Name: 细菌利用试金石比色法检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解利用RNA切割DNA酶与脲酶信号转导平台检测大肠杆菌的比色法。该方法通过可见颜色变化实现快速、简便的细菌检测，适用于即时诊断和现场应用。

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本研究项目的经费由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）通过向 YL 提供的发现基金（Discovery Grant）资助。

1. 试剂与缓冲液的配制
<ol>
	<li>0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）
	<ol>
		<li>在 2 L 烧杯中，将 186.1 g EDTA 加入 800 ml 去离子蒸馏水（ddH2O）中。使用 NaOH 颗粒调节溶液 pH 至 8.0。用 ddH2O 定容至 1.0 L，转移至可高压灭菌的玻璃瓶中进行高压灭菌，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10× Tris-硼酸 EDTA 缓冲液（10x TBE）
	<ol>
		<li>在 4 L 塑料烧杯中，加入 432 g Tris 碱、200 g 硼酸、80 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）以及 ddH2O 至终体积为 4 L。使用搅拌子搅拌至所有组分完全溶解。将溶液分装至 1 L 玻璃瓶中进行高压灭菌，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% 变性聚丙烯酰胺储备液
	<ol>
		<li>在 4 L 塑料烧杯中，加入 1681.7 g 尿素、400 ml 10x TBE、1 L 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液，并用 ddH2O 定容至 4 L。使用搅拌子搅拌至尿素完全溶解。将溶液转移至 1 L 棕色玻璃瓶中，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2× 凝胶上样缓冲液（2x GLB）
	<ol>
		<li>在 200 ml 玻璃烧杯中，加入 44 g 尿素、8 g 蔗糖、10 mg 溴酚蓝、10 mg 二甲苯蓝 FF、400 µl 10% 十二烷基硫酸钠和 4 ml 10× TBE。加入 ddH2O 至终体积为 40 ml，在 50 °C 轻微加热并使用磁力搅拌子搅拌至各组分溶解。将 1 ml 分装至 1.5 ml 微量离心管中，并于 4 °C 保存。 
		注意：使用前需在 90 °C 短暂加热以重新溶解可能析出的固体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M Tris-盐酸（Tris-HCl）（pH 7.5）
	<ol>
		<li>在玻璃瓶中，加入 12.1 g Tris 碱和 70 ml ddH2O，搅拌至固体完全溶解。使用 1 M 盐酸（HCl）调节 pH 至 7.5。用 ddH2O 定容至 100 ml，高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 M 氯化钠（NaCl）
	<ol>
		<li>在玻璃瓶中，将 58.4 g NaCl 溶解于 150 ml ddH2O 中。用 ddH2O 定容至 200 ml，于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 洗脱缓冲液
	<ol>
		<li>在玻璃瓶中，混合 2.0 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、8.0 ml 5 M NaCl 和 0.4 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）。用 ddH2O 定容至 200 ml，高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH 7.4）
	<ol>
		<li>在玻璃瓶中，将 2.38 g HEPES 溶解于 80 ml ddH2O 中。使用 5 N NaOH 调节 pH 至 7.4，并用 ddH2O 定容至 100 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M 氯化镁（MgCl2）
	<ol>
		<li>在玻璃瓶中，加入 2.03 g MgCl2-6H2O，并用 ddH2O 定容至 100 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应缓冲液（RB）
	<ol>
		<li>在 50 ml 锥形管中，加入 50 µl 1 M HEPES（pH 7.4）、1.5 ml 5 M NaCl、0.75 ml 1 M MgCl2 和 5 µl Tween-20。用 ddH2O 定容至 50 ml。混匀溶液后，使用注射器驱动滤器（0.22 µm）过滤至另一锥形管中，4 °C 保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合缓冲液（BB）
	<ol>
		<li>在 50 ml 锥形管中，加入 500 µl 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、8.8 g NaCl、50 µl 1 M MgCl2 和 5 µl Tween 20。用 ddH2O 定容至 50 ml。混匀溶液后，使用注射器驱动滤器（0.22 µm）过滤至另一锥形管中，4 °C 保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>底物溶液（SS）
	<ol>
		<li>在 50 ml 锥形管中，加入 5.8 g NaCl、3 ml 1 M MgCl2、1.5 g 尿素和 40 ml ddH2O。使用 10 mM HCl 将溶液 pH 调至 5.0。由于该溶液未加缓冲，需小心逐滴加入 HCl 并频繁检测 pH。用 ddH2O 定容至 50 ml。</li>
		<li>混匀溶液后，使用注射器驱动滤器（0.22 µm）过滤至另一锥形管中，4 °C 保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 培养基（Luria Bertani 培养基）
	<ol>
		<li>在烧杯中，将 20.0 g LB 粉末溶解于 1 L ddH2O 中。转移至玻璃瓶，高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1.5% LB 琼脂
	<ol>
		<li>在 250 ml 三角瓶中，加入 1.5 g 琼脂和 100 ml LB 培养基。高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂平板
	<ol>
		<li>在微波炉中重新溶解 LB 琼脂，冷却至约 50 °C。将溶液倒入培养皿中，制备约 5 块平板，静置使其凝固。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 合成与纯化 大肠杆菌-响应性DNA酶EC1
<ol>
	<li>模板介导的酶促连接法合成 EC1
	<ol>
		<li>根据标准操作流程，通过 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）纯化商业合成的寡核苷酸 BS1、DE1 和 T1（序列见表 1）。</li>
		<li>配制浓度为 100 µM 的 BS1、DE1 和 T1 储存液。储存于 -20 °C，待用。</li>
		<li>在 1.5 ml 微离心管中加入 38.5 µl ddH2O、5 µl DE1 和 5 µl 酶供应商提供的 10× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液（500 mM Tris-HCl (pH 7.6)、100 mM MgCl2、50 mM 二硫苏糖醇（DTT）、1.0 mM 亚精胺）。</li>
		<li>加入 1 µl 三磷酸腺苷（ATP）（100 mM）。加入 5 单位 T4 多聚核苷酸激酶（10 U/µl）。通过移液器轻柔吹打混匀反应体系。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育反应体系 30 分钟。</li>
		<li>将反应体系在 90 °C 加热 5 分钟以终止反应。</li>
		<li>加入 118 µl ddH2O、5 µl BS1 和 5 µl T1。将反应体系加热至 90 °C 持续 2 分钟，然后在 10 分钟内冷却至室温。</li>
		<li>加入 20 µl 酶供应商提供的 10× T4 DNA 连接酶反应缓冲液（400 mM Tris-HCl (pH 7.8)、100 mM MgCl2、100 mM DTT、5 mM ATP）。加入 10 单位 T4 DNA 连接酶（5 U/µl），并通过移液器轻柔混匀。</li>
		<li>在室温下孵育 2 小时。</li>
		<li>加入 20 µl 3 M 醋酸钠（NaOAc）（pH 5.2）和 500 µl 冷的 100% 乙醇。涡旋混匀溶液，并将离心管置于 -20 °C 冰箱中 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。小心用移液器吸除上清液。</li>
		<li>用冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，再次在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟。再次吸除上清液，并在真空下干燥沉淀 10 分钟。</li>
		<li>用 15 µl ddH2O 重悬 DNA，然后加入 15 µl 2× GLB。</li>
		<li>剧烈涡旋并加热至 90 °C 持续 2 分钟。按以下所述方法通过 10% dPAGE 纯化全长 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 10% dPAGE 凝胶
	<ol>
		<li>清洗两块玻璃板（一块完整板和一块带缺口板）、两个 0.75 mm 厚的隔片以及一个 12 孔梳子。将一块玻璃板平放在平面上，两侧各放置两个隔片，再将带缺口的玻璃板置于其上。使用供应商提供的四个夹子将两块玻璃板夹紧。</li>
		<li>在 150 ml 塑料烧杯中加入 40 ml 10% dPAGE 溶液、40 µl 四甲基乙二胺（TEMED）和 400 µl 10% 过硫酸铵（APS）。混合各组分后，缓慢将溶液倒入玻璃板之间。</li>
		<li>插入梳子，静置 10 分钟使凝胶聚合。凝胶聚合完成后，缓慢取出梳子，并用 ddH2O 冲洗加样孔。</li>
		<li>将玻璃板安装到电泳装置上。使用金属板散热，防止过热。</li>
		<li>向电泳槽的上下室加入 1× TBE 缓冲液，确保加样孔完全浸没在缓冲液中。使用移液器或注射器用 1× TBE 冲洗加样孔。</li>
		<li>将电泳装置设置为 35 mA，上样前预电泳 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 10% dPAGE 凝胶中洗脱连接产物 EC1
	<ol>
		<li>完成步骤 2.2.6 后，在 35 mA 条件下电泳，直至底部染料（溴酚蓝）迁移至玻璃板底部，约需 1.5 小时。关闭电源，从装置中取出玻璃板。</li>
		<li>将玻璃板放在几张纸巾上，小心移除玻璃板间的隔片。小心取下顶部玻璃板，并用保鲜膜包裹凝胶。</li>
		<li>将凝胶翻转以取下第二块玻璃板，再次用保鲜膜覆盖。注意避免保鲜膜产生褶皱。</li>
		<li>使用紫外阴影法（260 nm）观察连接产物，可观察到 4 条清晰的 DNA 条带（完全连接的 EC1、DE1、BS1 和 T1）。</li>
		<li>用无菌剃刀切下最上方的条带（EC1），转移至 1.5 ml 微离心管中。用无菌移液器吸头（200 µl 规格）将凝胶压碎，直至形成细糊状。加入 550 µl DNA 洗脱缓冲液，用铝箔包裹管子以保护嵌入的荧光染料，振荡 15 分钟。</li>
		<li>在 20,000 × g 下离心 5 分钟，小心吸取 400 µl 上清液转移至另一 1.5 ml 微离心管中。移液时避免吸入凝胶碎片。</li>
		<li>向含有转移上清液的微离心管中加入 40 µl 3 M NaOAc（pH 5.2）和 1.0 ml 冷的 100% 乙醇。涡旋混匀溶液，并将离心管置于 -20 °C 冰箱中 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。小心用移液器吸除上清液。</li>
		<li>用冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，再次在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 10 分钟。再次吸除上清液，并在真空下干燥沉淀 10 分钟。</li>
		<li>通过测量 260 nm 处的紫外吸光度确定 EC1 的浓度。配制 10 µM 储存液，储存于 -20 °C 待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脲酶与DNA的偶联
<ol>
	<li>SMCC 储备液的制备
	<ol>
		<li>将 1 mg SMCC 溶解于 676 µl DMSO 中。涡旋混匀，置于冰上待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脲酶储备液的制备
	<ol>
		<li>将 1 mg 脲酶溶解于 1 ml 1× PBS（不含 Mg2+ 或 Ca2+）中。置于冰上待用。 
		注意：结晶脲酶溶解较慢，需轻柔混匀以避免变性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脲酶-DNA（UrDNA）的合成
	<ol>
		<li>取 10 µl 100 µM LD1 加入 2.5 ml 微量离心管中，加入 140 µl ddH2O 和 40 µl 10× PBS，涡旋混匀。</li>
		<li>加入 80.5 µl SMCC 储备液和 159.5 µl DMSO，涡旋混匀后，用台式离心机短暂离心。</li>
		<li>37 °C 孵育 60 分钟。避免微量离心管盖下产生冷凝水。</li>
		<li>加入 200 µl 1× PBS、60 µl 3 M NaOAc（pH 5.2）和 1.5 ml 冷的 100% 乙醇。涡旋混匀后，于 -20 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，真空干燥沉淀。避免过度干燥。</li>
		<li>向干燥的沉淀中加入 400 µl 脲酶储备液，在室温下孵育 5 小时。</li>
		<li>将 200 µl 粗产物转移至预清洗的 100k MWCO 离心过滤柱中，在 14,000 × g 下离心 5 分钟。</li>
		<li>将剩余的 200 µl 粗产物转移至同一过滤柱中，再次在 14,000 × g 下离心 5 分钟。取出过滤柱，将其倒置放入一个新的 2.0 ml 微量离心管（&#34;收集管&#34;）中。</li>
		<li>将收集管（连同倒置的过滤柱）在 1,000 × g 下离心 2 分钟。取出收集管，向离心过滤柱中加入 30 µl 1× PBS，洗涤膜以进一步回收偶联产物。</li>
		<li>再次将过滤柱倒置并放回收集管中，在 1,000 × g 下离心 2 分钟。取出并弃去过滤柱。</li>
		<li>将 UrDNA 储存于 4 °C 待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将EC1和UrDNA组装到磁珠上
<ol>
	<li>充分混匀磁珠（MB）储备液，取100 µl磁珠悬液转移至1.5 ml离心管中。将离心管置于磁力架上以分离磁珠。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，向管中加入150 µl结合缓冲液（BB）。将离心管从磁力架上取下，轻轻敲击管壁，使磁珠重新悬浮成均匀溶液。避免悬液溅至管顶或管盖。若发生溅出，可使用台式离心机短暂离心，使残留液滴重新回到悬液中。</li>
	<li>重复步骤4.2两次。</li>
	<li>向此悬液中加入10 µl浓度为10 µM的EC1。通过轻敲管壁小心混匀。</li>
	<li>在温和振荡条件下孵育30分钟。每2–3分钟轻敲一次管壁，以防止磁珠沉淀。</li>
	<li>将离心管重新置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸除上清液。用150 µl BB缓冲液洗涤磁珠三次（操作同步骤4.2）。</li>
	<li>洗涤完成后，将磁珠重悬于总共150 µl的BB缓冲液中。向该溶液中加入15 µl UrDNA，并将溶液加热至45 °C，持续2分钟。随后冷却至室温，孵育2小时。</li>
	<li>将离心管再次置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸除上清液。</li>
	<li>加入100 µl反应缓冲液（RB）。将离心管从磁力架上取下，小心地重新悬浮磁珠。</li>
	<li>重复步骤4.9三次，进一步洗涤磁珠。 
	注意：可快速检测洗涤后的上清液，以判断是否存在未杂交的UrDNA，因其可能导致假阳性信号。检测方法为：向洗涤液中加入10 µl 50 mM尿素和10 µl 0.04%酚红。继续洗涤磁珠，直至洗涤液不再引起颜色变化。最终的100 µl悬液于4 °C保存，待用。</li>
</ol>
5. 细菌细胞的制备20
<ol>
	<li>从保存菌种培养E. coli
	<ol>
		<li>在火焰旁或生物安全柜中，将E. coli K12 (MG1655) 从甘油保存菌种接种至LB琼脂平板上。</li>
		<li>使用无菌移液器吸头轻轻接触甘油保存菌种，并在琼脂平板表面进行轻划线接种，避免刺破LB琼脂。</li>
		<li>将划线后的平板倒置，在37 °C下培养14小时。</li>
		<li>用Parafilm封口膜密封平板，并在4 °C下保存，最长不超过3周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为细胞计数培养E. coli
	<ol>
		<li>在无菌的14 ml培养管中，加入2 ml LB液体培养基。</li>
		<li>使用无菌移液器吸头，从第5.1步制备的划线琼脂平板上挑取单个菌落，并转移至该培养管中。</li>
		<li>在37 °C下培养，以230 rpm振荡培养14小时。</li>
		<li>将细菌培养物按10倍梯度进行连续稀释。</li>
		<li>对每个稀释样品，分别取五份100 µl等分试样，均匀涂布于不同的LB琼脂平板上。将平板倒置，在37 °C下培养14小时。</li>
		<li>对每个样品的菌落进行计数，计算各稀释度的平均细胞浓度。 
		注：通常使用107个细胞作为E. coli的参考性指示试验设定值，因为该浓度的E. coli可引发快速的颜色变化。然而，如结果部分所述，正确操作的指示试验最低可检测到500个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为检测准备E. coli细胞
	<ol>
		<li>为获得所需细胞悬液，取1 ml培养菌液转移至1.5 ml微量离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以6,000 x g离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入10 µl反应缓冲液，重悬细胞。将细胞悬液超声处理5分钟。随后将细胞悬液转移至冰盒中冷却5分钟。</li>
		<li>再次对细胞悬液进行5分钟超声处理。</li>
		<li>在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。取上清液用于检测（10 µl）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 石蕊测试
<ol>
	<li>在1.5 ml的微量离心管中，加入100 µl反应缓冲液（RB），涡旋混匀，预洗离心管，然后弃去缓冲液。</li>
	<li>将15 µl已组装的EC1（方案4）转移至已清洗的微量离心管中。</li>
	<li>将微量离心管置于磁力架上，洗涤磁珠：用移液器吸除上清液。将离心管从磁力架上取下，加入100 µl RB，轻柔重悬磁珠。</li>
	<li>重复步骤6.3，再洗涤磁珠两次。</li>
	<li>将微量离心管重新放回磁力架上，吸除上清液，然后加入10 µl来自步骤5.3制备的大肠杆菌（E. coli）样品。</li>
	<li>通过轻敲微量离心管，小心混匀样品与磁珠。</li>
	<li>室温孵育反应体系1小时。</li>
	<li>向反应体系中加入90 µl ddH2O，并将微量离心管置于磁力架上。</li>
	<li>磁分离约3分钟后，小心吸取85 µl上清液转移至0.5 ml微量离心管中。吸取上清液时应缓慢操作，避免吸入任何磁珠。</li>
	<li>向上述微量离心管中加入15 µl 0.04%酚红溶液和100 µl底物溶液。</li>
	<li>在特定时间间隔拍照，记录颜色变化。 
	注意：也可使用带有微电极的pH计监测pH变化。起始pH应约为5.2–5.5（溶液呈黄色）。若不符合，可通过添加1 mM乙酸盐缓冲液（pH 5.0）调节溶液pH。</li>
</ol>

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
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<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过使用脲酶和磁性分离，可将细菌响应性DNA酶的RNA切割活性转化为石蕊测试，如图1所示。5,19,20 尽管对改良石蕊测试用于细菌检测的演示是利用依赖大肠杆菌（E. coli）的RNA切割型DNA酶完成的，但该设计原则上可推广至任何RNA切割型DNA酶。鉴于针对不同分析物已有大量可用的RNA切割型DNA酶，且存在多种方法可从随机序列库中筛选出针对新靶标的新型RNA切割型DNA酶，我们预计这种改良的石蕊测试平台可进一步拓展应用于多种目标物的检测。
E. coli 检测的石蕊测试在报告反应时间分别设置为 1 小时和 2 小时时，可检测到 5,000 和 500 个细胞。常用的聚合酶链式反应（PCR）和夹心法酶联免疫吸附测定（ELISA）方法在相似的检测时间内可达到约 104–105 个 E. coli 细胞的检测限25,26。因此，该细菌石蕊测试具有相当的检测灵敏度。
<p class="jove_co...

细菌病原体是全球发病率和死亡率的主要原因之一。由医院获得性感染、食源性病原体以及环境中细菌污染物引发的疫情，对公共卫生与安全构成严重且持续的威胁。为预防此类疫情暴发，亟需能够在多种场景下及时检测病原体的有效工具。尤其在易发生疫情但无力承担昂贵检测设施的地区，人们迫切需要简便、有效、便携且成本低廉的检测方法。1-3 尽管目前已存在多种细菌检测方法，但其中许多方法并不适合作为筛查或现场检测工具，因其检测耗时长、依赖昂贵仪器且操作流程复杂。
比色检测法因其颜色变化可通过肉眼轻易识别，特别适用于床旁检测或现场应用。pH 指示剂测试简单、快速且有效。尽管这项技术已有悠久历史，但由于其简便性和有效性，至今仍被广泛使用。令人惊讶的是，在我们近期开发出用于大肠杆菌（E. coli）检测的改良方法之前，这一简单测试从未被改造用于其他分析物的检测。4
扩展的石蕊测试 E. coli 采用三个额外的组分：一个 E. coli 活化的RNA切割型DNA酶（EC1） 5 尿素酶和磁珠。DNA酶是指具有催化活性的合成单链DNA分子。6 可以从随机序列DNA文库中分离得到 体外 筛选7,8 它们具有高度稳定性，并可利用高效自动化DNA合成技术以较低成本进行生产。9 由于这些原因，脱氧核酶（DNAzymes），特别是切割RNA的脱氧核酶，已被广泛研究用于生物传感应用。6,10,11 用于检测金属离子的RNA切割型DNA酶传感器已得到开发，12-16 小分子，17,18 细菌病原体5,19-21 和癌细胞。22 鉴于靶标诱导的RNA切割型DNA酶具有高度可获得性，任何利用DNA酶的检测方法均有望被拓展用于多种分析物的检测。
选择脲酶是因为其能够将尿素水解为氨23,24，从而导致pH升高。此外，脲酶具有高效性、稳定性，并易于与其他生物分子进行偶联。因此，我们推测将具有RNA切割功能的脱氧核酶与脲酶偶联后，可利用石蕊试验来检测其他目标分子。5
通过使用固定有DNA酶-脲酶偶联物的磁珠，可将切割RNA的DNA酶的作用传递至脲酶介导的pH升高。由于所研究的DNA酶活性严格依赖于E. coli，当待测溶液中存在该细菌时，脲酶将从磁珠上释放进入溶液，随后被转移至含有pH敏感染料的报告溶液中，用于催化尿素水解。该过程的最终结果是产生可通过染料或pH试纸方便检测的颜色变化。

<table><tbody><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）颗粒</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% 十二烷基硫酸钠</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（II）</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠（NaOAc）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% 过硫酸铵（APS）</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酰亚胺基-4-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>脲酶</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% 酚红</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10× T4多核苷酸激酶反应缓冲液</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10× T4 DNA连接酶反应缓冲液</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶（5 U/&amp;#956;l）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Luria Bertani Broth）</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶（10 U/&amp;#956;l）</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>392187</td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 厚间隔条</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12孔梳</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（NanoVue）</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>金属板</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO 离心过滤管</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>磁珠（BioMag）</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;#956;m）</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 培养管</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超声清洗机</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>相机（Canon Powershot G11）</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

使用石蕊试验比色法检测细菌

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

目前，对于可用于现场护理或野外应用的简单且有效的特定病原体检测方法的需求日益增长。这类方法需要具备良好的用户友好性，并能产生可靠的结果，以便专业人员和非专业人员都能轻松解读。pH 石蕊试纸测试因其通过简单的颜色变化报告待测样品的 pH 值，具有操作简便、快速且有效等优点。我们开发了一种方法，利用石蕊试纸测试来实现细菌检测。该方法利用一种细菌特异性的 RNA 切割型 DNA 酶，实现两个功能：识别目标细菌并调控脲酶活性的机制。通过使用固定有 DNA 酶-脲酶偶联物的磁珠，待测样品中细菌的存在会触发脲酶从磁珠释放到溶液中。释放的脲酶被转移至测试溶液，催化尿素水解生成氨，导致 pH 升高，这一变化可通过经典的石蕊试纸测试直观显示。

细菌石蕊测试的原理如图1所示。该测试使用三种关键材料：一种可被特定细菌激活的RNA切割型DNAzyme、脲酶和磁珠。其中，DNAzyme作为分子识别元件，用于实现对目标细菌的高度特异性检测。脲酶和磁珠则用于将DNAzyme的RNA切割活性转化为可检测信号。该过程涉及制备负载脲酶-DNAzyme偶联物的磁珠。当存在目标细菌时，DNAzyme会切割其RNA连接部位，导致脲酶从磁珠上解离。释放出的脲酶可轻松与磁珠分离，并用于在报告溶液中引发颜色变化，该溶液含有尿素和一种pH敏感性染料。脲酶将尿素水解为氨，伴随pH升高，从而引发染料的颜色变化。
图2 展示了一种细菌石蕊测试，其中EC1作为一种 E. coli-响应性切割RNA的DNAzyme作为DNAzyme，酚红作为pH指示染料。EC1此前由本课题组通过体外筛选技术，从随机序列DNA文库中分离获得。 体外...

我们描述了一种利用改良石蕊试验比色检测大肠杆菌（E. coli）的实验方案，该方法结合了RNA切割型DNA酶、脲酶和磁珠技术。

对简单且有效的检测方法的需求日益增长，这些方法可用于现场或即时检测特定病原体。

本实验的总体目标是演示一种用于细菌检测的简单改良石蕊试验。该方法描述了如何将大肠杆菌激活的RNA切割DNA酶与基于脲酶的信号转导平台相结合，以实现对大肠杆菌的响应并产生颜色变化。该技术的两个主要优势在于实验操作的简便性，以及其可适用于其他分析物响应型RNA切割DNA酶的通用性。本实验操作由麦克马斯特大学李应福博士实验室的研究生 Seperh Manchehry 和 Dingran Chang 演示。根据文本方案配制试剂和缓冲液后，通过将 1 毫克 SMCC（琥珀酰亚胺基-4-环己烷-1-羧酸酯，succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate）溶解于 676 微升 DMSO 中，配制 SMCC 储存液。涡旋混匀后置于冰上，待用。将一毫克脲酶溶解于一毫升1× PBS中，并置于冰上保存直至使用。为合成脲酶DNA（UrDNA），向一个2.5毫升微量离心管中加入10微升100微摩尔的LD1。然后加入140微升双蒸水和40微升10× PBS，涡旋混匀。接下来，加入 80.5 µL SMCC 储液和 159.5 µL DMSO。然后再次涡旋混匀，并使用台式离心机短暂离心。将反应液置于 37°C 培养箱或加热块中孵育 60 分钟。孵育结束后，向离心管中加入 200 微升 1× PBS、60 微升 3 摩尔的醋酸钠以及 1.5 毫升预冷的 100% 乙醇。涡旋混匀，于 -20 摄氏度孵育 30 分钟。在 20,000 × g 及 4 摄氏度条件下离心 20 分钟。然后，弃去上清液，并在真空下干燥沉淀。向干燥的沉淀中加入 400 µL 尿素酶储备液，在室温下孵育 5 小时。取 200 µL 粗制结合物转移至预先洗涤过的 100,000 分子量截断离心过滤柱中。将柱子在14,000 × g条件下离心五分钟。将剩余的200微升粗制结合物转移至柱子中，并在14,000 × g条件下离心五分钟。然后，取出柱子并将其倒置放入一个新的2毫升微量离心收集管中。将倒置的离心柱和管在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。移去收集管后，向离心柱中加入 30 µL 1× PBS，以洗涤膜并进一步回收结合物。再次倒置离心柱，并将其放回收集管中。将离心柱在 1,000 × g 条件下离心两分钟。移除并丢弃离心柱。将 UrDNA 在 4 °C 下保存直至使用。为了将大肠杆菌激活的RNA切割DNA酶（EC1）和UrDNA组装到磁珠上，首先充分混匀磁珠储备液，然后取100微升磁珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中。接着将该管置于磁力架上以分离磁珠。用移液器吸除上清液后，向管中加入150微升结合缓冲液（BB）。从支架上取下离心管，轻轻敲击管壁，使磁珠重新悬浮并形成均匀的溶液。将磁珠保持在悬浮状态下，用BB缓冲液再重复洗涤两次后，加入10微升浓度为10微摩尔的EC1。通过轻敲

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