Name: 一个体外血 - 脑屏障使用阻抗谱型号:对T细胞，内皮细胞的相互作用为中心 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解利用阻抗谱技术建立体外血脑屏障模型，研究活化T细胞与内皮细胞相互作用对屏障完整性和通透性的影响。该方法为神经免疫学和自身免疫性中枢神经系统疾病治疗提供重要研究平台。

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我们感谢 Annika Engbers 和 Frank Kurth 在技术上的出色支持，感谢 Markus Schäfer 博士（nanoAnalytics GmbH）在 TEER 测量方面的有益讨论。本工作得到了德国研究基金会（DFG）的资助，项目 SFB1009 A03 支持 HW 和 LK，CRC TR128 项目 A08、Z1 和 B01 支持 LK 和 HW，以及明斯特大学医学院临床研究跨学科中心资助项目 Kl2/2015/14 支持 LK。

所有实验均按照德国动物护理指南，在明斯特大学中心动物实验设施的无特定病原体条件下进行小鼠的繁育和饲养。所有实验均遵循动物实验伦理委员会的指导原则，并经德国北莱茵-威斯特法伦州当地主管部门（LANUV，批准号：84-02.05.20.12.217）批准。
1. MBMEC 的分离与培养
注意：按照先前详细描述的方法分离 MBMEC，但需进行以下修改14：
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死 20 只成年 C57BL/6 小鼠（6-8 周龄），并通过确认心脏和呼吸停止来验证其死亡。</li>
	<li>用 70% 乙醇冲洗小鼠，使用剪刀剪去头部；用镊子和剪刀去除头皮。从枕骨大孔开始，在颅骨左右两侧做切口。从颅骨尾侧抬起颅骨，并用镊子取出脑组织。</li>
	<li>在超净工作台内，使用无菌镊子将脑组织放入培养皿中，去除脑干、小脑和丘脑，仅保留大脑皮层。 
	注意：上述任何步骤均无需使用显微镜。</li>
	<li>将大脑皮层置于一片无菌 Western 印迹纸之上，用镊子轻轻滚动，直至不再可见脑膜。</li>
	<li>经过机械和酶消化处理（参照方案14）后，使用无菌长针头和 5 ml 推注器从密度梯度中收集内皮细胞。内皮细胞表现为红细胞环上方的一层浑浊层。将该层液体 20-25 ml 转移至新的 50 ml 离心管中，并用 DMEM 培养基补足体积。</li>
	<li>经过两轮洗涤14后，将细胞重悬于 6 ml 含嘌呤霉素（4 µg/ml）的 MBMEC 培养基中，并接种至 24 孔板的六个包被孔中；置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养孵育箱（以下简称“孵育箱”）中培养三天。 
	注意：MBMEC 包被液的详细信息见 材料表。</li>
	<li>更换培养基，向每孔加入 1 ml 新鲜的不含嘌呤霉素的 MBMEC 培养基；将培养板放回 37 °C、5% CO2 条件下继续培养两天。</li>
</ol>
2. 收集 MBMEC
<ol>
	<li>在MBMEC分离后的第五天，用MBMEC包被液预包被可渗透性小室：每孔加入80 µl包被液，置于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>小心吸出包被液，让小室在空气中干燥30分钟。向每孔中加入2 ml室温（RT）PBS，用MBMEC洗涤培养基；重复此步骤一次。每孔加入0.05%胰蛋白酶-EDTA（300 µl），将培养板放入培养箱中孵育5–10分钟。</li>
	<li>每孔加入2 ml MBMEC培养基以终止消化。将收集的细胞转移至15 ml离心管中，在4 °C条件下以700 × g离心8分钟。弃去上清液，用1 ml不含嘌呤霉素的MBMEC培养基重悬细胞。</li>
	<li>进行细胞计数：取10 µl细胞悬液与90 µl 0.04%台盼蓝混合（细胞10倍稀释）。将10 µl混合液加入盖玻片与细胞计数室（血细胞计数板）之间。计数计数室四个象限中未被台盼蓝染色的细胞数（N），并按下式计算平均细胞数（N'）：N' = N/4。</li>
	<li>使用以下公式计算细胞浓度（单位为106 个细胞/ml）：C = N' × 104 × 10，其中104由血细胞计数板的尺寸决定，10为步骤2.4中的稀释倍数。</li>
	<li>每孔小室接种2 × 104个细胞，体积为260 µl。向每孔的下室加入810 µl MBMEC培养基。将含小室的培养板置于培养箱中，直至准备进行第4节实验。 
	注意：上下室的体积因小室型号而异，并非适用于所有24孔板格式。</li>
</ol>
3. CD4+ T细胞的分离与刺激
<ol>
	<li>CD4+ T 细胞分离
	<ol>
		<li>通过吸入 CO2 处死一只成年小鼠（6–8 周龄），并通过确认心脏和呼吸停止来验证其死亡。</li>
		<li>将小鼠仰卧置于洁净的解剖板上，用 70% 乙醇冲洗；使用无菌剪刀和镊子切开腹膜，取出脾脏和淋巴结（腹股沟、腋窝、臂部和颈部淋巴结）；最后将组织转移至含有 5 ml PBS 并置于冰上的 15 ml 离心管中。</li>
		<li>在超净工作台内，将含组织的 PBS 倾倒入顶部放置有 70 µm 细胞筛的 50 ml 离心管中；用 1 ml 注射器活塞压过筛网，使组织匀浆化。</li>
		<li>加入 30 ml FACS 缓冲液，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 10 ml FACS 缓冲液中。将悬液通过 40 µm 细胞筛过滤后，向管中再加入 20 ml FACS 缓冲液。</li>
		<li>在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 500 µl FACS 缓冲液中。</li>
		<li>加入 20 µl 小鼠 CD4 磁性微珠，充分混匀并在 4 °C 下孵育 15 分钟。加入 25 ml FACS 缓冲液，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>同时，将 LS 分离柱插入磁铁中，并用 3 ml FACS 缓冲液冲洗。弃去上清液，将细胞重悬于 3 ml FACS 缓冲液中。</li>
		<li>将细胞加至分离柱中。用 3 ml FACS 缓冲液洗涤分离柱三次。将分离柱从磁铁上取下，置于新的 15 ml 离心管上。加入 5 ml FACS 缓冲液，用分离柱活塞冲洗出标记的细胞，并在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于 3 ml T 细胞培养基中。按 2.4 节所述方法计数细胞，并以每孔 100 µl 培养基接种 1 × 105 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD4+ T 细胞刺激
	<ol>
		<li>多克隆 CD4+ T 细胞刺激
		<ol>
			<li>用纯化的抗小鼠 CD3 抗体（克隆号 145-2C11）在 PBS 中以所需终浓度预先包被圆底 96 孔板。例如，若要以 1 µg/ml 的浓度 α-CD3 包被整块板，可将 10 µl 抗体（储存浓度 = 0.5 mg/ml）与 5 ml PBS 混合，涡旋混匀后使用多通道移液器向每孔加入 50 µl 混合液。</li>
			<li>将板置于培养箱中孵育 3 小时。在分离 T 细胞后，用 PBS 洗涤预包被板两次。向分离的 T 细胞中加入纯化的抗-CD28 抗体（克隆号 37.51），使其达到所需终浓度（例如，1 µg/ml）；充分混匀。接种 T 细胞后将其置于培养箱中孵育 2 至 3 天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用树突状细胞（DCs）进行抗原特异性 CD4+ T 细胞刺激 
		注：若使用 DCs 作为抗原呈递细胞（APCs），请遵循 T 细胞分离方案，但作如下修改：
		<ol>
			<li>在匀浆脾脏前，向脾脏中注射 1 ml 含 0.5 mg/ml 的 I 型胶原酶（Collagenase type IA）的 PBS，并将其转移至 15 ml 离心管中。</li>
			<li>在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。用 PBS 洗涤后，将细胞沉淀重悬于 FACS 缓冲液中，并加入 20 µl 小鼠 CD11c 磁性微珠，代替 CD4 微珠。</li>
			<li>使用 MS 分离柱及相应体积：用 1 ml FACS 缓冲液冲洗分离柱；将细胞重悬于 1 ml FACS 缓冲液中，并用 1 ml FACS 缓冲液洗涤分离柱三次。</li>
			<li>向 DCs 中加入所需抗原（例如，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）第 35–55 位氨基酸，浓度为 20 µg/ml），充分混匀后，每孔 96 圆底孔板中接种 5 × 104 个细胞于 100 µl T 细胞培养基中。</li>
			<li>最后，按照 T 细胞分离方案所述，每孔 96 圆底孔板中加入 1 × 105 个 T 细胞于 100 µl T 细胞培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 B 细胞进行抗原特异性 CD4+ T 细胞刺激 
		注：若使用 B 细胞作为 APCs，请遵循 T 细胞分离方案，但作如下修改：
		<ol>
			<li>使用来自转基因小鼠的脾脏，其 B 细胞具有抗原特异性（例如，IgHMOG (Th) 小鼠，其 B 细胞特异性识别 MOG35-55）。</li>
			<li>使用抗原特异性 T 细胞（例如，来自 TCRMOG (2D2) 小鼠）。加入 20 µl 小鼠 CD19 磁性微珠，代替 CD4 微珠。</li>
			<li>向 B 细胞中加入所需抗原（例如，MOG35-55，浓度为 20 µg/ml），充分混匀后，每孔 96 圆底孔板中接种 5 × 104 个细胞于 100 µl B 细胞培养基中。</li>
			<li>按照 T 细胞分离方案所述，每孔 96 圆底孔板中加入 1 × 105 个 T 细胞于 100 µl T 细胞培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 设置并进行经上皮电阻（TEER）测量
<ol>
	<li>将 TEER 仪器的 24 孔模块置于超净工作台内。取下盖子，用镊子将含有 MBMEC 的插入式培养小室放入仪器中。</li>
	<li>用移液器向模块孔的下室加入 810 µl 新鲜培养基：小心地将培养基加在插入式小室与模块孔壁之间的间隙中。</li>
	<li>盖上盖子，将仪器放入培养箱。将仪器连接至计算机；打开仪器控制器并启动软件。</li>
	<li>在弹出窗口中选择“新建测量”。勾选“显示 TEER”和“显示 Ccl”选项，然后点击“开始”。完成第一次测量后，在“结果”选项卡中选择“检查所有孔”，以查看所有孔的 TEER 和 Ccl 值。</li>
	<li>保存文件：文件&#62;另存为&gt;“您的文件名”。 
	注意：由于 TEER 和 Ccl 以自动化方式持续测量，需在三至五天内监测其数值变化。除非细胞活力欠佳（表现为 TEER 未升高），否则无需更换培养基。</li>
	<li>当 Ccl 值稳定且低于 1 µF/cm2，同时 TEER 达到最大水平时，选择此时间点进行 MBMEC 与 T 细胞的共培养。</li>
	<li>仔细检查各孔的绝对 TEER 和 Ccl 值，取消勾选那些 MBMEC 未形成足够融合单层的孔。</li>
	<li>对剩余的孔进行分组：右键单击某一孔，选择“将该孔加入新的平均孔”。在弹出窗口中命名；对所有需要分组的单个孔重复此操作。</li>
	<li>检查所有平均孔，确认共培养前各组初始条件一致。若某些孔的绝对 TEER 值或 TEER 斜率存在显著差异，或标准误过大，请重新分组。 
	注意：理想的孔分组应使实验组内及组间的 TEER 值变异最小化。</li>
	<li>在“实验”选项卡中点击“暂停”，断开仪器连接并将其从培养箱中取出。在超净工作台内取下盖子。</li>
	<li>根据需要准备预先活化的和/或初始状态的 T 细胞，并加入特定细胞因子、抗体或其他物质：例如，将纯化的 NA/LE 大鼠抗小鼠 IFN-γ 抗体（克隆号 XGM1.2）以每孔 20 µg/ml 的终浓度加入 TEER 仪器的 T 细胞悬液中。 
	注意：若使用颗粒酶 B 抑制剂等物质，应在 T 细胞刺激开始时即加入 T 细胞培养体系中：e.g.，颗粒酶 B 抑制剂 II（Calbiochem）以 10 µM 的终浓度溶于 DMSO 后与分离的 T 细胞混合。详见材料与设备部分。</li>
	<li>从插入式小室（上室）中移除部分培养基：e.g.，小心吸取 150 µl 培养基（避免完全移除，以免破坏 MBMEC 单层结构）。</li>
	<li>通过移液器小心加入含 2 × 105 个细胞/插入式小室的 T 细胞悬液 150 µl，使其与 MBMEC 共培养。 
	注意：收获预先活化的 T 细胞时，仅计数呈母细胞样、拒染台盼蓝的活细胞。</li>
	<li>盖上盖子，将仪器放回培养箱。重新连接仪器并点击“继续测量”。24 小时后，在“实验”选项卡中点击“停止”，并保存文件（文件&#62;保存）。</li>
</ol>
5. 数据导出与统计分析
<ol>
	<li>选择“文件&#62;导出”以导出结果。</li>
	<li>在弹出窗口的“&#34;设置&#34;”选项卡中，在“&#34;小数分隔符&#34;”选项下选择“&#34;.dot&#34;”，在“&#34;字段分隔符&#34;”选项下选择“&#34;制表符&#34;”。</li>
	<li>在“&#34;导出结果&#34;”选项卡中，为文件命名，勾选所有需要导出的孔，并在“&#34;选择数据&#34;”选项中勾选“&#34;TEER&#34;”和“&#34;Ccl&#34;”复选框。</li>
	<li>点击“&#34;导出数据&#34;”，打开导出的文件，并将数据复制到电子表格中。</li>
	<li>对导出的数据进行归一化处理（按每个重复样本排序，每次运行（测量）均提供TEER和Ccl值）：将共培养前最后一个时间点的TEER和Ccl值设为100%，并根据该“100%”运行点相应调整所有其他运行点的数值。</li>
	<li>将归一化后的数据复制到所选软件中生成图表，使用单个孔的数据，并显示每个处理组的均值标准误。</li>
	<li>使用所选的统计软件，对多个比较进行双因素方差分析（Two-way ANOVA），并采用Bonferroni校正法。</li>
</ol>

I. Kuzmanov、A. M. Herrmann、S.G. Meuth、H. Wiendl 和 L. Klotz 无任何利益冲突需要披露。H.-J. Galla 是自动细胞监测仪制造商 nanoAnalytics GmbH 的科学顾问。

所述实验方案中的多个步骤对于实验成功至关重要。在初始的脑微血管内皮细胞（MBMEC）分离与培养过程中，应尽可能在无菌条件下操作，以防止真菌孢子或细菌污染细胞培养物。为了获得纯化的内皮细胞（EC）培养体系，建议在培养的前3天使用含有嘌呤霉素（Puromycin）的培养基，该条件可使内皮细胞存活，而其他细胞类型（尤其是周细胞）无法存活41,42。另一个需要特别关注的关键步骤是确定加入预激活T细胞的正确时间点。在跨内皮电阻（TEER）测量的前48小时内，MBMEC在可渗透性插入膜上增殖并逐渐闭合彼此之间的间隙。因此，电容（Ccl）持续下降，直至达到稳定且较低的水平（约0.6 µF/cm2）。这是内皮细胞单层融合的第一个标志，但尚不能代表形成了紧密的屏障。只有当Ccl达到稳定水平后，TEER才开始上升。当紧密连接（TJ）复合体完全形成且内皮屏障完全封闭时，TEER达到最大值。这一平台期通常在内皮细胞重新接种后3至5天内出现，并持续维持24至36小时。加入T细胞的最佳时间点是在平台期的起始阶段，这可确保内皮细胞仍具有足够的活力，能够与T细胞进行共培养。由于T细胞的激活需在共培养的最佳时间点到来之前启动，...

血脑屏障将体循环与中枢神经系统（CNS）分隔开来1-3。它构成一种物理屏障，可抑制细胞的自由移动以及水溶性分子的扩散，从而保护大脑免受病原体和潜在有害物质的侵害。除了屏障功能外，血脑屏障还能向脑实质输送氧气和营养物质，以维持神经组织的正常功能。血脑屏障的功能特性由其细胞和非细胞成分高度调控，其中高度特化的内皮细胞（ECs）是其主要结构组分。血脑屏障的内皮细胞具有紧密连接（TJ）复合体、无窗孔结构、极低的胞饮活性以及持续活跃的转运机制等特征。血脑屏障的其他组分，包括内皮基底膜、包绕内皮的周细胞、星形胶质细胞终足及其相关的实质基底膜，也参与血脑屏障的发育、维持和功能2,4-6，并与神经元和小胶质细胞共同构成神经血管单元（NVU），从而保障中枢神经系统的正常运作7-9。
在多种神经系统疾病（如神经退行性、炎症性或感染性疾病）中，血脑屏障的功能会受到损害2,5,10紧密连接复合物和分子转运机制的失调会导致血脑屏障通透性增加、白细胞外渗、炎症反应及神经元损伤。为了在这些病理生理条件下研究血脑屏障的特性，已有多种 体外 已建立血脑屏障模型9,11,12它们共同为屏障完整性、通透性以及转运机制的变化提供了宝贵的见解。这些模型采用人、小鼠、大鼠、猪或牛来源的内皮细胞13-18；原代内皮细胞或细胞系可单独培养，或与周细胞和/或星形胶质细胞共培养，以更接近地模拟血脑屏障（BBB） 体内19-25近年来，跨内皮电阻（TEER）的测量已成为评估内皮屏障特性的广泛接受的工具。26,27.
跨上皮电阻（TEER）反映了离子流经细胞单层时所受到的阻抗，其降低可敏感地指示内皮屏障完整性的受损，从而表明通透性增加。目前已开发出多种TEER测量系统，包括上皮伏特计（Epithelial Voltohmmeter, EVOM）、电细胞基质阻抗传感技术（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS）以及实时细胞分析系统15,28-30。TEER反映的是相邻内皮细胞（ECs）之间离子流经旁细胞途径时的电阻，与屏障完整性呈正比。在阻抗谱分析中27,31，可测量复杂的总阻抗（Z），通过测定细胞电容（Ccl）进一步提供有关屏障完整性的信息。Ccl与穿过细胞膜的容性电流（跨细胞途径）相关：细胞层在等效电路中表现为一个电容器，将膜两侧的电荷分隔开来，其值与屏障完整性呈反比。当内皮细胞在可渗透的插入式培养小室上生长时，会附着、增殖并铺展于微孔膜表面。这一过程会抑制插入膜本身的背景容性电流（插入膜自身也具有电容特性）&#160;，导致电容逐渐下降至最低水平。随后，紧密连接（TJ）复合物形成，封闭相邻内皮细胞之间的间隙，限制离子通过旁细胞途径的流动，TEER随之升高并最终达到平台期。然而，在炎症条件下，内皮屏障完整性受到破坏：TJ复合物解体导致TEER下降，同时插入膜的容性组分再次上升，引起Ccl增加。
我们的TEER测量采用自动细胞监测32 系统：它遵循阻抗谱学的原理，并拓展了其先前的应用。在此，我们描述了一种 体外 可研究血脑屏障特性的模型，包括脑血管内皮细胞与免疫细胞（特别是活化T细胞）之间的相互作用。此类病理生理状态可见于中枢神经系统的自身免疫性疾病，如多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎。33-37在此过程中，致脑炎性、髓鞘特异性T细胞穿越血脑屏障（BBB）是一个关键步骤。随后，这些T细胞在血管周围间隙被重新激活，并进入脑实质，在此募集其他免疫细胞，介导炎症反应并导致继发性脱髓鞘。1,35,38然而，这类T细胞与血脑屏障主要组成部分——内皮细胞之间相互作用的分子机制尚不明确。本方案旨在填补这一空白，并为内皮细胞所受影响提供新的见解即， 屏障完整性及通透性在与活化T细胞直接接触及其复杂相互作用下的变化
本方案采用原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs），在带有微孔膜的可渗透性插件上以单层形式培养。内皮细胞与CD4+ T细胞共培养，T细胞可预先通过多克隆方式或抗原特异性方式进行活化。MBMECs与预先活化的T细胞（而非初始T细胞）共培养，可导致跨内皮电阻（TEER）下降和细胞旁路通透性（Ccl）升高，从而定量评估MBMECs功能障碍及屏障完整性破坏。该技术具有非侵入性特点：使用内置电极而非夹持式电极，避免对内皮细胞单层造成显著干扰；可在无需细胞标记物的情况下监测屏障功能。该方法以自动化方式连续测量，并能随时间同步独立评估两项屏障参数（TEER和Ccl）。该方法灵敏度足够高，可区分不同水平的T细胞活化状态及其对内皮细胞的不同作用效应。
该方法可应用于多种功能性检测：可在MBMECs与T细胞的共培养体系中加入参与炎症过程的不同细胞因子和/或趋化因子；可使用针对内皮细胞或T细胞表面黏附分子的阻断抗体；也可在T细胞致敏阶段或与内皮细胞共培养期间添加T细胞活化标志物或其细胞毒性功能的抑制剂。该检测方法同样适用于T细胞跨内皮迁移实验，可在加入T细胞前用于评估MBMEC单层的完整性，作为质量控制手段。上述特点使该方法成为研究血脑屏障（BBB）的一种多功能且可靠的工具。 体外，重点关注活化T细胞对内皮细胞单层完整性的效应。这对于理解自身免疫性疾病（如多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎）发病过程中血脑屏障破坏机制尤为重要，因为在这些疾病中，自身反应性致脑炎T细胞会穿越血脑屏障，引发炎症和神经元损伤。

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>包含：24孔细胞模块、控制器、安装有cellZscope软件v2.2.2的PC&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+；转子F21S-8x50y；用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>用于T细胞跨膜迁移分析</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5软件</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>用于T细胞跨膜迁移分析</td></tr><tr><td>Oak Ridge离心管，PC材质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml；用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>Transwell膜插件 - 孔径0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>用于TEER测量作为主要读数指标</td></tr><tr><td>Transwell膜插件 - 孔径3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>用于T细胞跨膜迁移实验前的质量控制TEER测量</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>平底；用于MBMEC培养</td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>圆底；用于免疫细胞培养</td></tr><tr><td>QuadroMACS分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>用于T细胞和B细胞分离；适配MACS LS柱</td></tr><tr><td>OctoMACS分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>用于树突状细胞分离；适配MACS MS柱</td></tr><tr><td>Neubauer计数板</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>细胞筛网，70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>用于免疫细胞分离</td></tr><tr><td>细胞筛网，40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>用于免疫细胞分离</td></tr><tr><td>MACS MultiStand支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>用于免疫细胞分离</td></tr><tr><td>MACS LS分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>用于T细胞和B细胞分离</td></tr><tr><td>MACS MS分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>用于树突状细胞分离</td></tr><tr><td>小鼠CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>用于CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞分离</td></tr><tr><td>小鼠CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>用于B细胞分离</td></tr><tr><td>小鼠CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>用于树突状细胞分离</td></tr><tr><td>人胎盘来源IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>用于MBMEC包被溶液</td></tr><tr><td>牛血浆来源纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>用于MBMEC包被溶液</td></tr><tr><td>胶原酶2（CSL2）</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>胶原酶/分散酶（C/D）</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>用于MBMEC分离</td></tr><tr><td>DMEM（含GlutaMAX）</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>用于MBMEC分离及MBMEC培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>用于MBMEC分离及MBMEC培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>用于MBMEC和免疫细胞分离</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>用于MBMEC培养基</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>用于MBMEC培养基</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>用于MBMEC培养基；仅前3天使用</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>用于收获MBMEC</td></tr><tr><td>IA型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>用于树突状细胞分离</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>用于免疫细胞分离</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>用于T细胞培养基</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>避光保存；用于B细胞培养基</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>用于B细胞培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（100x Glutamax）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>用于B细胞培养基</td></tr><tr><td>小鼠MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;肽</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>用于抗原特异性T细胞活化</td></tr><tr><td>纯化抗小鼠CD3抗体</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>克隆号145-2C11；用于多克隆T细胞活化</td></tr><tr><td>纯化NA/LE抗小鼠CD28抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>克隆号37.51；用于多克隆T细胞活化</td></tr><tr><td>重组小鼠IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>用于T细胞跨膜迁移实验</td></tr><tr><td>重组小鼠TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>用于T细胞跨膜迁移实验</td></tr><tr><td>NA/LE纯化抗小鼠IFN-&amp;gamma;抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>克隆号XMG1.2；推荐终浓度：20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>颗粒酶B抑制剂II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>推荐终浓度：10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE标记抗小鼠CD4抗体</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>克隆号RM4-4；用于T细胞跨膜迁移分析</td></tr></tbody></table>

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦t细胞与内皮细胞的相互作用

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

血脑屏障（BBB）的破坏是多发性硬化症（MS）及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等自身免疫性疾病发展过程中的关键步骤。该过程的特征是活化的T细胞穿过构成血脑屏障主要成分的脑内皮细胞（ECs）。然而，此类T细胞与脑EC相互作用后对EC功能的影响在很大程度上仍不清楚。本文介绍了一种可用于随时间评估原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMEC）功能及屏障完整性的检测方法。该方法利用阻抗细胞谱技术——一种研究内皮细胞单层完整性和通透性的有力工具，通过测量跨内皮电阻（TEER）和细胞层电容（Ccl）的变化来实现。实验结果显示，与EC直接接触时，经刺激的T细胞而非初始T细胞可诱导EC单层功能障碍，表现为TEER下降和Ccl升高。该检测方法能够连续、自动地记录EC单层完整性的变化，其灵敏度足以区分不同强度的刺激以及T细胞活化的不同水平，并可用于研究多种物质（如抗体、药理学试剂和细胞因子）对T细胞-EC相互作用进行靶向调控后的生物学效应。该技术也可用于内皮细胞屏障完整性 体外 T细胞跨内皮迁移实验。这些应用使其成为研究生理和病理生理条件下血脑屏障特性的多功能工具。

图1 提供了对...的总体概述 体外 用于研究T细胞与内皮细胞相互作用的血脑屏障模型。该实验包括三个主要步骤。第一步是从脑皮层中分离原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs），并在培养板中培养五天。当细胞在培养板中达到融合状态后，用胰蛋白酶消化并重新接种到可渗透性插件上，然后将插件置于跨内皮电阻（TEER）测量仪中。连续三至五天持续测量和监测MBMECs的TEER值和细胞旁通透性（Ccl）。在此期间，分离T细胞并进行刺激（第二步），随后培养两至五天，具体时间取决于刺激的类型和强度。第三步是在Ccl处于稳定低水平且TEER达到最大值时，将T细胞加入MBMECs中进行共培养。选择TEER仍处于平台期的时间点进行共培养，对整个实验的成功至关重要。因此，必须谨慎选择T细胞的分离与刺激时间，以确保在将其加入内皮细胞时，T细胞已达到所需的活化水平。加入T细胞后，继续测量一天，随后分析结果。
经过最初的五天培养后，M...

此处，我们描述了一种 体外 利用阻抗细胞谱技术研究活化T细胞与内皮细胞相互作用对血脑屏障完整性及通透性影响的小鼠模型

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

血脑屏障（BBB）的破坏是多发性硬化症（MS）及其动物模型等自身免疫性疾病发展过程中的关键步骤...

本实验的总体目标是研究活化T细胞与内皮细胞相互作用后对内皮细胞完整性和通透性的影响。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如T细胞与内皮细胞之间的直接相互作用如何影响血脑屏障的完整性和通透性。该技术的主要优势在于能够对T细胞与内皮细胞相互作用进行靶向调控的同时，实现屏障功能的自动化、实时评估。该技术的应用前景涉及自身免疫性中枢神经系统疾病治疗，因为它揭示了T细胞介导的血脑屏障破坏这一关键致病机制。本方法主要关注实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间血脑屏障的特性，但也可应用于小鼠或人类血脑 ̄屏障模型，以及其他自身免疫性中枢神经系统疾病的研究。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因原代内皮细胞培养与T细胞活化在最佳时机上的协调困难而面临挑战。我们最初在开展研究时建立了该方法，旨在探究不同T细胞活化水平对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中血脑屏障特性的影响，EAE是多发性硬化症的一种动物模型。该方法的可视化演示至关重要，因为T细胞与内皮细胞共培养体系的建立较难掌握，不同孔之间初始T细胞数量的微小差异可能导致后续实验结果的误读。在分离MBMEC后的第五天开始此操作，每个可渗透插件中加入80微升MBMEC包被液进行预包被。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。从插件中移除MBMEC包被液后，通过向每个孔中加入2毫升室温PBS，1分钟后吸出，清洗MBMEC，并重复此步骤一次。接下来，每孔加入 300 微升含 0.05% 胰蛋白酶的 EDTA 溶液，孵育 5 至 10 分钟。随后，每孔加入 2 毫升 MBMEC 培养基以终止消化反应。然后，将收集的细胞转移至 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度条件下以 700 × g 离心 8 分钟。八分钟后，弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升不含嘌呤霉素的MBMEC培养基中。计数细胞时，取90微升0.04%台盼蓝与10微升细胞悬液混合，用移液器吸取10微升混合液，加至血细胞计数板的盖玻片与计数室之间。接下来，每孔插入液中加入 2 × 10⁴ 个细胞。向每个孔的下室中加入 810 微升 MBMEC 培养基，并将含插入液的培养板放入培养箱中孵育，直至准备进行 TEER 测量。为刺激 CD4 阳性 T 细胞，使用纯化的抗小鼠 CD3 抗体在 37 °C 下预包被圆底 96 孔板 3 小时，抗体终浓度根据需要设定。分离T细胞后，用PBS将预包被的培养板洗涤两次。接着，向分离的T细胞中加入纯化的抗CD28抗体，使其达到所需的终浓度，并充分混匀。然后，将T细胞置于37摄氏度培养两至三天。为建立TEER测量，将TEER仪器的24孔模块置于超净工作台中。取下盖子，用镊子将含有MBMEC的插入式培养小室放入仪器中。随后，用移液器向模块孔的下层室加入810 µL新鲜培养基，加样时应小心地将液体加在插入式小室与模块孔壁之间的间隙处。之后，盖上盖子并将仪器放入培养箱中。将仪器连接到计算机，然后打开仪器控制器并启动软件。在弹出窗口中，选择“新建测量”，并勾选“显示 TER”和“显示 Ccl”复选框。然后，点击开始。完成第一次测量后，在“结果”选项卡中选择“检查所有孔”，以查看所有 TEER 和 Ccl 值。然后，保存文件。接下来，选择在Ccl稳定且低于1 μF/cm²、TEER达到最大值的时间点，将MBMECs与T细胞进行共培养。仔细检查各孔的绝对TEER和Ccl数值，并取消勾选MBMECs未形成足够融合单层的孔，将其排除。通过右键单击孔并选择“将孔添加到新的平均孔”来对剩余的孔进行分组，在弹出窗口中为其命名，并对所有需要分组的单个孔执行相同操作。然后检查所有平均孔，确认它们在共培养前具有相同的初始条件。在实验标签页中，点击暂停。断开仪器连接并将其从培养箱中取出。然后在超净工作台中移去盖子。随后，从插入式培养插件的上层孔室中移去部分培养基。通过小心移液 150 微升培养基，将 T 细胞加入 MBMEC 中。然后重新连接仪器并按下继续测量。24 小时后，在实验选项卡中点击停止并保存文件。图中显示了MBMEC分离后第5天PECAM-1和Cldn-5免疫荧光染色所呈现的梭形形态。图中还展示了分组前和分组后各孔的TEER值和Ccl值。蓝色曲线未用于实验，因为该孔中的MBMEC未形成与其他孔相当的高TEER值。在本实验中，将35至55个特异性CD4阳性T细胞以抗原特异性方式刺激五天。初始T细胞和促炎性细胞因子（干扰素γ和TNF-α）分别作为阴性对照和阳性对照。此处，T细胞由相同剂量的抗CD3和抗CD28抗体刺激，培养三天的T细胞相比仅培养两天的T细胞，表现出更强的屏障破坏倾向。实验结果表明，活化的T细胞可对MBMEC造成显著损伤，而其上清液则无此作用，提示T细胞与MBMEC之间的直接接触对屏障破坏至关重要。另一方面，在T细胞培养中加入颗粒酶B抑制剂2后，MBMEC的完整性得到更大幅度的恢复，表明该细胞溶解分子在导致MBMEC损伤及随后TEER值下降过程中发挥重要作用。若操作熟练，正确实施该实验可在12天内完成。进行该操作时，需特别注意选择合适的T细胞与内皮细胞共培养时间点。采用此方法后，还可进行其他实验，如免疫荧光显微镜、流式细胞术和概率测定。为了回答更多问题，例如：这种相互作用如何影响紧密连接分子的表达、通透性以及T细胞跨膜迁移的程度？该技术建立后，为神经免疫学领域的研究人员探索小鼠中枢神经系统自身免疫性疾病提供了途径。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何评估活化T细胞与内皮细胞之间对血脑屏障完整性和通透性的直接作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一个<em&gt;体外</em&gt;血 - 脑屏障使用阻抗谱型号：对T细胞，内皮细胞的相互作用为中心

本视频展示了一种在体外评估小鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻（TEER）的方法。较高的TEER值表明内皮细胞连接完整，而加入活化的T细胞后TEER值降低，反映出连接屏障的破坏。...

评估体外血脑屏障模型中的跨内皮细胞电阻

本视频展示了一种用于研究病原体穿越血脑屏障（BBB）的体外模型。表达紧密连接的微血管内皮细胞在上室形成内皮层，而神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞则在下室代表脑实质，两者之间由多孔膜隔开。在该BBB模型中进行病毒感染，可模拟病原体从血液进入脑组织的过程。当引入嗜神经病毒后，病毒通过转胞吞作用穿越血脑屏障，感染神经细胞，进行复制并释放子代病毒，从而展示出成功的神经侵入过程。...

一个 体外 研究病原体穿越血脑屏障及脑细胞感染的模型

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外...

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

此处，我们描述了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的跨膜迁移 体外.

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本方案描述了一种建立人血脑屏障（BBB）的方法 体外...

一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

本方案描述了一种可靠且高效的 体外...

bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

在此，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器（ECIS 和 cellZscope）测量脑血管内皮屏障强度的技术。我们详细介绍了制备过程以及向系统中添加各种刺激物的方法和技术。 体外...

利用两种基于阻抗的生物传感器测量癌细胞和细胞因子刺激下脑血管内皮屏障完整性的变化

了解利用阻抗谱技术建立体外血脑屏障模型，研究活化T细胞与内皮细胞相互作用对屏障完整性和通透性的影响。该方法为神经免疫学和自身免疫性中枢神经系统疾病治疗提供重要研究平台。

一个体外利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

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