从小鼠羊水细胞多能干细胞使用转座子系统的生产
2017年2月28日
在这项研究中，我们使用基于非病毒的转座子系统从小鼠羊水细胞中产生诱导多能干细胞。
该程序的总体目标是使用转座子系统分离和重编程小鼠羊水细胞。这种技术的主要优点是易于执行。在治疗环境中，来自人类疾病胎儿的细胞可以分化为用于药物测试或组织工程的目标细胞，以便在分娩前以另一种方式准备患者特异性治疗。
此方法可以帮助回答编程的关键问题。转座子系统对不同的细胞类型有效。就病毒载体而言，它更适合临床方法，并允许生产无氧基 IPS 细胞。
要开始隔离，请使用 70% 乙醇清洁坝的腹壁。使用剪刀进行中线剖腹手术，切开腹壁的长度以进入腹腔。用镊子露出子宫，然后用剪刀切除。
将子宫转移到装满无菌 1xPBS 的 100 毫米培养皿中并保持在冰上。将培养皿放在 10 倍放大的立体显微镜下，用镊子握住子宫，同时用剪刀去除子宫壁，注意避免损坏胎膜。将胎儿收集到一个装满无菌 1XPBS 的 100 毫米培养皿中，并置于冰上。
用细尖镊子抓住一个胎儿的胎盘，并将其移动到一个干净的 100 毫米培养皿中。在这里，小心地取出蛋黄袋。使用镊子和胰岛素注射器破坏羊膜，收集 30 微升羊水。
将液体转移到 15 mL 锥形瓶中。对每个胎儿重复此过程，每次将液体收集到同一个小瓶中。接下来，用补充有 1% 胎牛血清的无菌 1XPBS 洗涤每个胎儿，并将其与羊水一起收集到 15 毫升锥形管中。
将试管以 145 倍 G 离心 5 分钟，然后在层流罩下去除上清液。将沉淀的细胞重悬于 2 毫升羊水培养基中。取含有肌霉素-C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞或 MEF 的零点 1% 明胶包被的六孔板，然后将 2 毫升细胞接种到板上。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞，每隔一天更换一次培养基。继续培养 7 天，直到细胞准备好进行转染。开始转染时，在 1 点 5 毫限制剂微量离心管中，将 1 μg 转座子质粒与 0 点 5 μg 转座酶表达质粒和 0 点 5 μg 反向四环素反式激活剂质粒混合。
使用 d-man 稀释至 100 μL。将 8 μL 转染试剂加入含有 DNA 的微量离心管中。在室温下孵育此混合物 15 分钟。
取装有小鼠 AF 细胞的 6 孔板，每孔滴加 100 μL 转染剂 DNA 混合物，轻轻涡流分布，每孔的最终体积为 2 mL。将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中放置 24 小时。第二天，去除培养基，然后用 2 毫升新鲜 iPS AF 培养基喂养每个细胞孔，每毫升补充 1 点 5 μg/毫升多西环素，以诱导 Yamanaka 因子的表达。
每天用新鲜的含 dox 的培养基喂养细胞，不要从此时开始通过。在第一次多西西嘧啶处理后 24 小时内，在荧光显微镜下观察细胞，以寻找任何 mCherry 表达，并从此时开始每天观察菌落形成。观察到集落形成后，将单个集落挑取到 50 μL 细胞培养基中。
接下来，将它们依次转移到含有肌裂霉素 c 处理的 MEF 的 96 孔组织培养板的单独孔中。第二天，向每个孔中加入 50 μL 胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，以将菌落解离成单个细胞。孵育后，上下移液以进一步解聚菌落。
将 50 μL 胰蛋白酶细胞混合物转移到含有灭活 MEF 的新孔中，然后将细胞放回培养箱中。当细胞达到 60% 至 70% 汇合时，将它们分成 24 孔板的新孔中，然后在室温下继续孵育。一旦这些细胞达到 60% 到 70% 的汇合度，将细胞 1 到 2 翻转到两个孔中，一个含有多西环素，另一个不含多西环素，以验证在没有多西环素的情况下集落也会生长。
在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中，继续在灭活的 MEF 上维持 IPS AF 菌落和多西环素非依赖性培养基。每天更换培养基，直到细胞准备好进行染色、成像和 RNA 提取。在这里，稳定的非依赖性多西环素诱导的胸膜全能小鼠羊膜 GFP 阳性细胞表达确认成功重编程所需的胸膜效力标志物。
使用 R1 ES 细胞作为对照的 RTPCR 分析显示，在存在或不存在多西环素的情况下，诱导的胸膜有弹性标志物的表达。在所有三种细胞类型中也观察到看家基因 β 2 微球蛋白的表达。对注射诱导胸膜能细胞的小鼠分离的畸胎瘤进行免疫染色。
在肿块中检测到 α 胎儿蛋白、α 平滑肌肌动蛋白和 β 3 微管蛋白，可确认细胞分化为所有三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层。此外，体外拟胚体和体内畸胎瘤细胞的 RTPCR 分析证实了中胚层、内胚层和外胚层的胚层特异性标记基因的表达。观看此视频后，您应该对如何分离和重编程小鼠羊水细胞有很好的了解。
这是一种简单、安全的程序，也可以从常规诊断或剖宫产中获得的样本中应用于人类羊水细胞。
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概述
本研究聚焦于使用非病毒基因转座子系统从小鼠羊水细胞中生成诱导多能干细胞。该技术因其使用简便和潜在的治疗应用而具有优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 转座子技术
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）可以从多种细胞类型中获得。
- 羊水细胞提供了一种用于生成iPSC的非侵入性来源。
- 转座子系统为病毒载体提供了一种更安全的替代方案。
- 该方法可以促进分娩前的患者特异性治疗。
研究目的
- 分离和重新编程小鼠羊水细胞。
- 探索转座子系统在生成iPSCs中的效率。
- 评估其在药物测试和组织工程中的治疗应用潜力。
使用的方法
- 小鼠羊水细胞的分离。
- 应用非病毒转座子系统进行重新编程。
- 生成的iPSCs的表征。
- 评估用于治疗用途的分化潜力。
主要结果
- 成功从小鼠羊水细胞中生成iPSCs。
- 展示了转座子系统在不同细胞类型中的效率。
- 在患者特异性治疗中的临床应用潜力。
- 生产无氧化物的iPSCs，提高了治疗用途的安全性。
结论
- 转座子系统是生成iPSCs的可行方法。
- 这种方法可以推动再生医学的进步。
- 需要进一步研究以探索其全部治疗潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This transposon-based reprogramming method enables generation of patient-specific iPSCs from amniotic fluid, offering a non-viral, clinically translatable approach for prenatal disease modeling and therapeutic screening. By producing oxino-free iPSCs capable of trilineage differentiation, the technique supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines. Its simplicity and scalability position it as a reusable platform for discovery-stage workflows focused on congenital disorder therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of disease mechanisms using genetically matched human fetal cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a renewable, patient-derived cellular system for validating target engagement in a disease-relevant context.
- Predictive Value: Supports preclinical confidence by generating isogenic controls from amniotic fluid-derived iPSCs for pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized iPSC lines suitable for high-content screening of compounds targeting developmental pathways.
- Quantitative Output: Enables measurable differentiation readouts across germ layers for dose-response and phenotypic profiling.
- Platform Reuse: Establishes a scalable, non-viral reprogramming system adaptable to multiple disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Facilitates creation of in vitro and in vivo teratoma models to assess differentiation potential and safety profiles.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation through consistent germ layer marker expression in embryoid bodies and teratomas.
- Risk Mitigation: Reduces biological variability by using clonal, doxycycline-independent iPSC lines for reproducible preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through disease-relevant cellular models and enabling lead identification via differentiation-based assays. It feeds into preclinical research by providing scalable, characterized iPSC sources for mechanistic studies and safety assessment. As a non-viral reprogramming platform, it offers enterprise-level reuse across multiple projects requiring patient-specific pluripotent cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using amniotic fluid-derived iPSCs that reflect fetal genetic backgrounds.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell sources with quantifiable germ layer differentiation for compound evaluation.
- Analytics: Generates measurable outputs including germ layer-specific marker expression and teratoma formation for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity from in vitro embryoid bodies to in vivo teratoma models, validating differentiation capacity.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized, non-viral reprogramming capability applicable to diverse congenital disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through disease-relevant, genetically matched iPSC models with demonstrated pluripotency.
- Operational Value: Offers a simple, non-viral workflow with high reproducibility and minimal biosafety constraints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early biological de-risking of therapeutic targets in prenatal disease contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of congenital disorder programs using patient-derived preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, transfection, and pluripotency characterization.
- Dependent on access to amniotic fluid samples and appropriate feeder cell systems (MEF).
- Necessitates standardized doxycycline induction and withdrawal protocols for clonal line validation.
- Involves teratoma formation and germ layer staining for functional pluripotency confirmation.
- Limited by the availability of gestational samples and ethical considerations in fetal tissue use.
