Name: 从好氧颗粒污泥结构胞外聚合物的提取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习从好氧颗粒污泥中提取结构胞外聚合物的方法，通过离心、碱提取和透析等步骤分离纯化EPS，并测试其与钙离子形成水凝胶的能力。该技术有助于理解颗粒污泥形成机制。

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本研究得到了SIAM引力资助项目024.002.002、荷兰科学研究组织以及荷兰技术基金会（STW - Simon Stevin Meester 2013）的经费支持。作者感谢Mario Pronk提供颗粒污泥样品。

注：AGS 取自荷兰乌得勒支市污水处理厂的 Nereda 中试反应器。该反应器以市政污水为进水。颗粒污泥的污泥体积指数（SVI5min）为 59.5 ml/gVSS。污泥于好氧周期结束时的 4 月份采集。采样后，污泥立即被运送至实验室，经筛分后于 -20 °C 保存，待用。
1. 胞外多糖提取
注意：将颗粒污泥在 4,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟，倾去上清液。收集沉淀中的颗粒用于提取。颗粒的总固体（TS）和挥发性固体（VS）采用标准方法23测定。颗粒湿重（即直接从沉淀中取出的颗粒重量）与 TS 之间的换算系数在提取前已确定。所有提取均设三个重复。
注意：每种提取方法使用 3 g 湿颗粒。其总固体（TS）和挥发性固体（VS）含量（分别为 0.39 g TS 和 0.34 g VS），经三个重复测定，用于计算提取产率。
<ol>
	<li>离心提取11
	<ol>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至离心管中，并用去离子水定容至50 mL。</li>
		<li>用手轻轻摇晃离心管。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液至玻璃烧杯中，弃去沉淀，并按第1.7节所述继续处理上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声提取10
	<ol>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至离心管中，并用去离子水定容至50 mL。</li>
		<li>在冰上对混合物进行脉冲式超声处理2.5分钟，功率为40 W。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液至玻璃烧杯中，弃去沉淀，并按第1.7节所述继续处理上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙二胺四乙酸（EDTA）提取11
	<ol>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至100 mL玻璃瓶中，并用2%（w/v）EDTA溶液定容至50 mL。</li>
		<li>用手轻轻摇晃玻璃瓶，并于4 °C冰箱中静置3小时。</li>
		<li>将混合物转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液至玻璃烧杯中，弃去沉淀，并按第1.7节所述继续处理上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲酰胺–氢氧化钠（NaOH）提取13
	<ol>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至100 mL玻璃瓶中，并用去离子水定容至50 mL。</li>
		<li>加入0.3 mL 99%甲酰胺。</li>
		<li>用手轻轻摇晃玻璃瓶，并于4 °C冰箱中静置1小时。</li>
		<li>向颗粒悬浮液中加入20 mL 1 M NaOH。</li>
		<li>用手轻轻摇晃玻璃瓶，并于4 °C冰箱中静置3小时。</li>
		<li>将混合物均匀转移至两个50 mL离心管中。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液至玻璃烧杯中，弃去沉淀，并按第1.7节所述继续处理上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲醛–NaOH提取11
	<ol>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至100 mL玻璃瓶中，并用去离子水定容至50 mL。</li>
		<li>加入0.3 mL 37%甲醛。</li>
		<li>用手轻轻摇晃玻璃瓶，并于4 °C冰箱中静置1小时。</li>
		<li>向颗粒悬浮液中加入20 mL 1 M NaOH。</li>
		<li>用手轻轻摇晃玻璃瓶，并于4 °C冰箱中静置3小时。</li>
		<li>将混合物均匀转移至两个50 mL离心管中。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液至玻璃烧杯中，弃去沉淀，并按第1.7节所述继续处理上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高温–碳酸钠（Na2CO3）提取9,22,24
	<ol>
		<li>在磁力搅拌器上将150 mL自来水预热至80 °C（置于1,000 mL玻璃烧杯中）。</li>
		<li>将3 g（湿重）颗粒转移至250 mL带挡板的锥形瓶中，并用去离子水定容至50 mL。</li>
		<li>向锥形瓶中加入0.25 g无水Na2CO3或0.67 g Na2CO3•10H2O，使Na2CO3浓度达到0.5%（w/v）。</li>
		<li>将装有混合物的锥形瓶放入水浴中。分别用铝箔覆盖锥形瓶和烧杯，以防止蒸发。</li>
		<li>在80 °C、400 rpm条件下搅拌混合物35分钟。</li>
		<li>将混合物转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>将含有混合物的离心管在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液，弃去沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据标准方法测定所有提取物的总固体（TS）和挥发性固体（VS）23。
	<ol>
		<li>取上清液，用超纯水（分子量截留值为3,500 Da的透析袋）对1,000 mL超纯水透析24小时11,12。透析12小时后更换透析液，以提高透析效果。</li>
		<li>取适量透析后的上清液（约1/3）转移至铝皿中，用于TS和VS测定23。 
		注：样品在105 °C下烘干过夜。空铝皿与含干燥样品铝皿的重量差即为TS含量。随后将含样品的同一铝皿在550 °C下灼烧2小时。空铝皿与含灼烧后样品铝皿的重量差即为灰分含量。TS含量与灰分含量之差即为VS含量。</li>
		<li>对于每种提取物，将剩余的透析后上清液转移至10 mL玻璃烧杯中。在60 °C下浓缩2天，使最终体积为1–2 mL，以提高上清液中的聚合物浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 藻酸盐样胞外聚合物（ALE）的提取
<ol>
	<li>按照步骤 1.7.1 对步骤 1.6.8 中获得的提取物进行透析。</li>
	<li>将透析后的提取物转移至一个 250 ml 玻璃烧杯中，在室温下以 100 rpm 的速度缓慢搅拌。使用 pH 电极持续监测 pH 值变化，同时逐滴加入 1 M 盐酸（HCl），调节至最终 pH 值为 2.2 ± 0.05，以获得酸性形式的 ALE。</li>
	<li>调节 pH 至 2.2 后，将提取物转移至 50 ml 离心管中，在 4,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，收集凝胶状沉淀物。该凝胶状沉淀物即为酸性形式的 ALE。</li>
	<li>为获得 ALE 的钠盐（或钾盐）形式，将 0.5 M NaOH（或 0.5 M 氢氧化钾）缓慢加入步骤 2.4 所得的凝胶中，同时用手持玻璃棒缓慢搅拌凝胶，直至 pH 达到 8.5。</li>
</ol>
3. 离子型水凝胶形成测试
注意：为了检测提取的 EPS 是否具有离子水凝胶形成特性，采用 Ca2+ 离子进行微球形成试验25。
<ol>
	<li>在步骤1.7.3中将提取液浓缩至体积为1-2 ml后，用玻璃棒缓慢搅拌混合液，并用0.5 M NaOH调节其pH至8.5。</li>
	<li>取步骤3.1的提取液或步骤2.5的钠型ALE，用巴斯德移液管缓慢滴加至2.5%（w/v）氯化钙（CaCl2）溶液中。 
	注意：若提取的EPS具有离子型水凝胶成胶特性，将形成滴状（球形）珠粒；若提取的EPS不具有离子型水凝胶成胶特性，则提取液将在CaCl2溶液中分散。</li>
</ol>
4. 离子型水凝胶的稳定性测试
注意：为了进一步理解离子型 EPS 水凝胶在 AGS 结构形成中的作用，对在步骤 3.2 中收集的 Na2CO3 提取物的离子水凝胶珠进行了稳定性测试。
<ol>
	<li>将水凝胶珠在 CaCl2 溶液中保持 30 分钟。</li>
	<li>用勺子将水凝胶珠从 CaCl2 溶液中取出，并将珠子均分为四等份。</li>
	<li>将第 1 份样品置于 10 ml 去离子水中，在 4 °C 下保存 4 小时。 
	以下稳定性测试均按照提取方法 1.3 - 1.5 中所述方式执行。</li>
	<li>将第 2 份样品置于 10 ml 2% (w/v) EDTA 溶液中，在 4 °C 下保存 3 小时。</li>
	<li>将第 3 份样品置于 7.15 ml 去离子水中，加入 60 µl 99% 甲酰胺，在 4 °C 下保存 1 小时。然后加入 2.85 ml 1 M NaOH，并将第 3 份样品在 4 °C 下继续保存 3 小时。</li>
	<li>将第 4 份样品置于 7.15 ml 去离子水中，加入 60 µl 37% 甲醛，在 4 °C 下保存 1 小时。然后加入 2.85 ml 1 M NaOH，并将第 4 份样品在 4 °C 下继续保存 3 小时。</li>
	<li>监测在 4.3 - 4.6 所述条件下储存期间水凝胶珠是否出现可见的解体现象，以评估珠子是否能够耐受提取条件。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关于实验方案部分的说明 
本方案所述的EPS/ALE提取适用于50 ml液体和3 g颗粒。这些数值仅作为参考。使用更高浓度的颗粒可能导致提取的EPS产率降低。在提取ALE过程中，应将温度在80 °C下保持30分钟。混合物升温所需的时间（约5分钟）已包含在本方案中。此外，使用与烧瓶底部直径相同的磁力搅拌子可提高提取效率。这将实现良好的混合效果和研磨作用，从而促进EPS的提取。
在后续的实验方案部分，测定所有提取物（在步骤1.1–1.6中收集的上清液）的TS和VS产量。在测定TS和VS之前需进行透析，以减少因提取过程中使用的化学物质存在而可能引起的误差。建议使用截留分子量为3,500 Da的透析袋，以去除这些化学物质，同时保留透析袋内的EPS大分子。透析袋的容积应大于提取液体积，因为提取液在透析过程中体积会增加例如， 对于EDTA提取，体积最多可增加40%。透析过程中化学物质的去除程度可通过测定透析前后样品的pH值来确定。或者，通过测量透析水的电导率可反映离子去除的程度。
为了从总提取的EPS（步骤1.6和2）中获得酸性多糖（ALE），透析步骤是可选的。然而，透析具有三个优点：可减少沉淀过程中所需HCl的用量，改善提取物中酸的传质效果，并降低所得ALE的灰分含量。在进行ALE沉淀时，建议使用体积远大于提取液体积的玻璃烧杯。在提取过程中，通常会过量加入Na2CO3。所添加的HCl将首先与提取液中残留的Na2CO3反应，产生二氧化碳气体；如果样品此前未经透析，则可能引起泡沫。在加入HCl过程中，应使用与烧杯底部尺寸相当的磁力搅拌子缓慢搅拌提取液。采用此种尺寸的搅拌子并缓慢搅拌，可实现均匀混合，同时避免破坏沉淀物的结构。若提取液中形成酸性凝胶团块，可手动轻轻旋转摇动烧杯。沉淀过程采用1 M的酸浓度，以避免提取液体积显著增加，同时确保酸在样品中均匀分布。较高的酸浓度可能导致局部pH下降，并形成酸性凝胶团块。pH低于2.0会降低可回收的ALE量，这可能是由于聚合物在较低pH下发生了结构变化。因此，必须将最终pH控制在2.20 ± 0.05范围内。
局限性 
ALE 提取法旨在从好氧颗粒污泥（AGS）或生物膜中提取胞外聚合物（EPS）的结构组分，而非提取所有存在的 EPS。若要提取全部 EPS，需结合多种提取方法。此外，如通过双次和四次提取所观察到的 VSEPS 产率增加所示，单次提取无法完全提取所有结构性 EPS。ALE 提取是一种较为剧烈的 EPS 提取方法，结合了持续搅拌、加热和碱性条件。因此，有可能在提取 EPS 的同时伴随部分胞内物质的溶出。尽管细胞裂解可能由物理和化学提取技术引起（如超声处理31,32、NaOH31,32、EDTA11,32、CER32、加热32以及搅拌产生的高剪切速率19），但回收的 EPS 中是否含有胞内物质仍需进一步验证。本研究主要关注提取 EPS 的离子凝胶形成特性，未对回收 EPS 中是否含有胞内物质进行分析。未来的研究将聚焦于鉴定提取 EPS 中的胞内物质。
溶解好氧颗粒污泥（AGS）中的水凝胶基质对于提取结构性胞外聚合物（EPS）至关重要 
EPS 在好氧颗粒污泥（AGS）中形成致密且紧凑的水凝胶基质。尽管 EPS 含有多种有机大分子，如多糖、蛋白质、核酸、（磷）脂类、腐殖质以及一些细胞间聚合物7,5,8，但并非所有成分都能形成凝胶。本文中仅将能够形成凝胶的聚合物视为 EPS 中的结构性聚合物。
EPS提取的目的是首先使EPS溶解，然后收集已溶解的EPS。如果结构性EPS（即， EPS（形成水凝胶）是提取的目标，因此必须首先溶解AGS的凝胶基质。只有能够溶解凝胶基质的方法才能有效提取结构性EPS。本研究中采用了一些常用的EPS提取方法，例如离心法10-15，超声处理10,14,15EDTA10-12,14,15甲醛 + 氢氧化钠10-15 甲酰胺 + 氢氧化钠13 无法有效分离结构型胞外聚合物（EPS）。这是因为好氧颗粒污泥的水凝胶基质未被这些方法溶解。因此，第4部分中的稳定性测试仅针对EDTA、甲酰胺+NaOH以及甲醛+NaOH提取条件进行。这三种提取方法虽未能分离出结构型EPS，但仍获得了最高的挥发性固体（VS）含量EPS 除了Na之外的产率2CO3 提取。Na的条件2CO3 未采用提取步骤，因为该提取方法会明显溶解AGS基质。因此，稳定性测试期间所采用的条件被认为具有代表性。
阳离子交换树脂（CER）提取是另一种常用的胞外聚合物（EPS）提取方法，但未被纳入本研究的比较范围，因为先前关于使用CER提取EPS的研究结果并未优于本研究所采用的化学提取方法。
好氧颗粒污泥中的凝胶形成型胞外聚合物 
凝胶形成型胞外聚合物（EPS）被认为是好氧颗粒污泥（AGS）水凝胶基质中的结构型EPS。需要指出的是，存在多种类型的水凝胶，例如离子型凝胶、温度诱导凝胶和pH诱导凝胶。本研究仅关注形成离子型凝胶的EPS。鉴于所提取的结构凝胶物质占比较大，这类EPS很可能是主要的结构型EPS。当然，也不能排除在同一类或其他类型的好氧颗粒中还存在能够形成其他类型水凝胶（例如，pH诱导凝胶28）的其他种类EPS。然而，无论目标是哪一类水凝胶，溶解EPS凝胶基质都是提取凝胶形成型EPS最关键的步骤。
目前，关于颗粒污泥中结构型胞外聚合物（EPS）的研究还很少。本方案中描述的ALE提取法能够从好氧颗粒污泥（AGS）中提取凝胶状EPS，并将在未来的研究中用于表征结构型EPS。为了更好地理解颗粒化过程及EPS的功能，还需对AGS、结构型EPS和非结构型EPS开展更多研究。尤其需要深入探讨以下三个问题：微生物为何会产生如此大量的EPS，EPS的确切组分是什么，以及EPS的组分如何随环境变化而发生改变。检测并分析所有相关化合物及其相互作用，将有助于我们理解生物膜的形成机制以及如何有效利用生物膜。

近年来，好氧颗粒污泥（AGS）工艺已成为一种流行的生物废水处理工艺，并已在多个全规模废水处理厂成功应用1。与传统的活性污泥工艺不同，在AGS工艺中，微生物形成颗粒而非絮体2。这些颗粒具有更好的沉降性能，能够承受更高的有机负荷率，并且对毒性的耐受性高于活性污泥絮体3。
与生物膜不同，好氧颗粒污泥（AGS）在无任何载体材料参与的情况下自发形成4在AGS中，与生物膜类似，微生物会产生大量高度水合的胞外聚合物（EPS）5 形成一种水凝胶基质，使它们实现自我固定化4-6胞外多糖（EPS）是一种复杂的混合物，由多糖、蛋白质、核酸、（磷酸）脂类、腐殖物质以及一些细胞间聚合物组成。5,7,8这些聚合物物质通过静电作用力、氢键、离子吸引力和/或生化反应相互作用。 等等。5，形成致密且紧凑的三级网络结构。EPS中能够形成水凝胶的聚合物4,9 在这方面，有助于形成三级网络结构的胞外聚合物被视为结构性胞外聚合物（structural EPS），是总胞外聚合物的一个子集。
胞外聚合物（EPS）决定了颗粒的化学结构和物理特性5。因此，了解每种EPS组分的功能至关重要。目前已有多种方法用于提取EPS10-15。然而，由于EPS结构极为复杂，几乎不可能通过单一方法提取出全部EPS组分。迄今为止，尚不存在一种适用于所有情况的&#34;通用型&#34;EPS提取方法。提取方法的选择不仅影响所获得聚合物的总量，还影响其组成成分13,16-20。针对不同类型的污泥以及目标EPS组分，需要采用不同的提取方法。
提取凝胶形成聚合物，表征其性质，并研究它们彼此之间以及与非凝胶形成胞外聚合物（EPS）之间的相互作用，将有助于揭示EPS在好氧颗粒污泥形成过程中的作用。此外，这些凝胶形成聚合物在工业应用中也具有作为生物聚合物的潜力。已有研究展示了其一种可能的应用：利用好氧颗粒污泥（AGS）中的凝胶形成聚合物作为涂层材料，以提高纸张的耐水性21。
因此，需要针对凝胶形成型胞外多糖（EPS）的提取方法。本研究的目的是建立一种从好氧颗粒污泥（AGS）中提取凝胶形成型EPS的方法学。选取了文献中常用的六种提取方法10-15,22，用于从AGS中提取EPS，并对每种方法所得EPS的总产量及其凝胶形成特性进行了比较。

<table><tbody><tr><td>250 ml 带挡板锥形瓶</td><td>Kimble</td><td>25630-250</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml 玻璃烧杯</td><td>VWR</td><td>213-1128</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic，带温度计的磁力搅拌器</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>十水合碳酸钠</td><td>Merck KGaA</td><td>1063911000</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1 S-R，离心机</td><td>Heraeus/Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L-GL-D</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 玻璃烧杯</td><td>VWR</td><td>213-1124</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Merck KGaA</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 巴氏吸管</td><td>Copan</td><td>201C</td><td></td></tr></tbody></table>

从好氧颗粒污泥中提取结构性胞外聚合物

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

为了评估和开发用于提取凝胶形成型胞外聚合物（EPS）的方法，本研究采用六种不同方法从好氧颗粒污泥（AGS）中提取EPS，这些方法分别为离心法、超声法、乙二胺四乙酸（EDTA）法、含氢氧化钠（NaOH）的甲酰胺法、含氢氧化钠的甲醛法，以及含热处理和持续搅拌的碳酸钠（Na2CO3）法。AGS取自一个中试规模的废水处理反应器。通过钙离子（Ca2+）测试了六种不同提取方法所得EPS的离子凝胶形成特性。在所采用的六种提取方法中，仅有Na2CO3法能够溶解AGS的水凝胶基质。采用该方法回收的类藻酸盐胞外聚合物（ALE）可与Ca2+形成离子凝胶珠。Ca2+-ALE凝胶珠在EDTA、含NaOH的甲酰胺以及含NaOH的甲醛溶液中保持稳定，表明ALE是EPS中结构聚合物的一部分。建议采用结合物理与化学处理的提取方法，以溶解AGS并提取结构性EPS。

EPS 提取 
采用不同 EPS 提取方法后颗粒的外观如图 1所示。离心处理后（图 1a）和 EDTA 提取后（图 1c），颗粒的形状和凝胶结构保持完整。超声处理使颗粒破碎成不同大小的碎片，液相中的浑浊可能是由于细小碎片悬浮所致（图 1b），因为在离心后浑浊度显著降低。单独使用甲酰胺或甲醛对颗粒的形状及其凝胶结构均无影响（数据未显示）。加入 NaOH 后，液相变为淡黄色，部分絮状物质从颗粒表面脱落，并在沉降的颗粒上方形成一层（图 1d 和 1e），但颗粒的外形仍保持不变。NaOH 的加入明显促进了 EPS 的溶解，但未能破坏凝胶基质结构。相比之下，Na2CO3 提取后颗粒完全消失（图 1f），取而代之的是类溶液状液体与微小类凝胶颗粒的混合物，表明颗粒的凝胶基质确实已被溶解。
<img alt="沉降过程示意图；密封小瓶中的六个阶段；颗粒在液体中随时间逐渐沉降。" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 好氧颗粒污泥胞外聚合物（EPS）提取方法。 为了更清晰地观察每种提取方法对颗粒的影响，实验在25 ml玻璃瓶中进行。提取完成后，将提取液在室温下静置1小时，以使悬浮物充分沉降。(a) 离心提取法，(b) 超声提取法，(c) EDTA提取法，(d) 甲酰胺–NaOH提取法，(e) 甲醛–NaOH提取法，(f) 高温–Na2CO3提取法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
各方法相对于挥发性固体（VS）组分的胞外聚合物（EPS）产率如图2所示。产率以每克初始颗粒挥发性固体（VSgranule）中提取出的毫克EPS挥发性固体（VSEPS）表示。采用甲醛 + NaOH、甲酰胺 + NaOH 以及 Na2CO3 + 加热 + 混合方法获得的EPS量高于离心法、超声法和EDTA提取法。先前的研究也报道了这些提取技术的类似结果11-13,15，表明碱性条件可增强EPS的溶解性26,27。其中，Na2CO3法提取的EPS量最高，超过仅采用离心法所得EPS量的20倍。此外，通过多次提取可进一步提高Na2CO3提取法的总EPS产率。在第一次提取的第1.6.8步（方案部分）中，利用被弃去的沉淀物进行第二次提取，总产率提高了28%；进行四次提取时，总产率甚至提高了46%。
<img alt="化学产率与灰分含量柱状图；提取方法——离心、超声处理、EDTA。" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 各种提取方法在挥发性固体产率和灰分含量方面的结果。 每次提取的第一个柱状图表示 VS 产率为 mg VS胞外多糖 每克初始挥发性固体颗粒第二根柱形表示提取物中总固体（TS）的灰分质量百分比。误差线表示每种提取方法进行三次提取实验的标准偏差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
藻酸盐类胞外聚合物（ALE）提取 
采用 Na2CO3 提取 EPS 后，将 pH 调节至 2.2 时，总挥发性固体（VS）的 63% 被沉淀。该沉淀物为酸性 ALE25。残余组分可能是那些在提取条件下可溶化、但在 pH 2.2 时无法形成沉淀的 EPS。
离子型水凝胶形成试验 
好氧颗粒污泥被描述为类似于一种水凝胶。颗粒化过程被视为一种凝胶形成现象，其中糖苷类物质作为凝胶剂4,9,25,28。通常情况下，Ca2+ 是废水中最常见的阳离子之一。此外，它容易与酸性多糖（例如 藻酸盐和聚半乳糖醛酸）结合，可能作为反离子介导凝胶化过程29，从而形成离子交联的水凝胶。研究发现，添加 Ca2+ 离子可加速好氧污泥的颗粒化进程30。因此，Ca2+-EPS（离子型水凝胶）可能在构建好氧颗粒污泥中凝胶基质结构方面发挥重要作用。在此背景下，通过检测所提取的 EPS 是否能与 Ca2+ 离子形成离子型水凝胶，可作为判断所提取 EPS 是否为参与好氧颗粒污泥凝胶基质形成的结构聚合物的一种测试方法9。
本研究中，采用不同方法从好氧颗粒污泥（AGS）中提取的胞外聚合物（EPS）（图3a）显示，仅由Na2CO3提取的EPS能在2.5%（w/v）CaCl2溶液中保持液滴形态，并形成稳定的离子型水凝胶微球。此外，通过后续步骤（ALE聚合物提取，图3b）从该EPS中获得的钠型ALE也表现出相同的特性。Ca2+-ALE凝胶微球（图3c）的颜色和形态与好氧颗粒污泥（图3a）相似。显然，采用Na2CO3方法提取的EPS有助于好氧颗粒污泥中凝胶基质的形成。ALE是该EPS的主要组分，属于结构多糖聚合物，能够形成离子型水凝胶。
离子水凝胶的稳定性测试 
在EPS提取过程中观察到，好氧颗粒在EDTA、甲醛 + NaOH以及甲酰胺 + NaOH中均保持了其球形结构图1). 为了探究提取的结构多聚物是否在颗粒的稳定性中发挥作用，Ca2+-在提取过程中，ALE凝胶珠的处理方式与好氧颗粒污泥完全相同。有趣的是，Ca2+- ALE微珠表现出与AGS相似的稳定性图3d - 3f), 即，Ca2+-ALE珠在EDTA中极为稳定。仅有少量ALE从Ca表面解离2+- ALE珠子（微小的棕褐色絮状物） 图3e 和 3f），当 Ca2+- ALE珠分别在甲醛 + NaOH 和甲酰胺 + NaOH 中浸泡了三小时。这两种条件下在稳定性方面表现相似2+ALE凝胶珠和好氧颗粒表明，ALE是构成AGS凝胶基质的重要结构聚合物的一部分。
<img alt="种子萌发实验；培养皿显示处于不同阶段的种子；生长模式分析。" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 好氧颗粒污泥及提取的ALE。 （a）提取前置于去离子水中的颗粒污泥。（b）酸性ALE（按照第1.6节和第2节所述方法提取），经4,000 × g、4 °C离心20分钟后所得结果。离子型水凝胶稳定性测试结果：（c）Ca2+-ALE小球置于去离子水中，4 °C保存4小时；（d）Ca2+-ALE小球置于2% EDTA溶液中，4 °C保存3小时；（e）Ca2+-ALE小球置于含NaOH的甲酰胺中，4 °C保存4小时；（f）Ca2+-ALE小球置于含NaOH的甲醛中，4 °C保存4小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

该方案提供了一种溶解好氧颗粒污泥以提取类藻酸盐胞外聚合物（ALE）的方法。

为评估和开发凝胶形成型胞外聚合物（EPS）的提取方法，需从好氧颗粒污泥（AGS）中提取EPS……

以下实验的总体目标是展示一种从生物泡沫（特别是好氧颗粒污泥）中提取结构性胞外聚合物（EPS）的方法学。该方法有助于回答颗粒污泥领域中的一些关键问题，例如理解颗粒化过程以及分析EPS的组成。该技术的主要优势在于可快速检测胞外多聚物（EPS）中是否存在凝胶形成聚合物。将颗粒污泥在4,000 × g、4 °C条件下离心20分钟，倾去上清液。收集沉淀中的颗粒用于提取。将150毫升自来水加入1,000毫升玻璃烧杯中，并置于磁力搅拌器上加热至80摄氏度。取3克颗粒转移至250毫升带挡板锥形瓶中，加入去矿物质水至总体积为50毫升。向锥形瓶中加入0.67克十水合碳酸钠，使碳酸钠终浓度为0.5%（质量/体积）。将装有混合物的烧瓶放入水浴中。分别用铝箔覆盖烧瓶和烧杯，以防止蒸发。在400 RPM和80摄氏度条件下搅拌混合物35分钟。将混合物转移至一个50毫升离心管中。将含有混合物的离心管在4,000 × g和4°C条件下离心20分钟。收集上清液，弃去沉淀。透析步骤是获得好氧颗粒污泥中结构型EPS的可选步骤，但该步骤具有多种优势，具体在实验方案中有描述。用移液器将上清液转移至截留分子量为3,500道尔顿的透析袋中，并用1000 ml超纯水透析24小时。12小时后更换透析用水，以增强透析效果。将透析后的提取物转移至250 ml玻璃烧杯中，在室温下以100 rpm缓慢搅拌提取液。使用pH电极持续监测pH变化，同时滴加1摩尔盐酸，调节至最终pH为2.2 ± 0.5，以获得酸性形式的ale。调节pH至2.2后，将提取物转移至50 ml离心管中，在4000 × g、4 ℃条件下离心20分钟。弃去上清液，收集凝胶状沉淀。该凝胶状沉淀为酸性形式的藻类。为了获得海藻酸钠，将 0.5 摩尔氢氧化钠缓慢加入凝胶中，同时用手持玻璃棒缓慢搅拌凝胶，直至 pH 达到 8.5。使用巴斯德移液管，将海藻酸钠提取液缓慢滴加到氯化钙溶液中。如果提取的 EPS 具有离子型水凝胶成胶特性，则会形成滴状球形珠粒。或者，如果提取的EPS不具备离子水凝胶成胶特性，则提取物将在氯化钙溶液中分散。将水凝胶珠和氯化 钙溶液静置30分钟。用勺子将水凝胶珠从氯化钙溶液中取出，转移至EDTA溶液中。将水凝胶珠置于 10 ml EDTA 溶液中，在 4°C 下保存 3 小时。本实验展示了本方案中所述稳定性测试的一个示例。在保存期间观察珠子是否出现可见的解体现象，以评估其能否耐受这些条件。如果提取成功，好氧颗粒污泥将在碱性提取步骤后溶解，并在酸化和离心提取的胞外聚合物（EPS）后获得沉淀物。如果提取的EPS为结构型EPS，并具有与钙离子形成水凝胶的能力，则将提取的EPS滴入钙溶液中时会形成凝胶珠。如果提取的EPS不具备这种成胶能力，则EPS溶液将在钙溶液中分散。观看本视频后，您应能够完成好氧颗粒污泥中结构型胞外聚合物（EPS）的提取，并能够利用钙离子检测所获得EPS的凝胶形成能力。我们选择展示该提取方法，以说明提取技术对从好氧颗粒污泥中获得EPS的影响。此外，我们希望说明，没有一种胞外多糖提取技术是普遍适用的。

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