洒漏。在填充前，先将透析袋底部折叠一小段（约 2 cm）并用夹子夹紧，以增强密封性；填充完成后，同样方式处理顶部（挤压以去除气泡）。将透析袋置于体积为其 100 倍的去离子水中，至少透析 6 小时，并在六次换水周期中完全更换透析液，以达到所需纯度。</li>
	<li>将透析后的样品冷冻干燥，得到最终的干燥聚合物产物。</li>
</ol>
2. 醛基功能化聚合物的合成
<ol>
	<li>醛前体单体 N-(2,2-二甲氧基乙基)甲基丙烯酸酯（DMEMA）的合成
	<ol>
		<li>将 200 mL 的 20% w/v NaOH 溶液加入到一个 500 mL 三颈圆底烧瓶中。</li>
		<li>将溶液置于冰浴中冷却，并在反应过程中用冰维持温度在 0 °C。</li>
		<li>向冷却的 NaOH 溶液中加入 50 mL 氨基乙醛二甲基缩醛。</li>
		<li>加入 0.1 g TEMPO（(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧化物），使用磁力搅拌子以 400 rpm 搅拌，直至 TEMPO 完全溶解。</li>
		<li>使用滴定管在 2 小时内逐滴加入 48 mL 甲基丙烯酰氯。</li>
		<li>2 小时后，用铝箔覆盖反应容器，并继续搅拌过夜。</li>
		<li>将反应产物加入到 1 L 分液漏斗中的 75 mL 石油醚中，振荡、脱气后弃去上层。</li>
		<li>重复步骤 2.1.7 三次，每次将萃取步骤中得到的下层产物作为原料进入下一轮萃取循环。</li>
		<li>取出最终的下层产物，转移至 100 mL 烧杯中。</li>
		<li>向含有单体的烧杯中加入约 5 g 硫酸镁（Mg2SO4），直至观察到&#34;雪球瓶&#34;效应。</li>
		<li>通过 100 mL 布氏漏斗过滤，除去 Mg2SO4。</li>
		<li>用约 75 mL 叔丁基甲基醚将烧杯冲洗两次，每次将洗涤液倒入漏斗中过滤。</li>
		<li>将产物转移至 500 mL 圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在室温、200 RPM 条件下蒸发溶剂，收集最终产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>醛功能化聚合物的合成 
	&#8203;注意：以下提供的是具有 30 mol% 醛功能化的 PNIPAM 模拟物 POEGMA 前体聚合物（PO10）的具体配方。通过相同的一般方法，但调整所用核心单体的类型和比例，可制备具有不同相变温度的 PNIPAM 和 POEGMA 前体聚合物（参见第 1.2 节中关于不同 POEGMA 聚合物的调整方法）21,25,27。
	<ol>
		<li>称取 37 mg 2,2'-偶氮双(2-甲基丙酸)（AIBMe）、3.10 g 二甘醇甲基丙烯酸酯 M(EO)2MA、0.1 g 寡乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA475，475 g/mol，n=7-8 个环氧乙烷重复单元）、1.30 g N-(2,2-二甲氧基乙基)丙烯酰胺（DMEMA）以及 7.5 µL 巯基乙酸（TGA），加入 20 mL 玻璃闪烁瓶中。</li>
		<li>对于 PO0（室温相变温度 POEGMA），使用 4.0 g M(EO)2MA（不含 OEGMA475）；对于 PO100（无相变温度 POEGMA），使用 4.0 g OEGMA475 （不含 M(EO)2MA）。 
		注意：根据 Lutz 等.23 的方法，通过使用 M(EO)2MA 和 OEGMA475 的中间比例混合物，可实现中间相变温度。</li>
		<li>将所有试剂溶解于二噁烷中（每克总单体使用 5 mL 二噁烷），置于一个或多个颈口的圆底烧瓶中。</li>
		<li>用高纯氮气（UHP 级）吹扫反应体系 30 分钟。</li>
		<li>吹扫完成后，将烧瓶置于预热至 75 °C 的油浴中，在氮气氛围下以 400 rpm 磁力搅拌反应 4 小时。</li>
		<li>反应 4 小时后，使用旋转蒸发仪在 50 °C、200 rpm 条件下去除溶剂。</li>
		<li>将所得聚合物产物溶解于 100 mL 去离子 H2O 中。</li>
		<li>向溶解后的溶液中加入 50 mL 1 M HCl，并在磁力搅拌（400 RPM）下搅拌 24 小时，以完全水解 DMEMA 中的缩醛官能团。</li>
		<li>反应完成后，将聚合物溶液转移至透析袋中，操作同第 1.13 步。</li>
		<li>将透析后的样品冷冻干燥，得到最终干燥的聚合物产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 腙交联块状水凝胶的制备
<ol>
	<li>将酰肼和醛基功能化的聚合物分别溶解于10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）或任何所需的水性缓冲液中，以制备所需浓度的溶液。 
	注意：通常使用的质量浓度范围为5-40 wt%，若聚合物上功能基团比例较高，则在较低浓度下也可能发生凝胶化。</li>
	<li>使用单腔注射器转移溶液，将每种前体溶液（各约1 mL）分别装入连接静态混合器（长度1.5&#34;）的双腔注射器（2.5 mL体积，1:1比例）的两个腔室中，并（可选）连接一个注射针头（通常为18 G，1.5”长度，用于体外研究）和（可选）另一个注射针头（通常为18 G，1.5”长度，用于体外研究）。</li>
	<li>通过在硅橡胶片上打孔，制备所需厚度、形状和直径的模具。 
	注意：在典型实验中，使用标准打孔器在厚度为1/16&#34;的硅橡胶片上打出直径7 mm的圆柱形孔（储液池总体积约300 µL）。</li>
	<li>将硅胶模具固定在标准玻璃显微镜载玻片上，确保模具中的孔完全由玻璃支撑。&#160;建议在安装硅胶模具前用0.1 M HCl清洗玻璃表面，但并非必需。</li>
	<li>通过静态混合器共挤出双腔注射器中的内容物，完全填充（或略微过量填充，顶部形成弯月面）硅胶模具。 
	注意：只要凝胶化时间与填充多个模具所需的总时间处于同一数量级或更长，即可在一次挤出过程中制备多个样品。</li>
	<li>在模具上方放置另一张标准玻璃显微镜载玻片，静置直至凝胶化完成。 
	注意：合成部分所述的标准配方在&#60;1分钟内即可形成凝胶；在功能基团密度较低、聚合物浓度较低和/或相对于M(EO)2MA含有较高比例OEGMA475的情况下（对于POEGMA水凝胶），凝胶化速度较慢（因此需要更长的等待时间）。</li>
	<li>取下顶部的显微镜载玻片，并使用刮刀将水凝胶从硅橡胶模具中推出。</li>
	<li>将模具从底部的显微镜载玻片上抬起，以回收水凝胶用于后续测试。</li>
</ol>
4. 腙交联凝胶微粒的制备
<ol>
	<li>微流控芯片的制备
	<ol>
		<li>将一片硅片（直径 = 76.2 mm，厚度 380 µm，P 掺杂，&#60;100&#62; 晶向）置于加热板上，在 200 °C 下加热 5 分钟以进行脱水处理。</li>
		<li>将硅片置于匀胶机中心位置，加入约 7 mL SU-8 100 光刻胶，以 500 rpm/s 的加速度加速至 3000 rpm，并在此转速下保持 30 秒，形成厚度约为 100 µm 的光刻胶涂层。</li>
		<li>在 65 °C 下预烘 10 分钟，随后在 95 °C 下软烘 30 分钟。</li>
		<li>使用透明胶片打印微流控图案的光掩模，图案依据图 2A设计，其中透明区域对应光刻胶固化后的目标图案。</li>
		<li>将涂有光刻胶的硅片与光掩模放入光刻对准仪中，用 365 nm 光源照射 95 秒（曝光功率为 6.5 W）。</li>
		<li>将图案化后的硅片在 95 °C 下烘烤 10 分钟，首先将其置于 65 °C 的加热板上，然后以 10 °C/min 的升温速率将加热板升至 95 °C。</li>
		<li>从加热板上取下硅片，放入盛有 100 mL SU-8 显影液的 500 mL 烧杯中，至少浸泡 10 分钟，并在过程中缓慢摇动硅片，以去除未曝光区域的光刻胶。10 分钟后，用异丙醇冲洗图案化硅片，并用空气吹干。当不用于软光刻复制成型时，应将图案化硅片储存在阴凉、干燥、避光的环境中。</li>
		<li>将图案化的微流控模具放入培养皿中。在芯片的进样口和出样口处放置长度约为 10 mm 的 L/S 13 硅胶管。</li>
		<li>将约 10 mL 聚二甲基硅氧烷（PDMS；由硅弹性体基础液与硅弹性体固化剂按 10:1 比例混合制得）缓慢倾倒于芯片表面，注意避免将 PDMS 注入已放置的硅胶管内。</li>
		<li>将培养皿置于真空腔中约 10 分钟，以去除固化过程中残留在图案结构内部及周围的气泡。</li>
		<li>将含有图案化模具和未固化 PDMS 的培养皿置于 85 °C 加热板上，加热 2–3 小时，使 PDMS 固化。</li>
		<li>小心地将固化的 PDMS 从图案化硅片上剥离，暴露出具有软光刻图案的 PDMS 复制品微流控模具。</li>
		<li>将图案化 PDMS 与载玻片倒置放入高功率等离子清洗机中，并通入空气。在 200 mTorr 和 45 W 条件下施加等离子体处理 90 秒，使 PDMS 与载玻片键合，形成最终的微流控芯片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶微粒的合成
	<ol>
		<li>通过将 NIPAM（4.5 g）、丙烯酸（0.5 g，占总单体 15 mol%）、巯基乙酸（TGA，80 µL）和 2,2-偶氮二异丁酸二甲酯（AIBME，0.056 g）溶解于 20 mL 无水乙醇中，随后按照步骤 1.4–1.14 完成合成，但将步骤 1.5 中的反应温度改为 56 °C，制备出酰肼功能化的 PNIPAM（PNIPAM-Hzd）。</li>
		<li>通过将 NIPAM（4 g）、N-(2,2-二甲氧基乙基)甲基丙烯酸酯（DMEMA，0.95 g，占总单体 13.4 mol%）、巯基乙酸（TGA，80 µL）和 2,2-偶氮二异丁酸二甲酯（AIBME，0.056 g）溶解于 20 mL 乙醇中，随后按照步骤 2.2.4–2.2.10 完成合成，但将步骤 2.2.5 中的反应温度改为 56 °C，制备出醛基功能化的 PNIPAM（PNIPAM-Ald）。</li>
		<li>将 PNIPAM-Hzd 和 PNIPAM-Ald 分别以 6 wt% 的浓度溶解于去离子水中，并分别装入标准的 5 mL 注射器中。</li>
		<li>将 1 wt% 的非离子表面活性剂（例如 Span 80）溶解于重质石蜡油中，并将该溶液装入标准的 60 mL 注射器中。</li>
		<li>使用内径为 1/32 英寸的硅胶管（每个入口长约 30 cm，每个出口长约 45 cm），将两种前驱体聚合物溶液的注射器分别连接至微流控芯片上的两个独立聚合物进样通道，将石蜡油溶液连接至芯片的油相进样通道。</li>
		<li>使用两台独立的推注式注射泵（一台用于喷嘴上游的油相，另一台用于喷嘴后加入的油相），在不启动聚合物流动的情况下，以 1.1 mL/h 至 5.5 mL/h 的流速向芯片中输送油相，以预润湿芯片并确保芯片无缺陷且正常运行（通常维持约 30 分钟）。</li>
		<li>使用另一台独立的推注式注射泵，以 0.03 mL/h 的流速将每种水相聚合物溶液输送至芯片中。</li>
		<li>经过初始稳定期（确保流动达到平衡并形成均匀微粒，通常为 30 分钟至 1 小时），在磁力搅拌的圆底烧瓶中收集微粒。</li>
		<li>持续收集微粒直至所有油相消耗完毕（根据流速不同，耗时 12–55 小时）。停止注射泵，若需要，可立即用水替代前驱体聚合物溶液通过芯片进行清洗。&#160; 然而，由于这些材料在流动停止后会迅速发生原位凝胶化，建议每次独立实验均使用新的芯片。</li>
		<li>关闭磁力搅拌，使凝胶微粒自然沉降。使用移液器吸除所有可分离的石蜡油。</li>
		<li>为去除残留的石蜡油，使用戊烷（每 0.5 mL 微粒体积加入 10 mL）洗涤凝胶微粒&#160;，剧烈混合乳液约 1 分钟，静置让凝胶微粒重新沉降约 1–2 小时，再用移液器吸除残余有机相。重复此步骤至少 5 次，以确保完全去除石蜡油。</li>
		<li>将凝胶微粒&#160;重悬于 20 mL 玻璃闪烁瓶中的 10 mL 去离子水中，并通入氮气过夜，以去除任何残留的戊烷。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 腙键交联纳米凝胶的制备
<ol>
	<li>将PNIPAM-Hzd（1 w/v%）和PNIPAM-Ald（1 w/v%）的储备溶液溶解于去离子水中。PNIPAM-Hzd和PNIPAM-Ald的制备方法分别如4.2.1节和4.2.2节所述。</li>
	<li>在20 mL玻璃闪烁瓶中，将5 mL PNIPAM-Hzd储备溶液置于油浴中磁力搅拌（350 RPM），加热至70˚C。 
	注意：溶液应变为不透明（即温度超过PNIPAM-Hzd的低临界溶解温度），但不应形成可见沉淀。</li>
	<li>将0.25 mL的PNIPAM-Ald（质量为种子溶液中PNIPAM-Hzd的5–20 wt%）在5–10秒内逐滴加入加热的PNIPAM-Hzd溶液中。</li>
	<li>继续在闪烁瓶中混合溶液15分钟，随后将样品从油浴中取出，静置过夜使产物冷却至室温。</li>
	<li>将所得纳米凝胶使用3500 kDa截留分子量的透析膜，对去离子水进行6次、每次6小时的透析，以去除未交联的聚合物。如需要，可进行冻干保存。</li>
</ol>
6. 腙键交联纳米纤维的制备
<ol>
	<li>通过将37 mg偶氮二异丁酸二甲酯（AIBMe）、4.0 g甲基丙烯酸寡乙二醇酯（OEGMA475，475 g/mol，n=7-8个环氧乙烷重复单元）和0.25 g丙烯酸（AA）溶解于20 mL二氧六环中，并按照步骤1.3–1.14完成合成，制备肼基功能化的POEGMA（POEGMA-Hzd）。</li>
	<li>通过将50 mg偶氮二异丁酸二甲酯（AIBMe）、4.0 g甲基丙烯酸寡乙二醇酯（OEGMA475，475 g/mol，n=7-8个环氧乙烷重复单元）和0.60 g甲基丙烯酸-N-(2,2-二甲氧基乙基)酯（DMEMA）溶解于20 mL二氧六环中，并按照步骤2.2.3–2.2.10完成合成，制备醛基功能化的POEGMA（POEGMA-Ald）。</li>
	<li>将POEGMA-Hzd（15 wt%）和POEGMA-Ald（15 wt%）分别溶于去离子水中，配制成溶液。</li>
	<li>将聚环氧乙烷（PEO，Mw=600×103 g/mol，5 wt%）溶于去离子水中。&#160; 取1 mL PEO溶液，分别与步骤6.3中制备的两种反应性POEGMA溶液混合，得到最终前驱体溶液，其中POEGMA前驱体聚合物浓度为7.5 wt%，PEO浓度为2.5 wt%。</li>
	<li>将上述两种溶液分别装入第3节所述的双筒注射器的两个筒中（同时包含1.5”静态混合器），并将该双筒注射器安装至推注式注射泵上。</li>
	<li>将静态混合器和18G钝头针连接至双筒注射器。</li>
	<li>将高压电源连接至钝头针，收集端接地。 
	注：收集装置可采用10 mm × 10 mm的铝箔片，或直径约10 mm、以200 rpm转速旋转的铝盘，两者均垂直固定于针尖前方，距离针尖末端10 cm。</li>
	<li>启动注射泵，流速设为0.48 mL/h，同时施加8.5 kV高压，进行静电纺丝以制备纳米纤维。</li>
	<li>根据需要持续进行静电纺丝，以制备不同厚度的支架，或直至进样溶液耗尽。</li>
	<li>为去除静电纺丝辅助剂PEO，将收集的支架浸泡于去离子水中24小时。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

我们已成功将所有这些制备技术应用于多种聚合物体系，所用方法仅在上述关于PNIPAM和POEGMA的详细描述基础上做了轻微调整；然而，使用这些方案的研究人员必须意识到，当替换为其他聚合物时，可能会出现潜在问题。特别是，前驱体聚合物黏度的增加可能对加工性能（尤其是在微流控方法中）以及两种前驱体聚合物的混合效率产生负面影响。此外，必须根据目标形貌控制聚合物的凝胶化速率，以避免过早凝胶化，因为过早凝胶化会阻碍流动或阻止反应性预聚物之间的相互扩散，而这种扩散对于形成所需的均匀凝胶结构至关重要。每种策略的具体局限性，以及我们为应对这些局限性而在不同制备尺度上所采用的改进方法，将在下文详述。
通过双筒注射器共挤出法制备块状水凝胶 
凝胶时间是控制双筒注射器技术以形成块状水凝胶的关键变量。若聚合物在接触后过快发生凝胶化（&#60;1–2 秒），可能会堵塞静态混合器，导致流动完全停止，或使两种前体聚合物以非化学计量比例被挤出。我们发现，采用该技术时，凝胶时间大于&#62;5 秒较为理想（尽管并非必需）；若需重复制备用于物理或力学分析的水凝胶，这一点尤为重要，以确保每一块所制备的水凝胶具有相同的组成。通过改变一种或两种前体聚合物上反应性官能团的密度（官能团密度越低，凝胶化越慢），或改变用于形成凝胶的前体聚合物的浓度（浓度越低，凝胶化越慢），可方便地调节凝胶时间21。另外，将凝胶反应对中的亲电基团由（较活泼的）醛基替换为（较不活泼的）酮基，可在不显著改变最终水凝胶组成的情况下显著延长凝胶时间35；使用醛基与酮基单体前体混合物制备的聚合物，可在不改变前体聚合物浓度（从而不改变所形成凝胶中固体质量百分比）的前提下，按需调节凝胶时间。
我们还需指出，首次浇铸的水凝胶性质并不总是与后续浇铸的水凝胶相同，这一现象归因于双筒注射器中两筒内容物实际到达静态混合器的速率存在微小差异。因此，我们通常在开始浇铸过程之前，先通过挤出少量（&#60;0.3 mL）凝胶来预润双筒注射器，以尽量减少此类变异性。最后，尽管在使用寡聚合成预聚物时通常不会出现问题，但一种或多种前体聚合物溶液的黏度在此技术中可能带来挑战，这既体现在通过简单的拇指按压推动液体流动的难易程度，也体现在静态混合器内有效混合的实现上。然而，令人稍感意外的是，即使黏度差异显著的前体聚合物溶液，仍可利用部件清单中所述的静态混合器附件形成相对均一的水凝胶（例如，高分子量碳水化合物与PNIPAM26），这表明由于黏度不匹配导致混合效率低下的担忧至少在宏观尺度上可能并不显著。如有需要，可使用注射泵（代替拇指）驱动液体流动，和/或在出口处使用更大规格的针头，以克服此类系统中与可挤出性相关的问题。
通过反应性微流控技术制备微尺度水凝胶 
采用微流控方法制备凝胶微粒的关键步骤是用两种反应性聚合物对微流控芯片进行预润。如果两种聚合物以不同的压力或流速进入芯片，压力差可能导致一种前体聚合物溶液倒流至另一种前体聚合物的储液池（或至少向储液池方向回流）。这将导致在微粒形成区域上游发生凝胶化，从而有效阻塞流道，最终需要废弃芯片。在每个储液池与混合点之间设计的曲折通道可显著增加倒流阻力；然而，即使经验丰富的操作人员，也偶尔会在稳定流动状态建立之前就导致芯片内发生凝胶化。根据我们的经验，在液滴形成启动后通常需要1–2分钟才能使流动趋于稳定（在此期间会产生相对多分散的凝胶微粒）；若在运行最初的5–10分钟内未出现任何问题，则通常可实现连续数小时的单分散微粒生产。使用黏度相对匹配的前体聚合物，以及具有非瞬时凝胶化时间（至少&#62;15秒为宜）的体系，将极大有助于避免此类问题，并促进稳定流动的形成。
请注意，使用该芯片设计已测试了水相流速范围为0.01–0.1 mL/h、油相流速范围为1.1–5.5 mL/h的多种条件，根据流动聚焦结处施加的剪切力，可制备出尺寸约为25–100 µm的微粒；流速越快，剪切力越高，形成的微粒越小31,32。在保持总水相流速较低（约0.03 mL/h，如本方案所述）的同时调节油相流速，被证明是控制凝胶微粒尺寸最有效的方法，且不会损害微粒的单分散性或芯片使用寿命；而当总水相流速处于上述范围较高值时，二者均被观察到显著下降。使用更高的油相流速（&#62;5.5 mL/h）以生成更小微粒是可行的，但会增加芯片脱层的风险（这是等离子键合PDMS微流控芯片常见的局限性）。采用其他方法键合芯片可能实现更高的流速，从而生产更小的凝胶微粒，该策略目前正在探索中。减小喷嘴尺寸也可能有助于缩小可制备微粒的尺寸，但会增加微粒形成前发生过早凝胶化的风险。较低的流速往往导致流动不稳定，从而引起更高的多分散性以及芯片内凝胶化风险增加；这一局限性可通过使用多通道微流控流量控制系统来克服，该系统相比本方案中使用的标准注射泵具有更高的稳定性和分辨率。
油的选择对本方案的成功至关重要，因为较重的油虽然在防止收集后凝胶微粒聚集方面具有优势，但在喷嘴处形成的颗粒一致性明显低于本方案中报道的轻质硅油。我们推测，这种可重复性的降低是由于较重油类在注射器泵送过程中流动性较差，导致混合点处剪切力更加不稳定所致。在收集瓶中避免凝胶微粒聚集也是一个挑战，特别是在微流控装置出口处刚流出时尤为明显 原位 凝胶化未完全完成，导致大量可反应的官能团仍可参与形成在收集液中碰撞颗粒之间的交联桥。该问题可通过以下方式解决：增加微流控芯片出口通道的长度，使凝胶微粒在层流中停留更长时间，以促进更充分的凝胶化；在喷嘴后增加侧通道以向芯片中补充更多油相，从而在混合后通道中更好地分离凝胶微粒，同时不影响喷嘴处的剪切场或颗粒生成速率；并在收集瓶中加入磁力搅拌器，以防止凝胶微粒沉降，维持相邻颗粒之间较大的平均间距。尽管凝胶化速度极慢的聚合物可能提高装置稳定性并减少灌注相关问题，但此类体系也被发现显著增加凝胶微粒聚集的风险，因为在较长时间内仍有大量反应性官能团未参与反应（因而仍可形成颗粒间交联桥）。因此，凝胶化时间在15–60秒范围内对该技术而言最为理想：足够缓慢以实现顺利灌注，又足够快速以确保在凝胶微粒离开层流通道进入收集瓶之前，绝大多数反应性官能团已被消耗。
最后，去除模板油至关重要，以确保所得微粒保持基于所添加预聚物组成而预期的智能特性，并使这些微粒能够在生物医学背景下使用。所描述的戊烷洗涤程序在常规凝胶微粒制备中对此具有高度有效性。然而，将该技术直接应用于生物医学场景（例如，芯片上细胞包封）时，需对该方案重新评估。我们还探索了使用橄榄油作为分散剂，据建议橄榄油在接触细胞时具有更高的惰性36。尽管能够实现微粒形成，但至少在当前芯片设计下，所得凝胶微粒群体的多分散性显著高于使用矿物油所获得的结果。因此，尽管该芯片似乎可适用于合成聚合物和天然聚合物凝胶微粒的制备31，但若要将该技术更广泛地应用于所有可能的材料组合，可能需要修改芯片设计。
通过反应性自组装制备纳米级水凝胶 
纳米凝胶的制备已采用多种加工条件实现，包括不同浓度的种子聚合物（0.5–2 wt%）、不同的交联剂与种子聚合物比例（0.05–0.2）、不同的温度（40–80 °C）、不同的搅拌速度（200–800 rpm），以及在加入交联聚合物后不同的加热时间（2–60 min）28。在浓度方面，所观察到的趋势通常符合预期：较高的种子聚合物浓度导致形成更大的纳米凝胶，而较高的交联剂与种子聚合物比例则导致纳米凝胶具有更高的交联密度，因而热响应性更低。需要强调的是，若种子聚合物浓度过高，最终会导致宏观聚集而非纳米级聚集，这与传统自由基沉淀法制备热响应性纳米凝胶中观察到的现象一致3。较短的加热时间也有利于形成更小且单分散性更高的颗粒。我们推测，在高于任一前体聚合物低临界溶解温度（LCST）的条件下延长纳米聚集体的保温时间，会增加纳米凝胶碰撞时发生聚集的概率；随着交联程度的提高，腙键相对于前体醛基或肼基官能团表现出更强的疏水性，进一步促进了这种聚集。从工艺角度而言，较短的加热时间更具优势，因为在加入交联聚合物后仅需2分钟即可形成单分散的纳米凝胶群体；而10分钟则是能够持续获得单分散纳米凝胶的最长加热时间，同时还能生成交联程度更高的纳米凝胶。有趣的是，该方法对混合条件表现出显著的不敏感性，在不同搅拌速度下甚至在放大至更大体积时，所得颗粒尺寸及粒径分布几乎完全相同。尽管最初对该结果感到意外，但这很可能说明了热力学在调控纳米凝胶生成过程中的主导作用。
为了获得低多分散性，纳米聚集体的胶体稳定性和水合程度似乎是关键变量。例如，使用亲水性更强的、带有酰肼官能团的聚合物作为种子，相较于使用亲水性较弱的、带有醛基官能团的聚合物，所制备的纳米凝胶具有显著更低的多分散性。实验组装温度与种子聚合物低临界溶解温度（LCST）之间的差异也至关重要。在略高于种子聚合物LCST的温度下操作（(T - LCST) &#60; 5 °C），最有利于形成单分散纳米凝胶；而在远高于LCST的温度下操作，会导致形成更疏水且更紧密的纳米聚集体，容易发生聚集且难以交联；而在低于LCST的温度下操作，则会形成相对松散的种子聚合物，无法实现有效或可重复的交联。为了最佳预测颗粒的单分散性，我们建议首先进行紫外/可见光谱扫描，测定种子聚合物的起始LCST，随后在该LCST以上1–2 °C的温度下进行自组装过程。
需要注意的是，采用此方法制备的纳米凝胶可以冻干并重新分散，且胶体稳定性不发生任何变化，而自组装结构通常难以实现这一点，我们认为这归因于我们所采用的交联稳定方法。我们还预计，该方法仅需种子聚合物具有温敏性即可实现；若使用对其他刺激无响应或可响应的交联聚合物，可能会进一步拓宽该技术的最终应用范围。最后，由于在此情况下两种反应性前体聚合物的混合是被动而非主动的，因此相对于其他所述的制备策略，凝胶化时间在工艺控制中的重要性大大降低。然而，即使在此技术中，仍将总交联时间保持在&#60;30 min 仍为理想条件，以尽量降低颗粒聚集的风险。
通过反应性静电纺丝制备纳米纤维水凝胶 
控制反应性预聚物的凝胶化时间对于成功制备凝胶纳米纤维至关重要。具体而言，精确调控前驱体聚合物在静态混合器中的停留时间（通过调节双筒注射器的流速以及静态混合器的长度和曲折程度）与前驱体聚合物的整体凝胶化时间相匹配，对于保持可纺性以及确保纺出的纤维在针头与收集器之间有效交联均十分关键。凝胶化过快会导致泰勒锥形成不良，从而降低可纺性；而凝胶化过慢则会使到达收集器的仍为水溶液而非凝胶，导致液体铺展，最终形成薄膜状凝胶而非纳米纤维。研究发现，在略短于整体凝胶化时间的停留时间下操作同样有效（并且更优，可降低针头堵塞的风险），因为在溶液被纺出的过程中水分不断蒸发，使射流中的前驱体聚合物得以浓缩，从而在纺丝过程中加速了凝胶化动力学。同理，在较高针头-收集器距离（&#62;10 cm）下操作通常更有利于该过程，因为较短的距离会减少水分蒸发所需的时间，因而需要对停留时间与凝胶化时间之间的关系进行更严格的控制，才能维持纳米纤维结构的形成。
请注意，在本方案中使用聚环氧乙烷（PEO）或其他高分子量且易于电纺的聚合物对于促进纳米纤维的形成至关重要，因为短链且高度支化的POEGMA低聚物自身无法达到足够的链缠结程度以实现电纺；相反，在所有测试的仅含POEGMA的配方中，均出现电喷现象（尽管该现象也可用于利用相同化学方法制备可降解凝胶颗粒）。为维持完全的纳米纤维形态，PEO的最低浓度需为1 wt%（分子量1 MDa）。需注意的是，PEO可通过简单的浸泡程序（去离子水，24小时）从纤维中去除，而不会破坏纳米纤维网络的完整性；因此，PEO更多地充当临时的电纺辅助剂，而非最终纳米纤维产品的必需组分。还需注意，可结合本技术使用多种类型的收集器，包括简单的铝箔（用于制备在浸泡后可从收集器上剥离的薄层水凝胶）以及旋转铝盘（用于制备较厚的支架），前提是控制凝胶速率、电纺速率以及电纺过程中水分蒸发速率的其他工艺参数保持不变。
有趣的是，根据制备不同形貌所采用的方法，由相同水凝胶前体材料制备的水凝胶在降解时间上表现出显著差异。例如，尽管POEGMA纳米纤维水凝胶具有明显更大的比表面积，因而更有利于水接触并水解腙键，其降解速度仍慢于相同组成的块体POEGMA水凝胶。我们将这些差异归因于所述不同制备方案在前体聚合物混合几何构型上的固有差异，这可能导致水凝胶内部结构均一性及/或微观形貌存在显著不同，和/或 原位 聚合物前体浓度在凝胶化相同时段内的变化，尤其在电纺丝过程中具有重要意义，因为该过程同时伴随着水分蒸发和交联现象。尽管这可能在每种方案中指定使用特定聚合物时略微增加前体选择的复杂性，但也可能带来技术上的机遇，即可制备化学组成相同但物理性质差异显著的水凝胶。
总体而言，所述方法提供了一种在多个尺度（宏观、微米和纳米）以及多种内部结构（颗粒或纤维）上制备可降解（或至少可经肾清除）的温敏性聚合物类似物的策略。这些方案解决了传统合成温敏性材料成功转化为生物医学应用中的关键障碍：可注射性和可降解性。我们正在持续探索此类材料在药物递送和组织工程中的应用，包括癌症的物理靶向、药物穿越血脑屏障的运输、眼部后段蛋白质的治疗性递送、组织的定向生长，以及细胞的温控可逆黏附与分化等多种应用。

智能材料因其对外部和/或环境信号具有可逆的“按需”响应潜力而受到广泛关注。其中，温度响应性材料因其具备较低临界溶解温度（LCST）行为而备受关注，该特性导致材料在温度 T 高于 LCST 时发生温度驱动的沉淀现象。&gt;LCST1,2在温敏性水凝胶的背景下，这种低临界溶解温度行为表现为可逆的溶胀/去溶胀现象，从而导致整体尺寸随温度变化而调节（在温度低于 LCST 时尺寸较大，高于 LCST 时尺寸较小）。&lt;LCST3，孔径大小（在T处较大）&lt;LCST4，以及界面性质（在T时更亲水）&lt;LCST5此类转变已广泛应用于药物递送（用于外部或环境触发的药物释放）4,6,7），组织工程与细胞培养（用于热响应性细胞黏附/剥离）8,9,10），分离（用于可切换膜孔隙度和渗透性的膜或可热回收诊断载体）11,12,13），微流控过程（用于控制流体通断的阀门）14,15），以及流变改性剂（用于温度可调的黏度）16）。最常被研究的温敏性水凝胶基于聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）17，尽管在聚(低聚乙二醇甲基丙烯酸酯)（POEGMA）上也已开展了大量（且日益增多）的研究工作2,18 和聚乙烯基己内酰胺（PVCL）19,20. POEGMA 因其预期具有更优的生物相容性而受到近年来的特别关注21,22及其易于调控的低临界溶解温度（LCST）行为，其中侧链中含不同数量乙氧基重复单元的单体以线性可预测的比例混合，可使LCST从约~20 °C 至 &gt;90 °C2,23然而，这些聚合物均通过自由基聚合制备，因而具有碳-碳主链，这在很大程度上限制了其在生物医学应用中的潜在用途和可转化性，而在生物医学应用中，降解性（或至少具备通过肾小球滤过清除的能力）通常是必要条件。
针对这一局限性，我们近期已广泛报道了腙化学在以下方面的应用（即，利用酰肼与醛基化预聚物之间的反应）制备可降解的温敏性水凝胶类似物24,25,26,27,28,29酰肼基团与醛基在混合功能化前体聚合物时发生的快速且可逆的反应30 使两者均能够 原位 凝胶化（使得这些材料能够便捷注射，无需外科植入或任何外部聚合刺激，如紫外照射或化学引发），以及网络结构通过交联位点的化学性质和密度控制其水解降解速率。此外，通过将用于制备水凝胶的预聚物分子量保持在肾滤过阈值以下，采用此方法制备的水凝胶可降解为寡聚体前体聚合物，从而可被机体清除25,27,28. 结合这些材料所引起的低细胞毒性和低炎症组织反应25,26,27该方法为热响应型智能水凝胶在医学领域的应用提供了一种具有潜在可转化性的途径，特别是若能在所有尺度（宏观、微米和纳米）上制备出性能可控的可降解类似物水凝胶时。
在本实验方案中，我们描述了合成具有可控数量酰肼基和醛基官能团的热响应性预聚物的方法，以及利用这些预聚物在不同长度尺度上制备具有明确尺寸的水凝胶的方法。具体而言，本文介绍了我们开发的四种不同的方法，用于控制反应性酰肼基和醛基官能化预聚物的混合，从而形成具有明确几何结构和形貌的热响应性水凝胶网络：
为了制备具有确定尺寸的可降解块状水凝胶，本文描述了一种模板化策略：将反应性预聚物分别装入双筒注射器的两个独立筒腔中，该注射器出口端连接静态混合器，随后共挤出至具有目标水凝胶形状和尺寸的硅胶模具中21,27（图1）。
<img alt="原位凝胶化水凝胶合成过程；酰肼、醛基聚合物；交联示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：块体水凝胶形成的示意图。 将酰肼和醛基功能化的聚合物溶液（溶于水或水性缓冲液中）分别装入双筒注射器的两个腔室中，然后通过静态混合器共挤出至圆柱形硅胶模具中。迅速 原位 混合后发生凝胶化，形成腙键交联的水凝胶，根据前体聚合物的浓度和官能团密度，可在数秒至数分钟内自支撑（脱模后）。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
为制备微米尺度的可降解凝胶颗粒，本文描述了一种反应性微流控方法，该方法采用基于软光刻模板的微流控芯片设计，同时混合并乳化前体聚合物溶液，从而形成可进一步交联成胶的混合反应性聚合物液滴。 原位 形成由乳液模板决定尺寸的凝胶微粒（图2)31,32.
<img alt="用于聚合物液滴形成的微流控芯片示意图，显示醛基、肼基入口及液滴结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过反应性微流控技术形成凝胶微粒的示意图。 （A，B）将含肼基和醛基官能化的聚合物溶液（溶于水或水性缓冲液中）通过注射泵分别注入两个独立的储液池，这些储液池在下游通过一系列之字形通道相连，该通道设计用于建立压力梯度以防止回流。随后，聚合物溶液在进入喷嘴前被来自两侧的石蜡油（同样由注射泵驱动）剪切并混合，从而在连续的石蜡油相中通过流动聚焦方式生成水相（聚合物溶液）液滴（参见（B）中喷嘴区域及液滴形成过程的示意图）。在喷嘴后方设有另外两个石蜡油入口，以进一步在收集通道中分离液滴，确保在微粒离开层流前完成完全凝胶化；最终形成的微凝胶颗粒被收集于一个磁力搅拌的烧杯中；（C）喷嘴处液滴生成过程的照片（注意：肼基聚合物以蓝色标记以示混合情况）
为了制备可降解的纳米级凝胶颗粒，本文描述了一种热驱动的反应性自组装方法：将一种反应性前体聚合物（“种子”聚合物）的溶液加热至其低临界溶解温度（LCST）以上，形成稳定的纳米聚集体，随后通过加入互补的反应性前体聚合物（“交联”聚合物）实现交联；所得到的腙键交联纳米凝胶的尺寸由该纳米聚集体直接模板化决定（图3）28。
<img alt="酰肼聚合物加热示意图；形成纳米聚集体，加入醛基形成纳米凝胶。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过热驱动反应性自组装形成纳米凝胶的示意图。 含有（温敏性）酰肼功能化聚合物的水溶液被加热至其低临界溶解温度以上，形成稳定的未交联纳米聚集体。随后加入醛基功能化聚合物，通过腙键的形成对纳米聚集体进行交联，从而在冷却至低临界溶解温度以下时稳定纳米凝胶颗粒。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了制备可降解的纳米纤维，本文描述了一种反应性静电纺丝技术，该技术使用带有静态混合器（用于制备块状水凝胶）的双筒注射器，并将其出口端连接至标准的静电纺丝装置（图4）33。
<img alt="使用注射泵、纤维收集、腙键形成和扫描电镜观察纤维网络的静电纺丝过程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：通过反应性静电纺丝形成水凝胶纳米纤维的示意图。 将装有静态混合器的双筒注射器（装载方式与块体水凝胶相同，同时加入一定比例的高分子量聚环氧乙烷作为静电纺丝助剂）安装在注射泵上，注射器末端的针头连接高压电源。在纤维纺丝过程中同步发生腙键交联反应，因此当射流到达收集器（铝箔或旋转铝盘）时，纳米纤维形貌得以保持。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本方案以PNIPAM或POEGMA作为目标聚合物，展示了构建可降解智能水凝胶网络的此类方法的应用；然而，所述基本方法可推广至任何水溶性聚合物，但需根据预聚物的黏度（在自组装纳米凝胶制备方法中还需考虑预聚物形成种子纳米聚集体的稳定性）进行适当调整。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,2-偶氮二异丁酸二甲酯</td><td>Wako Chemicals</td><td>101138</td><td></td></tr><tr><td>二乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（M(EO)2MA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447927</td><td>188.2 g/mol，n=2 个环氧乙烷重复单元</td></tr><tr><td>低聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（OEGMA475）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>475 g/mol，n=8-9 个环氧乙烷重复单元</td></tr><tr><td>丙烯酸（AA），99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>巯基乙酸（TGA），98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3758</td><td></td></tr><tr><td>二噁烷，99%</td><td>Caledon Labs</td><td>360481</td><td></td></tr><tr><td>氮气，超高纯级</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz1 765A-44</td><td></td></tr><tr><td>己二酸二酰肼（ADH），98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15119</td><td></td></tr><tr><td>N'-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺（EDC，x%）</td><td>Carbosynth</td><td>FD05800</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl），37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH），97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>氨基乙酰醛二甲基缩醛，99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>121967</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基-TEMPO，97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酰氯，97x%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523216</td><td></td></tr><tr><td>石油醚，95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32047</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁，99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>叔丁基甲醚，&gt;99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443808</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>BioShop</td><td>PBS405.1</td><td>1×，pH 7.3–7.5</td></tr><tr><td>N-异丙基丙烯酰胺，99%</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>258717</td><td>从60%正己烷/40%甲苯中重结晶</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>司盘80（Span 80）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6760</td><td></td></tr><tr><td>重石蜡油</td><td>Caledon Labs</td><td>1326197</td><td></td></tr><tr><td>戊烷，试剂级</td><td>Caledon Labs</td><td>1/10/7800</td><td></td></tr><tr><td>聚环氧乙烷，平均Mv 600,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;合成与水凝胶制备所需耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Heidolph</td><td>G3</td><td></td></tr><tr><td>透析袋（截留分子量3500 Da）</td><td>Spectrum Labs</td><td>28170-166</td><td>体积/长度 = 6.4 mL/cm</td></tr><tr><td>双筒注射器</td><td>Medmix</td><td>L系列</td><td>L系列，2.5 mL，1:1体积比</td></tr><tr><td>静态混合器</td><td>Medmix</td><td>L系列</td><td>L系列，2.5 mL，1:1体积比，1.5&quot;长度</td></tr><tr><td>硅橡胶片，1/16&quot;厚</td><td>McMaster-Carr</td><td>9010K12，30A硬度（超软）</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS Legato 200</td><td>仅输注双注射泵</td></tr><tr><td>高压电源</td><td>Spellman</td><td>230-20R</td><td>0至20 kV</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微流控芯片制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>University Wafer</td><td>2080</td><td>直径 = 76.2 mm；厚度 380 &amp;micro;m；P型掺杂；&amp;lt;100&gt;晶向&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SU-8 100</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>定制2.5&quot;匀胶机</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>掩膜对准器</td><td>KARL SUSS</td><td>MJB3 UV400（配备276 W灯）</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 13 硅胶管</td><td>Cole Parmer</td><td>OF-96400-13</td><td>过氧化物固化</td></tr><tr><td>Dow Corning Sygard 184 硅弹性体基础组分&amp;nbsp;</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sygard 184 硅弹性体固化剂&amp;nbsp;</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>高功率等离子清洗机&amp;nbsp;</td><td>Harrick</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;表征仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 微机械测试仪</td><td>Biomomentum</td><td>LB007-EN</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 组织培养12孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>12孔板细胞培养插件</td><td>Corning</td><td>08-771-12</td><td>孔径 8 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus BX51 光学显微镜</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>温控显微镜载物台</td><td>Linkam Scientific</td><td>THMS600</td><td></td></tr><tr><td>凝胶渗透色谱仪（GPC）</td><td>Waters</td><td>590 HPLC 泵</td><td>Waters Styragel 色谱柱（HR2、HR3、HR4；30 cm × 7.8 mm（内径）；5 µm 粒径），Waters 410 折光指数检测器</td></tr><tr><td>动态光散射（DLS）</td><td>Brookhaven</td><td>90Plus 粒径分析仪</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>TEMSCAN</td><td>JEOL 1200EX</td><td>加速电压 100 kV</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>Tescan</td><td>Vega II LSU</td><td>加速电压 10 kV</td></tr><tr><td>Microsquisher</td><td>CellScale 生物材料测试系统</td><td>MS-50M-01</td><td></td></tr></tbody></table>

通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

尽管已探索了多种智能材料用于各种生物医学应用（例如药物递送，组织工程，生物成像 等等。），大多数智能材料缺乏与生物学相关的降解特性，这限制了它们最终的临床应用。这一问题在温度响应性水凝胶中尤为突出，因为这类水凝胶几乎普遍基于功能上不可降解的聚合物。例如，聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）或聚(低聚乙二醇甲基丙烯酸酯)（POEGMA)）。因此，为了有效将温敏性水凝胶的潜力转化为远程控制或代谢调控药物递送、具有可调细胞-材料相互作用的细胞支架、兼具成像与药物递送功能的诊疗材料以及其他类似应用，亟需一种方法，使这些水凝胶（即使不能完全降解）至少在材料完成其预期寿命后具备经肾清除的能力。为此，本实验方案描述了基于酰肼与醛基功能化PNIPAM或POEGMA寡聚物之间反应制备可水解降解的腙键交联水凝胶的方法，所用寡聚物的分子量低于肾小球滤过阈值，从而可在多个尺度上实现可降解水凝胶的构建。具体而言，本文介绍了制备可降解温敏性块体水凝胶（采用双筒注射器技术）、水凝胶微米/纳米颗粒（微米尺度通过微流控平台实现前驱体聚合物的同步混合与乳化，纳米尺度则通过热驱动自组装与交联方法）以及水凝胶纳米纤维（采用反应性静电纺丝策略）的方法。在各种情况下，均可获得与传统自由基交联方法相似的温度响应特性，但腙键交联网络可随时间降解，重新释放出寡聚前驱体聚合物，从而实现体内清除。因此，我们预期这些方法（可广泛适用于任何合成水溶性聚合物，而不仅限于智能材料）将有助于推动合成型智能材料向临床应用的转化。

将大块水凝胶从双筒注射器挤出至硅胶模具中，可形成与模具尺寸一致的结构，并在脱模后成为自支撑材料；凝胶化通常在共挤出后数秒至数分钟内发生，具体时间取决于所用的聚合物前体。通过溶胀性能（使用细胞培养插件通过重量法测量，便于将水凝胶从溶胀溶液中取出）、热响应性（采用相同技术，但将孵育温度在相变温度上下循环）、降解性（采用相同技术，但在更长时间内进行）以及剪切或压缩模量（使用厚度为2 mm、直径为7 mm的模制样品测量）等常规表征方法，可证明水凝胶性能的可调控性，其响应特性取决于前体聚合物的化学组成（特别是对于POEGMA，取决于用于制备水凝胶的短链与长链OEGMA单体的比例）、前体聚合物上功能基团的摩尔分数，以及这些前体聚合物的浓度（图5）27。
微流控技术可形成尺寸为25–100 µm、尺寸均一的凝胶微粒，其粒径可通过调节油相和/或混合水相聚合物的流速进行控制（图6A）31。热台光学显微镜证实，该凝胶微粒保留了整体水凝胶的热响应特性，表现出可逆的温度依赖性溶胀-去溶胀行为，在第1次循环中仅有轻微滞后现象（可归因于塌缩状态下相邻酰胺基团之间形成的不可逆氢键34），这与整体PNIPAM水凝胶中观察到的现象一致（图6B）32。此外，凝胶微粒随时间推移可降解为寡聚前体，从而实现肾清除（图6C）32。
在加热溶液中，由酰肼功能化的PNIPAM聚合物通过纳米聚集驱动自组装，随后与醛基功能化的PNIPAM聚合物交联，可形成粒径分布在180–300 nm、多分散性极低（&lt;0.1）的均一纳米凝胶，具体尺寸取决于所采用的工艺条件（图7A）28。这些纳米凝胶保留了传统自由基交联PNIPAM纳米凝胶典型的温敏响应特性；随着交联聚合物添加量的增加，热致收缩程度有所降低（图7B）。纳米凝胶可经冷冻干燥后重新分散，且粒径不发生变化（图7C），并在储存过程中通过水解逐渐降解，重新生成用于制备纳米凝胶的寡聚前体聚合物（图7D）。
反应性静电纺丝可形成纳米纤维水凝胶结构（图8A），其纳米纤维直径可达约300 nm量级，且无可见的电喷颗粒存在33。将基于POEGMA的纳米纤维浸泡于水中后，可实现快速水合（水合速率比相同组成的块状凝胶快约两个数量级，图8B），在生理条件下可维持纳米纤维形态达8至10周，之后发生水解降解；在酸催化环境中降解更快，这符合预期，因为酸催化可能促进腙键的断裂（图8C）。该纳米纤维结构在干燥和溶胀状态下均具有良好的机械稳定性，经过多次循环仍能保持完整，便于操作并可承受反复拉伸（图8D）。
<img alt="聚合物网络形成过程，附弹性模量图谱与含水量分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：的性质 原位-可凝胶化块状可降解热响应性水凝胶 （A）不同摩尔百分比OEGMA掺入量下POEGMA凝胶网络的代表性微观结构及块状水凝胶图像，及其相应的凝胶时间475 前体聚合物中的；（B-C）PO的储能模量100 通过改变（B）前体聚合物浓度和（C）每种前体聚合物中官能团的摩尔百分比；（D–F）POEGMA水凝胶的理化性质随OEGMA的变化关系475 摩尔百分比结合量：（D）储能模量，（E）在1 M HCl中的降解曲线，以及（F）在20–60 °C温度变化范围内的体积相变温度60 °C所有误差线均表示 n=4 次重复测量的标准偏差。改编自参考文献27 经爱思唯尔许可。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="粒径比较、显微镜图像、不同流速、温度、反应时间、数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：基于反应性微流控技术制备的可降解凝胶微粒的性质。(A) 石蜡油流速对水中（纯化后）凝胶微粒粒径的影响；(B) 纯化后的凝胶微粒在水中经历一次高于和低于体积相变温度的热循环后的热响应性；(C) 通过视觉观察（照片）和凝胶渗透色谱图（曲线图）证实凝胶微粒降解为其前体聚合物组分（此处使用1 M HCl以在成像时间尺度上促进加速降解）；比例尺 = 100 µm。改编自参考文献32。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米凝胶稳定性研究；A-B：流体动力学直径与温度关系图；C-D：冻干影响；E：荧光强度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7：由反应性自组装制备的可降解纳米凝胶的性质。 （A）通过动态光散射测得的不同醛基:肼基聚合物质量比制备的纳米凝胶的粒径分布（插图：透射电子显微图像，证实纳米凝胶呈球形）；（B）自组装颗粒的热敏性，作为用于制备纳米凝胶的醛基:肼基聚合物质量比的函数（来自动态光散射），误差棒表示n=4次重复实验的标准偏差；（C）冻干前后纳米凝胶无聚集现象的直观验证；（D）酸催化降解纳米凝胶的直观验证（此处使用1 M HCl，以与其他上述研究保持一致）；（E）纳米凝胶降解产物的凝胶渗透色谱图，显示其与肼基和醛基功能化前体聚合物的相似性。经参考文献28许可转载。版权所有 2015，美国化学会。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米纤维水凝胶研究；SEM图像、含水量图表及力学性能数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8：由反应性静电纺丝制备的可降解纳米纤维的性能。 （A）纳米纤维在干燥状态（左）、半浸入水中（中，薄膜）以及在水中浸泡过夜后（右，厚支架）的扫描电子显微镜图像；（B）相同组成的纳米纤维水凝胶（红色）相对于块状水凝胶（蓝色）的溶胀行为，误差条表示n=4次重复实验的标准偏差；（C）扫描电子显微镜图像（插图中为肉眼观察图像），用于追踪纳米纤维在1 M HCl中酸催化降解的过程；（D）干燥状态下（80次循环，每次循环拉伸20%）和溶胀状态下（325次循环，每次循环拉伸10%，在10 mM PBS中）静电纺丝纳米纤维水凝胶的拉伸循环性能。该图改编自参考文献33，经英国皇家化学会许可转载。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文描述了基于聚合物低聚物通过腙键交联制备可降解温敏性水凝胶的方案，适用于宏观、微观和纳米尺度，其中纳米尺度可用于制备凝胶纳米颗粒和纳米纤维。

尽管已探索多种智能材料用于各种生物医学应用（如药物递送、组织工程、生物成像等），……

本实验方案的总体目标是制备具有可控长度尺度和几何形状的可降解温敏性水凝胶。该方法有助于应对生物医学材料领域中的若干关键挑战，例如实现长期、微创的局部药物递送，构建用于组织工程的响应性支架，或设计靶向性纳米治疗剂。本技术的主要优势在于采用了一种快速的逆向生物腙化学反应，通过改变聚合物前体的混合几何构型，即可调控可降解水凝胶的尺寸与形状。这种灵活性使我们能够使用相同的起始材料制备叶酸凝胶、微凝胶、纳米凝胶以及纳米纤维。首先，分别制备约两毫升的酰肼基和醛基功能化的温敏性前体聚合物溶液，其质量浓度为5%至40%，并溶于10毫摩尔磷酸盐缓冲盐水。使用单腔注射器将前体聚合物溶液分别装入2.5毫升1:1双腔注射器的两个独立腔室中。接下来，将一个1.5英寸的静态混合器连接至一个2.5毫升的1:1双筒注射器。如需要，可在静态混合器上安装一根18或20号、1.5英寸长的针头。然后，从所需厚度的柔软硅胶橡胶片上裁切材料。大小与标准显微镜载玻片相当。使用打孔工具组在硅橡胶片上打出至少一个所需形状的孔。将硅橡胶模具放置在洁净的载玻片上，确保所有孔均被玻璃支撑。轻轻将模具按压在载玻片上以固定其位置。也可使用硅橡胶片作为背衬，以确保基底良好粘附。通过静态混合器将酰肼和醛基功能化的聚合物溶液共挤出至模具孔中，直至孔完全充满。用另一块干净的玻璃载玻片覆盖模具，静置至凝胶完成。随后移除上层载玻片，使用刮铲将水凝胶从硅橡胶模具上分离。将模具从载玻片上提起，以回收水凝胶。在实验开始前，制备用于微粒生成的微流控芯片。合成带有酰肼基和醛基功能化的聚NIPAM。首先，分别配制2毫升浓度为6%（质量分数）的酰肼基和醛基功能化聚NIPAM水溶液，溶剂为去离子水。将聚合物前体溶液分别装入两个5毫升注射器中。接着，配制150毫升浓度为1%（质量分数）的司盘-80重质石蜡油溶液，并将该溶液装入两个标准的60毫升注射器中。将四个注射器分别安装在输注式注射泵中。接着，将一段45厘米长的硅胶管连接至微流控芯片的出口。将出口管的末端放入废液容器中。将装有聚合物溶液的注射器通过30厘米长的硅胶管连接至微流控芯片的聚合物入口通道。将一个石蜡油溶液注射器通过硅胶管连接至上游油相入口通道。使用硅胶管和U形注射器接头，将另一个油相注射器同时连接至两个下游油相入口通道。将装有油注射器的泵的流速设置在每小时1.1至5.5毫升之间。以油溶液至少持续流经微流控芯片30分钟，以润洗芯片并确认芯片无缺陷。随后，以每小时03毫升的流速同时向已润洗的芯片输送两种聚合物溶液。让聚合物和油相流动平衡30分钟至1小时。为防止前体聚合物在微流控喷嘴处过早发生凝胶化，必须仔细预润管路，并同时精确启动聚合物的流动，以防止聚合物倒流进入任一聚合物储液池。一旦微流控芯片喷嘴处形成均匀的凝胶微粒，立即将微粒收集至含有活性磁力搅拌子的塑料离心管中。当油相消耗完毕后，停止注射泵和搅拌电机。待凝胶微粒在管中沉降后，用移液管吸出石蜡油。向烧瓶中每5 mL微粒加入10 mL戊烷。剧烈搅拌乳液约一分钟。静置一至两小时使颗粒沉降，然后用移液管小心倾去戊烷。至少重复此戊烷洗涤步骤五次。将洗涤后的凝胶微粒转移至一个小的玻璃闪烁瓶中。用一到两毫升去离子水重悬微粒。开始此操作前，分别配制5毫升1%的酰肼和醛基功能化聚NIPAM水溶液，溶剂为去离子水。在搅拌的同时，将 5 毫升酰肼基团修饰的聚 NIPAM 溶液加热至 70 摄氏度。观察溶液逐渐变浑浊，并确认无可见沉淀生成。随后，在 5 至 10 秒内，将 0.25 毫升醛基修饰的聚 NIPAM 溶液逐滴加入已加热的酰肼基团修饰的聚 NIPAM 溶液中。在70摄氏度下搅拌混合物15分钟。然后将混合物从油浴中取出，静置过夜，使其冷却至室温，从而得到用于纯化的纳米凝胶。将纳米凝胶混合物置于截留分子量为3500千道尔顿的透析膜中。将纳米凝胶在去离子水中透析，每六小时更换一次透析液，共透析六次，以去除未交联的聚合物。如有需要，可将纯化后的纳米凝胶冻干保存。开始制备凝胶纳米纤维时，分别配制1 mL质量分数为15%的酰肼基和醛基功能化POEGMA水溶液。然后，配制2毫升质量分数为5%的高分子量聚环氧乙烷水溶液，溶剂为去离子水。将每种POEGMA前体溶液与1毫升聚环氧乙烷溶液混合。将前体溶液分别装入双筒注射器的两个筒中。接下来，将一个1.5英寸的静态混合器和一个钝头18号针头连接至一个2.5毫升、1:1双筒注射器上。将双筒注射器安装在推注式注射泵上。然后，在针头末端10厘米处安装一个铝盘电纺丝收集器。将高压电源的收集端接地，并将电源连接至针头。将注射泵设置为0.48毫升每小时，电源设置为10千伏。同时启动注射泵和电源，开始静电纺丝。继续操作直至达到所需厚度或前体耗尽。纳米纤维制备完成后，关闭并断开静电纺丝装置。将收集到的凝胶纳米纤维浸泡在去离子水中24小时，以去除聚环氧乙烷。双筒注射器输送法制备了腙键交联的POEGMA块状水凝胶，其力学性能、凝胶时间及透明度随前体聚合物浓度、反应性官能团密度以及单体上环氧乙烷重复单元数量的不同而变化。石蜡油和聚合物前体溶液的流速影响了利用微流控装置制备的腙键交联聚NIPAM水凝胶微粒的尺寸。通过热台光学显微镜观察到材料具有可逆的温度依赖性溶胀行为。凝胶微粒随时间降解为其寡聚前体。自组装腙键交联聚NIPAM纳米凝胶的尺寸随醛基与肼基功能化聚合物前体的质量比而变化，但均保持高度单分散性。随着质量比的增加，热致收缩程度降低。与凝胶微粒类似，纳米凝胶随时间逐渐降解为寡聚前体。通过反应性静电纺丝技术制备了由腙键交联的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯（POEGMA）水凝胶纳米纤维，其直径约为300纳米。纳米纤维的水合速度比具有相同聚合物组成的块状凝胶快约两个数量级。纳米纤维在生理条件下可保持其纳米纤维形态超过八周，随后才开始降解。在酸性环境中降解速度更快。纳米纤维在干燥和溶胀状态下均具有良好的机械强度。观看本视频后，我们希望您能够充分理解如何通过控制凝胶前体聚合物的制备几何结构，来制备可降解且具有温度响应性的水凝胶。请务必确保聚合物前体的凝胶化时间符合每种颗粒的具体需求。若凝胶化过程过快，将抑制微凝胶和纳米纤维的制备。凝胶化过程过慢将导致完全凝固的形态。这些技术为药物递送和组织工程领域的研究人员提供了新的途径，并可设计出结构明确的水凝胶支架，以控制药物释放的速率或位置，或刺激组织再生。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过反应挤出、微流体、自组装和电纺丝制备多长尺度可降解 Thermoresponsive 水凝胶

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。...

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

当两种相邻的流体通过带有沟槽的微流控通道时，可被引导形成包裹预聚物核心的鞘层，从而 决定微纤维的形状和横截面。光引发聚合反应（如硫醇点击化学反应）非常适合将核心流体快速固化为具有预定尺寸和形状的微纤维。...

预设计尺寸与形状的聚合物及生物杂化纤维的微流控制备

我们提出一种制备完全由同一种基础材料——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）构成的Janus微凝胶的方案，其结构具有明显的区室化特征，基于过饱和NIPAAm单体溶液的相分离形成。所合成的Janus微凝胶表现出独特的性质，如各向异性的热响应性以及亲油/亲水性负载能力。...

合成具有各向异性热响应性及亲油/亲水负载能力的聚(N-异丙基丙烯酰胺) Janus 微凝胶

我们介绍一种利用简单工艺制备可自由组装和操作的自支撑微图案化水凝胶片的方法。利用这些模块化水凝胶片，可构建具有可控细胞微环境的简单宏观尺度三维细胞培养系统。...

用于微图案化宏观尺度三维细胞结构的模块化水凝胶片构建

本方案概述了采用图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建源自血管、具有仿生特性的微流体网络的方法。此类仿生微流体系统可应用于组织工程、组织构建 体外...

基于影像引导的激光制造血管衍生微流体网络

已开发出一种用于加工紫外光交联水凝胶的增材制造策略。该策略可实现微加工水凝胶结构的逐层组装，以及独立组件的集成组装，从而制备出包含可响应磁驱动运动部件的集成器件。...

一种用于简便快速制造含磁响应组分的水凝胶基微型机器的增材制造技术

本研究介绍了一种简单、可调且低成本的微凝胶制备方法，该方法基于挤出破碎技术，可将微凝胶加工成可注射的颗粒状水凝胶，并进一步将这些颗粒状水凝胶用作生物医学应用中的挤出式打印墨水。...

将块状水凝胶破碎并加工成颗粒状水凝胶用于生物医学应用

本文描述了利用微流控装置进行高通量明胶甲基丙烯酰基微凝胶制备的实验方案，将微凝胶转化为可再悬浮粉末（微气凝胶），通过化学组装微凝胶形成颗粒状水凝胶支架，以及开发具有保留微孔结构的颗粒状水凝胶生物墨水用于3D生物打印。...

明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

学习利用反应挤出、微流体、自组装和电纺丝技术制备可降解热响应水凝胶的方法。该方法通过控制聚合物前驱体混合几何形状，实现块体凝胶、微凝胶、纳米凝胶和纳米纤维的灵活制备，适用于药物递送和组织工程应用。

通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

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