细菌利用试金石比色法检测
September 17th, 2016
我们描述了一种使用改良石蕊试验对大肠杆菌进行比色检测的方案，该试验利用 RNA 裂解 DNA 酶、脲酶和磁珠。
本实验的总体目标是展示一种用于细菌检测的简单改良石蕊测试。该方法描述了大肠杆菌激活的 RNA 裂解 DNA 酶如何与基于脲酶的信号转导平台偶联，以响应大肠杆菌产生颜色变化。该技术的两个主要优点是测试简单性及其对其他分析物反应性 RNA 裂解 DNA 酶的适用性。
演示该程序的是麦克马斯特大学 Yingfu Li 博士实验室的研究生 Seperh Manchehry 和 Dingran Chang。根据文本方案制备试剂和缓冲液后，通过将 1 毫克 SMCC 溶解在 676 μL DMSO 中，制备琥珀酰亚胺 4-环己烷-1-羧酸盐或 SMCC 的储备溶液。涡旋并置于冰上直至使用。
将 1 毫克脲酶溶解在毫升 1x PBS 中，并将其置于冰上直至使用。要合成脲酶 DNA 或 UrDNA，将 10 μL 100 μmol LD1 添加到 2.5 mL 微量离心管中。然后，加入 140 微升双蒸水和 40 微升 10x PBS 并涡旋。
接下来，加入 80.5 微升 SMCC 原液和 159.5 微升 DMSO。然后，再次涡旋并使用台式离心机短暂旋转。将反应物在 37 摄氏度下在培养箱或加热块中孵育 60 分钟。
孵育后，向试管中加入 200 微升 1x PBS、60 微升三摩尔乙酸钠和 1.5 毫升冷 100% 乙醇。涡旋混合，并在零下 20 摄氏度下孵育反应 30 分钟。将溶液以 20， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 20 分钟。
然后，去除上清液并在真空下干燥沉淀。向干燥的沉淀中加入 400 微升脲酶原液，并在室温下孵育 5 小时。将 200 μL 粗偶联物转移到预洗的 100， 000 截留分子量离心过滤柱中。
将色谱柱以 14， 000 次 g 离心 5 分钟。将剩余的 200 μL 粗偶联物转移至色谱柱中，以 14， 000 倍 g 离心 5 分钟。然后，取出色谱柱并将其倒置放入新的 2 ml 微量离心收集管中。
将倒置的色谱柱和试管以 1， 000 倍 g 离心 2 分钟。取出收集管后，向离心柱中加入 30 微升 1x PBS 以洗涤膜以进一步回收偶联物。再次倒置色谱柱并将其放回收集管中。
将色谱柱以 1， 000 倍 g 离心 2 分钟。取出并丢弃色谱柱。将 UrDNA 储存在 4 摄氏度直至使用。
要将大肠杆菌激活的 RNA 裂解 DNA 酶 （EC1） 和 UrDNA 组装到磁珠上，请充分混合磁珠原液，并将 100 μL 磁珠悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。然后，将试管放在磁架支架上以隔离磁珠。通过移液去除上清液，并向试管中加入 150 μL 结合缓冲液或 BB。
从支架上取下试管，小心敲击试管，将微珠重新悬浮成均匀的溶液。在用 BB 悬浮的珠子再重复 BB 洗涤两次后，加入 10 微升 10 微摩尔 EC1。轻敲试管小心混合。
将溶液轻轻摇晃孵育 30 分钟。为避免珠子聚集，请每 2 到 3 分钟敲击一次试管。接下来，将微量离心管放回磁架上以分离珠子并通过移液去除上清液。
然后，使用 150 微升 BB 将珠子洗涤 3 次。洗涤完成后，将磁珠悬浮在总共 150 μL BB.To 该溶液中，加入 15 μL UrDNA，在 45 摄氏度下加热样品 2 分钟，然后将溶液冷却至室温并孵育 2 小时。将微量离心管放回磁力架上以分离珠子并通过移液去除上清液。
加入 100 μL 反应缓冲液或 RB，然后从磁力架上取下试管并小心地重新悬浮磁珠。根据文本方案制备大肠杆菌细胞后，加入并涡旋 100 μL RB，预洗 1.5 mL 微量离心管。然后，丢弃缓冲区。将 15 微升组装好的 EC1 添加到洗涤过的试管中，然后将试管放在磁力架上并吸出上清液。
从架子上取下试管，加入 100 μL RB，然后小心地重新悬浮磁珠。使用 RB 再洗涤珠子两次并去除 RB 后，向试管中加入 10 μL 大肠杆菌样品，然后轻敲试管轻轻混合内容物。然后，在室温下孵育反应物 1 小时。
孵育后，加入 90 微升双蒸水，将试管放在磁力架上。磁分离约 3 分钟后，小心地将 85 μL 上清液转移至 0.5 mL 微量离心管中。小心移液溶液而不吸取任何磁珠非常重要。
这些微珠上样了脲酶，会产生假阳性信号。加入 15 微升 0.04% 酚红和 100 微升底物溶液。然后，以特定时间间隔拍摄照片以记录颜色变化。
石蕊测试的起始颜色必须为黄色，反映溶液 pH 值低于 5.5。如有必要，可以使用弱缓冲液（例如，pH 值为 5 的一毫摩尔乙酸钠缓冲液）调节石蕊试验的起始 pH 值。该图显示了细菌石蕊试验的结果，其中使用大肠杆菌激活的 RNA 裂解 DNA酶 EC1 作为 DNA 酶，使用酚红作为 pH 指示剂。
如在没有大肠杆菌的情况下没有颜色变化所示，EC1 具有高度特异性，并且对其他细菌表现出最小的活性。颜色变化的深度取决于 DNAzyme 激活步骤中使用的大肠杆菌细胞的数量和尿素水解步骤允许的时间。更多的大肠杆菌细胞会导致更强的颜色变化，并且尿素水解时间更长，可以检测到较少数量的细胞。
该图显示了使用手持式 pH 计监测的 pH 值变化。10 到 7 个大肠杆菌细胞的存在导致 pH 值在 10 分钟内逐渐增加 3 个单位。相比之下，在相同条件下，不存在大肠杆菌不会引起可检测的 pH 值变化。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住脲酶非常活跃，洗涤不当或污染会导致假阳性。按照此程序，可以执行此方法以在更相关的条件下测试大肠杆菌，例如环境水质测试。
看完这个视频，你应该对利用一个简单的石蕊测试进行大肠杆菌测试有一个很好的了解。不要忘记，该测试可用于检测极其危险的致病性大肠杆菌。在进行任何病原菌测试之前，您需要接受生物安全培训。
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概述
本文介绍了一种用于大肠杆菌比色检测的改良石蕊试验的协议。该方法利用RNA剪切DNA酶结合尿素酶和磁珠，对大肠杆菌的存在产生可见的颜色变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物技术
- 分析化学
背景
- 细菌检测在食品安全和临床诊断等多个领域至关重要。
- 传统方法可能耗时且复杂。
- 本研究介绍了一种使用比色方法的更简单的替代方案。
- 该方法利用RNA剪切DNA酶的特异性进行细菌检测。
研究目的
- 开发一种检测大肠杆菌的简单方法。
- 展示RNA剪切DNA酶在石蕊试验格式中的有效性。
- 突出该技术适应其他分析物的潜力。
所用方法
- 根据协议准备试剂和缓冲液。
- 制备琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-羧酸酯（SMCC）的原液。
- 将大肠杆菌激活的RNA剪切DNA酶与基于尿素酶的信号平台结合。
- 观察颜色变化作为大肠杆菌存在的指示。
主要结果
- 改良的石蕊试验通过可见的颜色变化成功检测到大肠杆菌。
- 该方法展示了简单性和易用性。
- 确立了该技术对其他分析物响应的RNA剪切DNA酶的潜在适用性。
- 结果表明这是未来细菌检测方法的一个有前途的方向。
结论
- 改良的石蕊试验提供了一种快速有效的大肠杆菌检测方法。
- 该技术可以适应微生物检测的各种其他应用。
- 进一步的研究可能会扩展RNA剪切DNA酶在诊断设置中的实用性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, user-friendly pathogen detection is a critical need in translational research and field-based biopharma workflows. The colorimetric litmus test leveraging RNA-cleaving DNAzymes and urease signal transduction enables specific, visual detection of bacteria such as E.coli, supporting early-stage screening and environmental monitoring. This approach enhances predictive confidence and operational efficiency at key inflection points in the discovery and development pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of bacterial presence using analyte-responsive DNAzymes for functional target validation.
- Supports biological de-risking by providing high specificity for E.coli over non-target bacteria.
- Facilitates rapid go/no-go decisions in environmental and preclinical sample screening.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative colorimetric assays for downstream compound or sample evaluation.
- Delivers standardized, reproducible outputs through visible pH-dependent color change.
- Enables scalable, field-deployable screening platforms for pathogen detection.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant detection needs in water quality and environmental biosurveillance.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting rapid, on-site pathogen assessment.
- Reduces risk of late-stage biological ambiguity through robust, specific detection mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven pathogen detection and supporting assay readiness for field and laboratory use.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via DNAzyme specificity for bacterial targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative colorimetric outputs for rapid sample triage.
- Analytics: Delivers measurable pH shifts and visual readouts to compare sample conditions.
- Translational Research: Bridges laboratory and field workflows for environmental and clinical sample testing.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to other DNAzyme-based pathogen detection needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and rapid deployment in diverse settings.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of detection platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and enzymatic assay assembly.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and colorimetric readout tools.
- Demands rigorous washing and handling protocols to prevent false positives from urease contamination.
- Adaptable across different DNAzyme targets for various bacterial species.
- Practical limitations include sensitivity thresholds and the need for biosafety training with pathogenic samples.
