利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

本实验的主要目标是利用转座子系统分离并重编程小鼠羊水细胞。该技术的主要优势在于操作简便。在治疗应用中，可将来自人类疾病胎儿的细胞分化为特定功能细胞，用于药物筛选或组织工程，从而在出生前为患者提供另一种个性化的治疗方案。

该方法有助于解答编程过程中的关键问题。转座子系统在不同细胞类型中均具有高效的转导效率，相较于病毒载体更适用于临床应用，并可实现无外源插入的诱导性多能干细胞（iPS细胞）的制备。

开始分离时，使用70%乙醇清洁母鼠的腹壁。用剪刀沿腹壁中线进行剖腹手术，切开腹壁以进入腹腔。用镊子暴露子宫，然后用剪刀将其切除。

将子宫转移至一个盛有无菌1×PBS的100毫米培养皿中，并置于冰上。将培养皿置于体视显微镜下，放大10倍，用镊子夹住子宫，同时用剪刀去除子宫壁，注意避免损伤胎膜。将胚胎收集到另一个盛有无菌1×PBS的100毫米培养皿中，并置于冰上。

用精细尖头镊子夹住一个胎儿的胎盘，并将其移至一个洁净的100毫米培养皿中。在此小心去除卵黄囊。用镊子破坏羊膜，然后使用胰岛素注射器收集30 µL羊水。

将液体转移至一个15毫升的锥形管中。对每个胎鼠重复此操作，每次均将液体收集到同一个管中。接着，用含有1%胎牛血清的无菌1×PBS洗涤每只胎鼠，并将洗涤液与羊水一同收集到15毫升锥形管中。

将离心管在145 ×g 条件下离心5分钟，然后在超净工作台中弃去上清液。用2 mL羊水培养基重悬沉淀细胞。取经丝裂霉素C处理的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）接种于0.1%明胶包被的六孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每隔一天更换一次培养基。持续培养七天，直至细胞达到转染准备状态。开始转染时，在一个1.5毫升的微量离心管中，加入1微克转座子质粒、0.5微克转座酶表达质粒以及0.5微克反向四环素转录激活因子质粒，混匀。

使用 d-man 将体积稀释至 100 微升。向含有 DNA 的微量离心管中加入 8 微升转染试剂。室温下孵育该混合物 15 分钟。

取含有小鼠AF细胞的六孔板，每孔逐滴加入100微升转染试剂-DNA混合物，轻轻摇晃使液体分布均匀，每孔终体积为2毫升。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，移除培养基，然后每孔加入2毫升新鲜的iPS AF培养基，其中添加1.5微克/毫升多西环素，以诱导Yamanaka因子的表达。

从此时起，每天使用含多西环素的新鲜培养基对细胞进行换液，不再传代。在首次多西环素处理后的24小时内，于荧光显微镜下观察细胞，检测mCherry表达情况，并从此每日持续观察克隆形成情况。一旦观察到克隆形成，挑取单个克隆至50 µL细胞培养基中。

接下来，将细胞依次转移到含有经丝裂霉素C处理的MEF的96孔组织培养板的不同孔中。次日，向每孔加入50微升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟，使集落解离为单个细胞。孵育结束后，用移液器反复吹打液体，进一步分散集落。

将50微升胰蛋白酶细胞混合液转移至含有灭活MEF的新孔中，然后将细胞放回培养箱。当细胞融合度达到60%至70%时，将其传代至24孔板的一个新孔中，并继续在室温下培养。当这些细胞融合度达到60%至70%时，将细胞以1:2比例传代至两个孔中，其中一个孔含有强力霉素，另一个不含强力霉素，以验证在无强力霉素条件下细胞集落仍能生长。

继续在经灭活的MEF上，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用不含多西环素的培养基维持iPS AF细胞集落的培养。每日更换培养基，直至细胞可用于染色、成像和RNA提取。在此，稳定且不依赖多西环素诱导的多能性小鼠羊膜GFP阳性细胞表达了确认重编程成功所必需的多能性标志物。

以R1 ES细胞作为对照进行的RT-PCR分析显示，在有或无多西环素的情况下，均可检测到诱导性多能性标志物的表达。在所有三种细胞类型中均检测到看家基因β2-微球蛋白的表达。对注射诱导性多能细胞后从小鼠体内分离得到的畸胎瘤进行了免疫染色。

在类胚体中检测到甲胎蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和β-III微管蛋白，可证实细胞已分化为全部三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层。此外，对体外培养的类胚体和体内畸胎瘤细胞进行RT-PCR分析，进一步证实了中胚层、内胚层和外胚层特异性标记基因的表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离并重编程小鼠羊水细胞。

这是一种简单且安全的实验方法，也可应用于常规诊断或剖宫产手术所获取的样本中的人类羊水细胞。