使用磁性蛋白A和蛋白G微珠对抗体进行荧光染料标记

本方法的总体目标是利用磁性蛋白A或G微珠，从纯化样品或直接从细胞培养基中对抗体进行荧光染料标记。该方法可用于优化细胞培养基中微量抗体的标记反应条件，从而改善抗体在后续实验中的应用效果。

该技术的主要优点在于抗体无需纯化，可使用氨基或巯基化学反应，且该方法可实现自动化或手动操作。首先通过轻轻振荡使磁珠均匀重悬，然后向1.5毫升微量离心管中加入50微升磁珠。

然后，将离心管置于磁力架上。10秒后，小心地用250 µL抗体结合缓冲液替换保存缓冲液，并充分混匀磁珠。再过10秒后，小心地用1 mL目标抗体替换结合缓冲液。

在室温下孵育样品60分钟。孵育结束后，将离心管放回磁力架上，待磁珠移至管壁两侧后，吸除上清液。随后，用250微升抗体结合洗涤缓冲液对磁珠与抗体混合物进行两次洗涤，每次洗涤10秒。

使用胺化学法标记抗体时，在第二次洗涤后，将洗涤缓冲液替换为100微升胺偶联缓冲液，并按每100微克抗体加入2.5微升新配制的胺反应性染料。在室温下涡旋震荡样品60分钟，以保持微珠处于悬浮状态进行标记。随后，将离心管放回磁力架上静置10秒，移除上清液。

按照上述方法，用抗体结合洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。然后，将洗涤缓冲液替换为50 µL洗脱缓冲液，混匀磁珠5分钟。将离心管置于磁力架上10秒，随后将洗脱的抗体转移至含有5 µL中和缓冲液的新微量离心管中。

再次洗脱抗体，操作方法如前所述，收集洗脱液。然后，在280纳米波长以及染料的λ最大吸收波长处测定抗体-染料偶联物的吸光度。若采用巯基化学法标记抗体，在第二次洗涤后，将洗涤缓冲液替换为250微升巯基偶联缓冲液，并通过轻柔吹打混匀磁珠。

10秒后，用抗体结合洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次。然后，将洗涤缓冲液替换为100微升巯基偶联缓冲液，并加入DTT至终浓度为2.5毫摩尔。将磁珠再混合60分钟。

然后，将磁珠放回磁力架上静置10秒，弃去缓冲液。接着，向磁珠中加入250 µL巯基偶联缓冲液，轻轻混匀。10秒后，用抗体结合洗涤缓冲液洗涤磁珠两次，并将第二次洗涤替换为100 µL新鲜的巯基偶联缓冲液。

现在，每 100 微克抗体加入 2.5 µL 新鲜配制的巯基反应性染料，在室温下混匀反应 60 分钟。孵育结束后，将离心管置于磁力架上 10 秒。移除上清液，并加入 250 µL 新鲜的巯基偶联缓冲液，轻轻混匀。

10 秒后，洗涤磁珠两次。然后，用 50 µL 洗脱缓冲液替换洗涤缓冲液，并像刚才演示的那样，进行两次洗脱以回收偶联抗体。随后，在 280 纳米以及染料的 λ max 处测定抗体-染料偶联物的吸光度。

抗体与Protein G之间的高亲和力、磁体对磁珠的强结合力，以及在磁珠纯化前对方法的优化，共同确保了标记反应过程中抗体的损失极小。这一点通过三种不同小鼠抗体亚型在荧光双标记后与常规纯化方法相比所表现出的高效回收率得到了证实。这种高回收率在考马斯亮蓝染色凝胶中也得以体现：由于磁性G蛋白磁珠的非特异性结合能力极低，凝胶中仅可见高度纯化的荧光双标记重链和轻链。使用磁性Protein A磁珠进行磁珠上标记时，该方法同样适用于多种荧光染料，可实现高回收率以及良好的染料-抗体比。

熟练掌握该技术后，若操作得当，可在两至三小时内完成，可手动处理多个样本，或使用自动化平台以提高通量。在进行该实验步骤时，必须始终注意保持磁珠处于悬浮状态。

根据样本选择合适体积的磁珠，并优化目标抗体所用荧光染料的用量。完成此操作步骤后，应通过相关的生物学实验（如 ELISA、流式细胞术或基于细胞的实验）检测标记后的抗体，以确定其功能活性。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用磁性 Protein A 或 G 珠对纯化或未纯化的抗体进行荧光标记或其他小分子标记（如生物素或细胞毒性药物）。