一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

本实验的总体目标是研究活化T细胞与内皮细胞相互作用后对内皮细胞完整性和通透性的影响。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如T细胞与内皮细胞之间的直接相互作用如何影响血脑屏障的完整性和通透性。该技术的主要优势在于能够对T细胞与内皮细胞相互作用进行靶向调控的同时，实现屏障功能的自动化、实时评估。

该技术的应用前景涉及自身免疫性中枢神经系统疾病治疗，因为它揭示了T细胞介导的血脑屏障破坏这一关键致病机制。本方法主要关注实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间血脑屏障的特性，但也可应用于小鼠或人类血脑 ̄屏障模型，以及其他自身免疫性中枢神经系统疾病的研究。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会因原代内皮细胞培养与T细胞活化在最佳时机上的协调困难而面临挑战。我们最初在开展研究时建立了该方法，旨在探究不同T细胞活化水平对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中血脑屏障特性的影响，EAE是多发性硬化症的一种动物模型。该方法的可视化演示至关重要，因为T细胞与内皮细胞共培养体系的建立较难掌握，不同孔之间初始T细胞数量的微小差异可能导致后续实验结果的误读。

在分离MBMEC后的第五天开始此操作，每个可渗透插件中加入80微升MBMEC包被液进行预包被。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。从插件中移除MBMEC包被液后，通过向每个孔中加入2毫升室温PBS，1分钟后吸出，清洗MBMEC，并重复此步骤一次。

接下来，每孔加入 300 微升含 0.05% 胰蛋白酶的 EDTA 溶液，孵育 5 至 10 分钟。随后，每孔加入 2 毫升 MBMEC 培养基以终止消化反应。然后，将收集的细胞转移至 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度条件下以 700 × g 离心 8 分钟。

八分钟后，弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升不含嘌呤霉素的MBMEC培养基中。计数细胞时，取90微升0.04%台盼蓝与10微升细胞悬液混合，用移液器吸取10微升混合液，加至血细胞计数板的盖玻片与计数室之间。

接下来，每孔插入液中加入 2 × 10⁴ 个细胞。向每个孔的下室中加入 810 微升 MBMEC 培养基，并将含插入液的培养板放入培养箱中孵育，直至准备进行 TEER 测量。为刺激 CD4 阳性 T 细胞，使用纯化的抗小鼠 CD3 抗体在 37 °C 下预包被圆底 96 孔板 3 小时，抗体终浓度根据需要设定。

分离T细胞后，用PBS将预包被的培养板洗涤两次。接着，向分离的T细胞中加入纯化的抗CD28抗体，使其达到所需的终浓度，并充分混匀。然后，将T细胞置于37摄氏度培养两至三天。

为建立TEER测量，将TEER仪器的24孔模块置于超净工作台中。取下盖子，用镊子将含有MBMEC的插入式培养小室放入仪器中。随后，用移液器向模块孔的下层室加入810 µL新鲜培养基，加样时应小心地将液体加在插入式小室与模块孔壁之间的间隙处。

之后，盖上盖子并将仪器放入培养箱中。将仪器连接到计算机，然后打开仪器控制器并启动软件。

在弹出窗口中，选择“新建测量”，并勾选“显示 TER”和“显示 Ccl”复选框。然后，点击开始。完成第一次测量后，在“结果”选项卡中选择“检查所有孔”，以查看所有 TEER 和 Ccl 值。

然后，保存文件。接下来，选择在Ccl稳定且低于1 μF/cm²、TEER达到最大值的时间点，将MBMECs与T细胞进行共培养。仔细检查各孔的绝对TEER和Ccl数值，并取消勾选MBMECs未形成足够融合单层的孔，将其排除。

通过右键单击孔并选择“将孔添加到新的平均孔”来对剩余的孔进行分组，在弹出窗口中为其命名，并对所有需要分组的单个孔执行相同操作。然后检查所有平均孔，确认它们在共培养前具有相同的初始条件。在实验标签页中，点击暂停。

断开仪器连接并将其从培养箱中取出。然后在超净工作台中移去盖子。随后，从插入式培养插件的上层孔室中移去部分培养基。

通过小心移液 150 微升培养基，将 T 细胞加入 MBMEC 中。然后重新连接仪器并按下继续测量。24 小时后，在实验选项卡中点击停止并保存文件。

图中显示了MBMEC分离后第5天PECAM-1和Cldn-5免疫荧光染色所呈现的梭形形态。图中还展示了分组前和分组后各孔的TEER值和Ccl值。蓝色曲线未用于实验，因为该孔中的MBMEC未形成与其他孔相当的高TEER值。

在本实验中，将35至55个特异性CD4阳性T细胞以抗原特异性方式刺激五天。初始T细胞和促炎性细胞因子（干扰素γ和TNF-α）分别作为阴性对照和阳性对照。此处，T细胞由相同剂量的抗CD3和抗CD28抗体刺激，培养三天的T细胞相比仅培养两天的T细胞，表现出更强的屏障破坏倾向。

实验结果表明，活化的T细胞可对MBMEC造成显著损伤，而其上清液则无此作用，提示T细胞与MBMEC之间的直接接触对屏障破坏至关重要。另一方面，在T细胞培养中加入颗粒酶B抑制剂2后，MBMEC的完整性得到更大幅度的恢复，表明该细胞溶解分子在导致MBMEC损伤及随后TEER值下降过程中发挥重要作用。若操作熟练，正确实施该实验可在12天内完成。进行该操作时，需特别注意选择合适的T细胞与内皮细胞共培养时间点。

采用此方法后，还可进行其他实验，如免疫荧光显微镜、流式细胞术和概率测定。为了回答更多问题，例如：这种相互作用如何影响紧密连接分子的表达、通透性以及T细胞跨膜迁移的程度？该技术建立后，为神经免疫学领域的研究人员探索小鼠中枢神经系统自身免疫性疾病提供了途径。

观看本视频后，您应能够较好地掌握如何评估活化T细胞与内皮细胞之间对血脑屏障完整性和通透性的直接作用。