使用石蕊试验比色法检测细菌

本实验的总体目标是演示一种用于细菌检测的简单改良石蕊试验。该方法描述了如何将大肠杆菌激活的RNA切割DNA酶与基于脲酶的信号转导平台相结合，以实现对大肠杆菌的响应并产生颜色变化。该技术的两个主要优势在于实验操作的简便性，以及其可适用于其他分析物响应型RNA切割DNA酶的通用性。

本实验操作由麦克马斯特大学李应福博士实验室的研究生 Seperh Manchehry 和 Dingran Chang 演示。根据文本方案配制试剂和缓冲液后，通过将 1 毫克 SMCC（琥珀酰亚胺基-4-环己烷-1-羧酸酯，succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate）溶解于 676 微升 DMSO 中，配制 SMCC 储存液。涡旋混匀后置于冰上，待用。

将一毫克脲酶溶解于一毫升1× PBS中，并置于冰上保存直至使用。为合成脲酶DNA（UrDNA），向一个2.5毫升微量离心管中加入10微升100微摩尔的LD1。然后加入140微升双蒸水和40微升10× PBS，涡旋混匀。

接下来，加入 80.5 µL SMCC 储液和 159.5 µL DMSO。然后再次涡旋混匀，并使用台式离心机短暂离心。将反应液置于 37°C 培养箱或加热块中孵育 60 分钟。

孵育结束后，向离心管中加入 200 微升 1× PBS、60 微升 3 摩尔的醋酸钠以及 1.5 毫升预冷的 100% 乙醇。涡旋混匀，于 -20 摄氏度孵育 30 分钟。在 20,000 × g 及 4 摄氏度条件下离心 20 分钟。

然后，弃去上清液，并在真空下干燥沉淀。向干燥的沉淀中加入 400 µL 尿素酶储备液，在室温下孵育 5 小时。取 200 µL 粗制结合物转移至预先洗涤过的 100,000 分子量截断离心过滤柱中。

将柱子在14,000 × g条件下离心五分钟。将剩余的200微升粗制结合物转移至柱子中，并在14,000 × g条件下离心五分钟。然后，取出柱子并将其倒置放入一个新的2毫升微量离心收集管中。

将倒置的离心柱和管在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。移去收集管后，向离心柱中加入 30 µL 1× PBS，以洗涤膜并进一步回收结合物。再次倒置离心柱，并将其放回收集管中。

将离心柱在 1,000 × g 条件下离心两分钟。移除并丢弃离心柱。将 UrDNA 在 4 °C 下保存直至使用。

为了将大肠杆菌激活的RNA切割DNA酶（EC1）和UrDNA组装到磁珠上，首先充分混匀磁珠储备液，然后取100微升磁珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中。接着将该管置于磁力架上以分离磁珠。用移液器吸除上清液后，向管中加入150微升结合缓冲液（BB）。

从支架上取下离心管，轻轻敲击管壁，使磁珠重新悬浮并形成均匀的溶液。将磁珠保持在悬浮状态下，用BB缓冲液再重复洗涤两次后，加入10微升浓度为10微摩尔的EC1。通过轻敲离心管小心混匀。

将溶液轻轻振荡孵育30分钟。为避免磁珠聚集，每2至3分钟轻弹离心管一次。随后，将微量离心管重新置于磁力架上，使磁珠分离，然后用移液器吸除上清液。

然后，用150微升BB缓冲液洗涤磁珠三次。洗涤完成后，将磁珠重悬于总共150微升的BB缓冲液中。向该溶液中加入15微升UrDNA，在45摄氏度加热两分钟，随后将溶液冷却至室温并孵育两小时。将微量离心管放回磁力架上以分离磁珠，用移液器吸除上清液。

加入 100 µL 反应缓冲液（RB），然后将离心管从磁力架上取下，小心重悬珠子。根据文本方案制备大肠杆菌细胞后，通过加入 100 µL RB 并涡旋振荡，预清洗一个 1.5 mL 微量离心管，随后弃去缓冲液。向已清洗的离心管中加入 15 µL 已组装的 EC1，然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。

从架子上取下离心管，加入 100 µL RB 缓冲液，并小心地重新悬浮磁珠。用 RB 缓冲液再洗涤磁珠两次并去除 RB 后，向离心管中加入 10 µL 大肠杆菌样品，并通过轻弹管壁轻轻混匀内容物。然后在室温下孵育反应 1 小时。

孵育后，加入90微升双蒸水，将离心管置于磁力架上。磁分离约3分钟后，小心地将85微升上清液转移至0.5毫升微量离心管中。移液时必须格外小心，避免吸入任何磁珠。

这些微珠含有脲酶，会产生假阳性信号。加入15微升0.04%酚红溶液和100微升底物溶液。随后，在特定时间间隔拍照，以记录颜色变化。

石蕊试验的初始颜色必须为黄色，表明溶液 pH 值低于 5.5。如有必要，可用弱缓冲液（如 pH 为 5 的 1 毫摩尔醋酸钠缓冲液）调节石蕊试验的初始 pH 值。本图显示了细菌石蕊试验的结果，其中使用大肠杆菌激活的 RNA 切割脱氧核酶 EC1 作为脱氧核酶，酚红作为 pH 指示剂。

如在没有大肠杆菌的情况下未发生颜色变化所示，EC1 具有高度特异性，对其他细菌的活性极低。颜色变化的深浅程度既取决于 DNA 酶激活步骤中使用的大肠杆菌细胞数量，也取决于尿素水解步骤所允许的时间。大肠杆菌细胞数量越多，颜色变化越明显；尿素水解时间越长，越能检测到更少量的细胞。

该图显示了使用手持式 pH 计监测到的 pH 变化。存在 10⁷ 个大肠杆菌细胞时，在 10 分钟内 pH 逐渐上升了 3 个单位。相比之下，在相同条件下，无大肠杆菌存在时未引起可检测的 pH 变化。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此实验时，需牢记尿素酶活性很强，洗涤不充分或污染均可能导致假阳性结果。采用此方法后，可在更贴近实际的条件下检测大肠杆菌，例如用于环境水质检测。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用简单的石蕊试验进行大肠杆菌检测。请务必注意，该试验可用于检测致病性大肠杆菌，而此类细菌具有极高危险性。在开展任何致病菌检测之前，您必须接受生物安全培训。