pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内

这些体内和体外分子伴侣实验的总体目标是表征大肠杆菌分子伴侣 HdeB 在酸性 pH 条件下依赖于 pH 的活性。酸激活型分子伴侣只有一种功能，即保护蛋白质免受酸诱导的蛋白质去折叠和降解。这一功能对于肠道细菌尤为重要，因为它们若要成功定植肠道，必须能够耐受胃部的酸性环境。

本文所介绍的方法可帮助您识别和表征酸激活的分子伴侣，并确定其激活所需的 pH 条件。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外和体内对分子伴侣（如 HdeB）进行表征，从而有助于解析其激活机制。这些方法已成功应用于其他酸保护性分子伴侣（如 HDA），并可根据需要进一步修改，以适用于其他分子伴侣或应激条件。

监测纯化的 HdeB 在不同 pH 值下对热变性猪线粒体苹果酸脱氢酶聚集的影响。将苹果酸脱氢酶（MDH）在 4 摄氏度下用 4 升缓冲液 C 透析过夜。然后使用截留分子量为 30 千道尔顿的离心过滤装置将蛋白质浓缩至约 100 微摩尔。为去除聚集体，在 4 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 20 分钟。

通过在280纳米处的吸光度测定MDH浓度。然后制备50微升的MDH等分试样，并迅速冷冻以供储存。将一个1毫升的石英比色皿放入配备有温度控制样品架和搅拌器的荧光分光光度计中。

将激发波长和发射波长设置为350纳米。向比色皿中加入适量体积的预热缓冲液D，调节至所需pH值。总体积为1,000微升。

将比色皿 holder 的温度设置为 43 摄氏度。向缓冲液中加入 12.5 µM HdeB，随后加入 0.5 µM MDH。开始监测光散射。

将反应孵育 360 秒，以充分展开 MDH。加入 0.16 至 0.34 体积的 2 摩尔无缓冲磷酸二钾溶液，将 pH 升至 7，继续记录光散射 440 秒。按照文中的实验方案所述分析数据。

将表达 HdeB 的质粒或 MD 载体对照 PBAD 18 转化至 BB7224 Delta RPOH 菌株的感受态细胞中。该菌株具有温度敏感性，必须在 30 摄氏度下培养。在 42 摄氏度热激 45 秒后，涂板前将细胞在 30 摄氏度、200 RPM 条件下孵育。

对阳性克隆进行单菌落划线分离，并在30摄氏度下过夜培养。在50毫升含氨苄青霉素的LB培养基中制备过夜培养物，在200转/分钟、30摄氏度条件下培养细胞。将过夜培养物用含氨苄青霉素的25毫升LB培养基稀释40倍。

在含有0.5%阿拉伯糖的培养基中，于30摄氏度、200转/分钟条件下培养细菌，使其在600纳米处的光密度（OD 600）达到1.0，以诱导HDEB蛋白表达。进行pH shift实验时，使用含氨苄青霉素和阿拉伯糖的LB培养基将细胞稀释至OD 600为0.5，然后通过加入适量的5摩尔盐酸调节至相应的pH值。

在指定时间点后，通过加入适当体积的五摩尔氢氧化钠中和培养物。在30摄氏度下，通过OD测定监测中和后培养物及液体培养物的生长情况，持续12小时。为了体外研究HdeB分子伴侣活性的最适pH值，将天然MDH稀释至预热的、指定pH值的缓冲液中，并在有或无HdeB的条件下进行实验。

孵育360秒后，通过中和反应在43摄氏度条件下诱导MDH发生聚集。在HdeB存在的情况下，从中性化开始后，pH值从4上升时，光散射信号显著降低，表明HdeB可防止MDH的聚集。聚集测量对温度或缓冲液成分的变化非常敏感。

为了消除假阳性结果，研究了分子伴侣储存缓冲液对客户蛋白聚集的影响。HdeB 储存缓冲液对 MDH 聚集无影响。为了研究 HdeB 在体内的作用，使用温度敏感的 RPOH 缺失菌株进行了 pH 依赖性存活实验。

该菌株缺乏大多数分子伴侣，因此对高温、低pH或氧化应激更为敏感。在中性pH条件下过表达HdeB对菌株的生长速率无影响，其生长情况与携带空载体PBAD 18的对照菌株相当。相比之下，在经pH 3或pH 4处理后恢复生长的能力方面，两者表现出明显差异：与对照菌株相比，过表达HdeB的菌株在低pH处理后的恢复能力可重现地得到改善。

一旦掌握，纯化可在三天内完成，体外散射实验需一天，体内存活实验若操作得当则需两天。进行这些实验时，务必仔细考虑实验设计，包括底物蛋白的类型、其浓度以及所用缓冲液条件。该技术的主要优势在于有助于更深入地理解分子伴侣激活的机制及其在体内环境中的作用。

并且不要忘记，研究一种酸保护性分子伴侣的最适pH值可能具有相当大的挑战性。这是因为所使用的底物蛋白的聚集行为也可能随pH值的变化而改变。因此，务必选择同时适用于分子伴侣和底物蛋白的缓冲体系。

采用此方案后，可进一步开展其他方法，例如通过SCS页面进行的离心沉淀分析，以实现对分子伴侣介导的底物蛋白聚集抑制效应的自动定量分析。