Name: 从小鼠羊水细胞多能干细胞使用转座子系统的生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解如何使用转座子系统从小鼠羊水细胞中生成诱导多能干细胞。该方法利用非病毒载体技术，为再生医学和患者特异性治疗提供安全高效的细胞重编程方案。

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本工作由 CARIPARO 基金会资助项目（编号 13/04）和希望之城儿科研究基金会资助项目（编号 10/02）支持。Martina Piccoli、Chiara Franzin 和 Michela Pozzobon 由希望之城儿科研究基金会资助。Enrica Bertin 由 CARIPARO 基金会资助项目（编号 13/04）资助。Paolo De Coppi 由大奥蒙德街医院儿童慈善机构资助。

所有操作均符合意大利法律。小鼠羊水（AF）样本取自妊娠13.5天（d.p.c.）的C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J转基因小鼠，该小鼠称为GFP小鼠。
1. 转座子制备
注意：转座子表达载体通过标准克隆程序构建。用于小鼠AF细胞转染的质粒DNA使用商业试剂盒制备。
<ol>
	<li>在1.5 ml微量离心管中，将10 ng质粒DNA与50 µl DH5α细菌混合。将微量离心管置于冰上孵育20分钟。</li>
	<li>42 °C热激40秒。</li>
	<li>将微量离心管放回冰上放置2分钟。</li>
	<li>加入250 µl预热（37 °C）的LB（Lysogeny Broth）培养基，于37 °C以300 rpm振荡培养30分钟。</li>
	<li>取每种转化产物30 µl涂布于含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上。待平板干燥后，倒置并在37 °C过夜培养。</li>
	<li>次日下午，用无菌的200 µl枪头从每种转化产物中挑取3个单菌落，转移至含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中。</li>
	<li>于37 °C以300 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>使用商业质粒提取试剂盒进行质粒纯化。将纯化后的质粒于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养
<ol>
	<li>用 0.1% 明胶包被 6 孔板
	<ol>
		<li>在生物安全柜中向每个 6 孔板的孔中加入 1 ml 无菌的 0.1% 明胶溶液。将板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，使明胶聚合。</li>
		<li>弃去多余液体，将板干燥 1 小时。</li>
		<li>用封口膜密封后于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用丝裂霉素 C 处理 MEF 细胞使其失活
	<ol>
		<li>将一管含 4 × 106 个 MEF 细胞的冻存细胞在 37 °C 水浴中快速解冻。</li>
		<li>在生物安全柜中将 MEF 细胞接种至培养皿（150 mm）中，使用 MEF 培养基。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
		<li>&#8203;（注意）当细胞达到完全汇合时，加入丝裂霉素 C（5 mg/mL）。</li>
		<li>将细胞置于培养箱（37 °C、5% CO2）中孵育 3 小时。</li>
		<li>移除含丝裂霉素 C 的培养基，用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。</li>
		<li>加入 2 ml 商品化胰蛋白酶溶液，将细胞置于 37 °C 培养箱中消化 5 分钟。随后加入 18 ml 阻断培养基以终止胰酶反应。</li>
		<li>按照制造商说明书，使用血球计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>以 145 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将失活的 MEF 细胞以 60,000 个细胞/cm2 的密度接种至 0.1% 明胶包被的培养板中。</li>
		<li>在接种羊水细胞和/或 iPS-AF 细胞前，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠AF细胞的分离
<ol>
	<li>设置定时交配，并在合笼24小时后检查阴道栓。</li>
	<li>观察至妊娠13.5天，通过颈椎脱位法处死怀孕母鼠。</li>
	<li>用70%乙醇清洁动物的腹壁。</li>
	<li>使用剪刀沿腹壁中线做剖腹切口，切开腹壁以进入腹腔。</li>
	<li>用镊子暴露子宫，用剪刀取出子宫并转移至一个盛有无菌1×PBS、置于冰上的100 mm培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下以10倍放大倍数收集羊水。</li>
	<li>用镊子夹住子宫，用剪刀去除子宫壁。注意避免损伤胎膜，防止羊水泄漏。</li>
	<li>将胚胎收集到一个盛有无菌1×PBS、置于冰上的100 mm培养皿中。</li>
	<li>用尖头镊子夹住一个胚胎的胎盘，将其放入一个干净的100 mm培养皿中。</li>
	<li>用尖头镊子去除卵黄囊。</li>
	<li>用尖头镊子破坏羊膜，使用胰岛素注射器为每个胚胎收集30 µl羊水，注入15 ml锥形管中。</li>
	<li>收集羊水后，用添加1%胎牛血清（FBS）的无菌1×PBS洗涤每个胚胎，并将其收集至含有羊水的15 ml锥形管中。</li>
	<li>将羊水在145 × g下离心5分钟。在生物安全柜中弃去上清液，接种沉淀的羊水细胞。</li>
</ol>
4. 小鼠AF细胞培养
<ol>
	<li>小鼠羊水细胞的接种
	<ol>
		<li>接种前一天，准备经0.1%明胶包被并用丝裂霉素C处理的MEF饲养层6孔板。</li>
		<li>收集羊水后，将羊膜穿刺获得的细胞（约来自6个胎儿的1 × 107个细胞）接种至有丝分裂失活的MEF上，使用羊水培养基进行培养。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下培养，每隔一天更换一次培养基。</li>
		<li>培养7天后，按照下述步骤对羊水细胞进行转染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 转染、iPS-AF 细胞的生成与培养
注意：小鼠AF细胞共转染了PB-tetO2-IRES-OKMS转座子质粒、转座酶表达质粒（mPBase）以及反向四环素转录激活因子（PB-CAG-rtTA）转座子质粒。所有质粒均由Andras Nagy教授提供33。
<ol>
	<li>在1.5 ml微量离心管中，将1 µg PB-tetO2-IRES-OKMS、0.5 µg mPBase和0.5 µg PB-CAG-rtTA混合（总DNA量：2 µg）。</li>
	<li>用无血清培养基（Dulbecco改良Eagle培养基 - DMEM）将DNA稀释至100 µL。</li>
	<li>向含有DNA的1.5 mL微量离心管中加入8 µL转染试剂（例如，FUGENE）（质粒DNA与转染试剂的比例为2 µg（DNA）: 8 µL转染试剂）。</li>
	<li>将转染试剂/DNA混合物在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将100 µL转染试剂/DNA混合物逐滴加入含小鼠AF细胞的6孔板中，每孔最终体积为2 mL，轻轻摇晃混匀。继续培养24小时。</li>
	<li>次日，通过更换新鲜的iPS-AF培养基（每孔2 mL）并补充1.5 µg/mL多西环素，诱导Yamanaka因子（Oct4、Klf4、cMyc、Sox2）的表达。</li>
	<li>每天更换含多西环素的新鲜培养基，期间不进行传代（维持细胞在含多西环素的培养基中，直至步骤5.13）。</li>
	<li>转染后24小时内观察mCherry表达情况，并每日观察克隆形成（克隆通常在转染后20至30天之间出现）。</li>
	<li>在挑取克隆前一天，准备一个含有经丝裂霉素C处理的MEF的96孔组织培养板。</li>
	<li>使用200 µL移液器吸取50 µL体积挑取单个克隆，并依次转移至96孔板的各个独立孔中。</li>
	<li>次日，在每个克隆中加入50 µL商用胰蛋白酶，37 °C孵育5分钟，使克隆解离为单细胞。</li>
	<li>反复吹打以充分解离克隆。</li>
	<li>将含有解离后克隆的50 µL胰蛋白酶溶液转移至新的孔中，该孔为预先铺有经灭活处理的MEF、并用0.1%明胶包被的96孔板，孔内已加入含多西环素的100 µL新鲜iPS-AF培养基。</li>
	<li>当细胞达到60-70%汇合度时，传代至24孔板的一个孔中。</li>
	<li>当细胞再次达到60-70%汇合度时，以1:2比例传代至两个孔，一孔含多西环素，另一孔不含多西环素，以验证在无多西环素条件下是否仍有克隆形成。</li>
	<li>继续在iPS-AF培养基中维持iPS-AF克隆的培养，不再依赖多西环素，并在经灭活处理的MEF上培养。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养，每天更换培养基。</li>
</ol>
6. 碱性磷酸酶染色
<ol>
	<li>当出现强力霉素非依赖性iPS-AF细胞时，按照制造商的说明书进行碱性磷酸酶染色。</li>
</ol>
7. 免疫荧光
<ol>
	<li>每当出现强力霉素非依赖性 iPS-AF 细胞时，以 150,000 个细胞/cm² 接种2 在含有灭活MEF的24孔板的一个孔中接种细胞，在37 °C、5% CO₂条件下培养48小时2.</li>
	<li>（注意）每孔加入 300 µl 4% 多聚甲醛（PFA），室温固定 15 分钟。</li>
	<li>加入300 µl 0.1% NP-40以透化细胞。</li>
	<li>用 300 µl 的 0.1% PBS-Tween 20 洗涤细胞。</li>
	<li>加入300 µl封闭缓冲液（含10%马血清的1x PBS），室温孵育1小时。</li>
	<li>使用以下一抗：Oct4（1:80）、Sox2（1:80）、Klf4（1:80）、Nanog（1:100）和 SSEA1（1:80）。将 SSEA1 用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）、10% 正常山羊血清和 0.3 M 甘氨酸的 0.1% PBS-Tween-20 溶液稀释。其余抗体均用含 10% 马血清的 1× PBS 溶液稀释。</li>
	<li>4 °C 条件下孵育抗体过夜。</li>
	<li>用 300 µl 的 0.1% PBS-Tween-20 洗涤。</li>
	<li>使用10%马血清的1×PBS溶液稀释二抗：Alexa594标记的山羊抗小鼠IgG（1:200）、Alexa594标记的鸡抗山羊IgG（1:200）、Alexa594标记的鸡抗兔IgG（1:200）、Alexa568标记的山羊抗小鼠IgM（1:200）。室温孵育2小时。</li>
	<li>用1×PBS冲洗。</li>
	<li>用1:10,000的Hoechst溶液在1x PBS中孵育细胞以染色细胞核。</li>
</ol>
8. 体外 细胞分化
<ol>
	<li>通过悬滴法形成拟胚体（EB），将单个液滴（2,000 个细胞/20 µl）接种至培养皿盖上，使用分化培养基。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 4 天。</li>
	<li>将 EB 转移至细菌级 100 mm 培养皿中，在分化培养基中进行悬浮培养，持续 3 天。</li>
	<li>将 EB 接种于经基底膜基质（以 DMEM 按 1:10 稀释）包被的 24 孔板中，继续培养 14 天。</li>
	<li>进行免疫荧光分析时，使用以下一抗：T（1:100）、αfp（1:200）和 Tubb3（1:500）37。</li>
</ol>
9. 体内 畸胎瘤形成
<ol>
	<li>向 Rag2-/-γc-/- 小鼠后肢肌肉中注射含有 1 × 106 个 iPS-AF 细胞的 100 µl 1× PBS。</li>
	<li>细胞注射后 6 周，通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>从小鼠后肢取出因体积明显而可辨识的肿瘤组织，用于后续分析。</li>
	<li>使用冷冻切片机对异戊烷速冻的肿瘤组织切取 7–10 µm 厚的横切片。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（HE）染色：
	<ol>
		<li>按照试剂生产商的说明书进行 HE 染色，以评估肿瘤组织的组成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫过氧化物酶染色：
	<ol>
		<li>用 4% 多聚甲醛在室温下固定畸胎瘤切片 15 分钟。</li>
		<li>用 0.1% Triton X-100 进行透化处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片与以下一抗在含 1% BSA 的 1× PBS 中孵育：Tubb3（1:100）、αfp（1:50）和 αSMA（1:100）；Tubb3 在 37 °C 孵育 1 小时，其余抗体在 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>用 100% 甲醇处理 20 分钟以封闭过氧化物酶活性。</li>
	<li>加入 HRP 标记的抗小鼠二抗（1:150），在 37 °C 孵育 45 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 漂洗。</li>
	<li>加入过氧化物酶（HRP）底物（见材料表），孵育 5 分钟。</li>
	<li>用自来水漂洗 5 分钟。</li>
	<li>用苏木精 QS 染色 9 秒。</li>
	<li>用自来水漂洗。</li>
</ol>
10. 细胞中RNA的提取
<ol>
	<li>根据制造商推荐的方案，使用商用RNA提取试剂盒。</li>
</ol>
11. 畸胎瘤中RNA的提取
<ol>
	<li>使用研钵和研杵在液氮中匀浆畸胎瘤组织，以避免样品解冻。</li>
	<li>称取 25 mg 组织。</li>
	<li>加入 1 mL 商业RNA提取试剂和 200 µL 氯仿。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 13,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。</li>
	<li>将澄清的上清液转移至新离心管中。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用商业RNA提取试剂盒纯化RNA。</li>
</ol>
12. 逆转录-聚合酶链式反应分析
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用逆转录（RT）-聚合酶链式反应（PCR）的逆转录酶和寡聚（dT）合成第一链cDNA，以获得50 ng/µL的cDNA。用无RN酶的水将cDNA稀释至10 ng/µL的浓度。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用DNA聚合酶进行RT-PCR，采用1 ng/µL的cDNA。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

选择何种方法诱导多能性，对于细胞在长期移植中的临床安全性具有重要意义。目前，已有多种适用于重编程的方法。在非整合性方法中，仙台病毒（Sendai virus, SeV）载体是一种RNA病毒，可在不整合到感染细胞核基因组的情况下产生大量蛋白质40，因此可作为获取诱导性多能干细胞（iPS细胞）的一种策略。SeV载体可能是生成可用于转化研究的iPS细胞的理想候选方法之一，但也存在一些不足之处。该病毒的复制酶对转基因序列的性质较为敏感。由于SeV载体具有持续复制能力，即使采用多种策略来改善这一问题，仍难以从宿主细胞中彻底清除41,42。该方法需要特殊的操作条件，例如需使用二级生物安全柜。目前仅有单一的商业供应商提供该载体。尚无可用于临床级别的SeV重编程工具，且iPS细胞的生产成本较高。
由于这些优势，与SeV载体相比，转座子系统可被视为一种更优的方法，本文证实该系统是一种适用于重编程小鼠羊水细胞的、具有多种优势的合适方法。该...

产前诊断是评估遗传性疾病（例如染色体畸变、单基因或多基因/多因素疾病）和先天性畸形（例如先天性膈疝、囊性肺部病变、腹裂、脐膨出）的重要临床工具。羊水（AF）细胞可通过妊娠中期常规安排的操作（例如羊膜穿刺术、羊水减量术）或剖宫产手术轻松获取1,2。来自产前或新生儿患者的羊水细胞的可获得性，为将其作为再生医学的来源提供了可能，已有若干研究人员探讨了利用从羊水中分离出的干细胞群体治疗不同组织损伤或疾病的可能性3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。在疾病常处于稳定状态的时间窗口内，从患病患者中便捷地获取羊水细胞，为将此类细胞用于重编程目的提供了可能。事实上，由羊水细胞衍生的诱导性多能干细胞（iPS细胞）可被分化为目标细胞，用于体外药物筛选或组织工程策略，从而在出生前为患者制定合适的个体化治疗方案。已有大量研究证实，羊水细胞具有被重编程并分化为多种细胞类型的能力13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。
自从Takahashi和Yamanaka28发现通过强制表达四种转录因子（Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）可将体细胞重编程以来，重编程领域已取得显著进展。根据不同的方法，可将其分为病毒性和非病毒性两类。前者依赖病毒载体（如逆转录病毒和慢病毒），虽然效率较高，但通常无法完全沉默逆转录病毒的转基因，从而可能导致部分重编程的细胞系，并存在插入突变的风险29,30,31。非病毒方法则采用多种策略：例如质粒、载体、mRNA、蛋白质和转座子。获得无转基因序列的诱导多能干细胞（iPS细胞）旨在避免渗漏性转基因表达和插入突变可能带来的有害影响。在上述所有非病毒策略中，PiggyBac（PB）转座子/转座酶系统仅需转座子两端的反向末端重复序列以及转座酶的瞬时表达，即可催化插入或切除事件32。相较于其他iPS细胞生成方法，使用转座子的主要优势在于可通过非病毒载体策略获得无载体的iPS细胞，且效率与逆转录病毒载体相当。这一目标可通过在iPS细胞中再次瞬时表达转座酶，从而无痕切除编码重编程因子的整合型转座子来实现33。鉴于PB系统在多种细胞类型中均具有高效性34,35,36,37，相较于病毒载体更适用于临床应用，并且能够在无异源条件（xeno-free）下生成iPS细胞，而目前的病毒制备方案通常依赖异源环境，因此该系统被用于从小鼠羊水（murine AF）中获取iPS细胞。
本文提出了一种详细的实验方案，基于已发表的研究，展示从小鼠羊水细胞（iPS-AF细胞）生成多能性诱导多能干细胞克隆（iPS克隆）的方法38。

<table><tbody><tr><td>100 mm 细菌级培养皿&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>用于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 分化</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>Alexa568 标记的山羊抗小鼠 IgM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>二抗（免疫荧光）</td></tr><tr><td>Alexa594 标记的鸡抗山羊 IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>二抗（免疫荧光）</td></tr><tr><td>Alexa594 标记的鸡抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>二抗（免疫荧光）</td></tr><tr><td>Alexa594 标记的山羊抗小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>二抗（免疫荧光）</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>碱性磷酸酶&amp;nbsp;染色</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>用于细菌筛选</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA，用于封闭液，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>用于克隆实验的细菌</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>用于 MEF、小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>强力霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>用于外源因子表达</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>72.706</td><td>用于 PB 制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胚胎干细胞级胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>用于 MEF 培养基</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&amp;nbsp;</td><td>羊水细胞分离</td></tr><tr><td>明胶</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>使用浓度为 0.1%，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>用于封闭液，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>哈瑞苏木素 QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>HE&amp;nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>畸胎瘤组织学分析</td></tr><tr><td>Hoechst&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>马血清&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>用于封闭液</td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>二抗（免疫过氧化物酶法）</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>过氧化物酶底物</td></tr><tr><td>带针头的胰岛素注射器（25 G）</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>羊膜穿刺术操作</td></tr><tr><td>Klf4&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>兔多克隆 IgG</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Lennox）</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>用于细菌培养</td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>用于小鼠羊水细胞和 iPS-AF 细胞培养基</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>用于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 分化，用 DMEM 稀释至 1:10</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>过氧化物酶封闭</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>用于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 分化</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>用于 MEF、小鼠羊水细胞和 iPS-AF 细胞培养</td></tr><tr><td>Nanog&amp;nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>兔多克隆 IgG</td></tr><tr><td>非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>用于小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>用于封闭液，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>小鼠单克隆 IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寡聚脱氧胸苷酸 [Oligo (dT)]&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>用于 RT-PCR</td></tr><tr><td>多聚甲醛（溶液）</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA，固定剂，用 PBS 稀释</td></tr><tr><td>PBS 10×</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，用无菌水稀释至 PBS 1×</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>用于 MEF、小鼠羊水细胞、iPS-AF 细胞及分化培养基</td></tr><tr><td>培养皿（150 mm）</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>用于 MEF 培养、组织培养</td></tr><tr><td>PiggyBac 转座酶表达质粒&amp;nbsp;</td><td>由 Andras Nagy 教授实验室提供</td><td>-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS 转座子质粒</td><td>由 Andras Nagy 教授实验室提供</td><td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>用于质粒纯化</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>用于质粒纯化</td></tr><tr><td>反向四环素转录激活因子转座子质粒&amp;nbsp;</td><td>由 Andras Nagy 教授实验室提供</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>Sox2&amp;nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>山羊多克隆 IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>小鼠单克隆 IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>用于 RT-PCR</td></tr><tr><td>T&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>兔多克隆 IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>细胞传代</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubb3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G712A</td><td>小鼠单克隆 IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>用于细胞通透化，用 1× PBS 稀释</td></tr><tr><td>&amp;alpha;fp&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>小鼠单克隆 IgG1</td></tr><tr><td>&amp;alpha;SMA&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>小鼠单克隆 IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转染试剂（FuGENE HD）</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E2311</td><td>用于羊水细胞转染</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>用于进行羊膜穿刺术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 吸头</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>70.760012</td><td>用于挑取细菌菌落</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 不锈钢 25U</td><td>用于进行羊膜穿刺术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>用于清洁妊娠母鼠腹壁</td></tr><tr><td>组织培养用培养皿（150 mm）&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>用于 MEF 扩增</td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>用于 MEF 失活</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>用于 iPS-AF 细胞培养</td></tr></tbody></table>

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

诱导性多能干细胞（iPS细胞）可通过不同方法强制表达特定转录因子，由小鼠和人类体细胞生成。本文中，我们利用非病毒转座子系统从小鼠羊水细胞诱导产生iPS细胞。所获得的所有iPS细胞系均表现出多能性细胞的特征，包括向三个胚层衍生物分化的潜能。 体外 和 体内这一策略为利用患病胎儿的细胞开发出生缺陷的新疗法提供了可能。

为评估重编程能力，从小鼠GFP胚胎中收集羊水细胞（AF细胞）。将细胞转染环状转座子质粒PB-tetO2-IRES-OKMS（该质粒以多西环素可诱导的方式表达与mCherry荧光蛋白连接的Yamanaka因子Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）以及PB-CAG-rtTA质粒和转座酶表达质粒（mPBase）。在培养1周后，对小鼠AF细胞进行Oct4、Klf4、cMyc和Sox2的转染。 体外 在MEF饲养层上进行扩增。为了表达外源因子，转染后的第二天加入多西环素，浓度为 1.5 µg/mL，如先前所述39mCherry 的表达在添加强力霉素 24 小时后可见，表明转染成功。在强力霉素诱导 20 天后出现首批具有胚胎干细胞样形态的克隆，于转染后 30 天进行挑取。这些克隆被接种至灭活的成纤维细胞饲养层上。挑取后，存活的克隆在添加强力霉素的培养基中继续传代数次，直至在重复孔中确认其不再依赖强力霉素33.
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本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。

诱导性多能干细胞（iPS细胞）通过强制表达特定转录因子，由小鼠和人类体细胞重编程获得，方法包括……

本实验的主要目标是利用转座子系统分离并重编程小鼠羊水细胞。该技术的主要优势在于操作简便。在治疗应用中，可将来自人类疾病胎儿的细胞分化为特定功能细胞，用于药物筛选或组织工程，从而在出生前为患者提供另一种个性化的治疗方案。该方法有助于解答编程过程中的关键问题。转座子系统在不同细胞类型中均具有高效的转导效率，相较于病毒载体更适用于临床应用，并可实现无外源插入的诱导性多能干细胞（iPS细胞）的制备。开始分离时，使用70%乙醇清洁母鼠的腹壁。用剪刀沿腹壁中线进行剖腹手术，切开腹壁以进入腹腔。用镊子暴露子宫，然后用剪刀将其切除。将子宫转移至一个盛有无菌1×PBS的100毫米培养皿中，并置于冰上。将培养皿置于体视显微镜下，放大10倍，用镊子夹住子宫，同时用剪刀去除子宫壁，注意避免损伤胎膜。将胚胎收集到另一个盛有无菌1×PBS的100毫米培养皿中，并置于冰上。用精细尖头镊子夹住一个胎儿的胎盘，并将其移至一个洁净的100毫米培养皿中。在此小心去除卵黄囊。用镊子破坏羊膜，然后使用胰岛素注射器收集30 µL羊水。将液体转移至一个15毫升的锥形管中。对每个胎鼠重复此操作，每次均将液体收集到同一个管中。接着，用含有1%胎牛血清的无菌1×PBS洗涤每只胎鼠，并将洗涤液与羊水一同收集到15毫升锥形管中。将离心管在145 ×g 条件下离心5分钟，然后在超净工作台中弃去上清液。用2 mL羊水培养基重悬沉淀细胞。取经丝裂霉素C处理的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）接种于0.1%明胶包被的六孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每隔一天更换一次培养基。持续培养七天，直至细胞达到转染准备状态。开始转染时，在一个1.5毫升的微量离心管中，加入1微克转座子质粒、0.5微克转座酶表达质粒以及0.5微克反向四环素转录激活因子质粒，混匀。使用 d-man 将体积稀释至 100 微升。向含有 DNA 的微量离心管中加入 8 微升转染试剂。室温下孵育该混合物 15 分钟。取含有小鼠AF细胞的六孔板，每孔逐滴加入100微升转染试剂-DNA混合物，轻轻摇晃使液体分布均匀，每孔终体积为2毫升。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，移除培养基，然后每孔加入2毫升新鲜的iPS AF培养基，其中添加1.5微克/毫升多西环素，以诱导Yamanaka因子的表达。从此时起，每天使用含多西环素的新鲜培养基对细胞进行换液，不再传代。在首次多西环素处理后的24小时内，于荧光显微镜下观察细胞，检测mCherry表达情况，并从此每日持续观察克隆形成情况。一旦观察到克隆形成，挑取单个克隆至50 µL细胞培养基中。接下来，将细胞依次转移到含有经丝裂霉素C处理的MEF的96孔组织培养板的不同孔中。次日，向每孔加入50微升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟，使集落解离为单个细胞。孵育结束后，用移液器反复吹打液体，进一步分散集落。将50微升胰蛋白酶细胞混合液转移至含有灭活MEF的新孔中，然后将细胞放回培养箱。当细胞融合度达到60%至70%时，将其传代至24孔板的一个新孔中，并继续在室温下培养。当这些细胞融合度达到60%至70%时，将细胞以1:2比例传代至两个孔中，其中一个孔含有强力霉素，另一个不含强力霉素，以验证在无强力霉素条件下细胞集落仍能生长。继续在经灭活的MEF上，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用不含多西环素的培养基维持iPS AF细胞集落的培养。每日更换培养基，直至细胞可用于染色、成像和RNA提取。在此，稳定且不依赖多西环素诱导的多能性小鼠羊膜GFP阳性细胞表达了确认重编程成功所必需的多能性标志物。以R1 ES细胞作为对照进行的RT-PCR分析显示，在有或无多西环素的情况下，均可检测到诱导性多能性标志物的表达。在所有三种细胞类型中均检测到看家基因β2-微球蛋白的表达。对注射诱导性多能细胞后从小鼠体内分离得到的畸胎瘤进行了免疫染色。在类胚体中检测到甲胎蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和β-III微管蛋白，可证实细胞已分化为全部三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层。此外，对体外培养的类胚体和体内畸胎瘤细胞进行RT-PCR分析，进一步证实了中胚层、内胚层和外胚层特异性标记基因的表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离并重编程小鼠羊水细胞。这是一种简单且安全的实验方法，也可应用于常规诊断或剖宫产手术所获取的样本中的人类羊水细胞。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从小鼠羊水细胞多能干细胞使用转座子系统的生产

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

通过强制表达转录因子 Oct-4、Sox-2、Klf-4 和 c-Myc，可将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞，但效率较低。重编程过程中的稀有中间态细胞可通过针对细胞表面标志物 Thy-1.2、Ssea-1 和 Epcam...

由可重编程小鼠模型中利用细胞表面标志物介导分离iPS细胞中间态细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本文介绍一种结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号的方法，可高效生成哺乳动物多能细胞，且无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，该策略在转化医学领域具有广阔前景，并代表了干细胞类器官技术的重要进展。...

一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

了解如何使用转座子系统从小鼠羊水细胞中生成诱导多能干细胞。该方法利用非病毒载体技术，为再生医学和患者特异性治疗提供安全高效的细胞重编程方案。

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

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