Name: 长期高分辨率活体显微镜在肺与真空稳定成像窗口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习使用真空稳定成像窗口对小鼠肺部进行长期高分辨率单细胞活体成像技术。该方法利用多光子显微镜可视化肿瘤微环境相互作用，为癌症转移研究提供关键工具。

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本研究由NIH-CA100324、爱因斯坦国立癌症研究所癌症中心支持基金P30CA013330、JWP获得的R01CA172451以及综合成像项目资助。该技术在阿尔伯特·爱因斯坦医学院的格鲁斯-利珀生物光子学中心和综合成像项目中开发完成。我们感谢这些中心对本工作的支持。作者感谢爱因斯坦机械车间的Mike Rottenkolber、Ricardo Ibagon和Anthony Leggiadro提供的精湛且及时的工艺支持，感谢Matthew Krummel实验室慷慨分享其窗口设计图纸，感谢Kevin Elicieri和Jeremy Bredfeldt在显微镜技术方面的专业知识及其对放大器的选型建议，同时感谢Allison Harney和Bojana Gligorijevic提供的有益讨论。

本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 构建荧光标记的小鼠模型和肿瘤细胞
<ol>
	<li>通过将 0.1 g 牛血清白蛋白（BSA）与 100 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）混合，制备 100 ml 的 0.1%（w/v）牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液（BSA/PBS）缓冲液。</li>
	<li>通过稳定转染制备荧光标记的肿瘤细胞。 
	注：此处我们使用 E0771-LG 细胞，这是一种高度转移性的 E0771 小鼠乳腺腺癌细胞的衍生株37，该细胞系是从经尾静脉注射亲代 E0771 细胞的 C57BL/6 小鼠肺部转移性肿瘤中分离得到的38。
	<ol>
		<li>转染前 24 小时，将 1 × 105 个 EO771-LG 细胞接种于含 2 ml 无抗生素的 10% 胎牛血清（FBS）DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）的 60 mm 组织培养皿中，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
		<li>转染时，将 2 µg 荧光蛋白载体与 10 µl 转染试剂在室温下孵育 30 分钟，随后加入 190 µl 低血清培养基。</li>
		<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤 EO771-LG 细胞一次，然后轻柔加入转染混合物。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。</li>
		<li>洗涤转染后的细胞，并在 2 ml 完全 DMEM 培养基（含 10% FBS、1 mM 丙酮酸钠、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素）中继续培养 2 天。</li>
		<li>用 2 ml 无菌 PBS 洗涤细胞，加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育 2 分钟。</li>
		<li>收集细胞悬液，加入至少等体积的完全 DMEM 混匀，然后以 280 × g 离心沉淀。</li>
		<li>将细胞重悬于 1 ml 完全 DMEM 中，并转移至 10 cm 组织培养皿中扩大培养。</li>
		<li>通过向 8 ml 完全 DMEM 中加入 700 µg/ml G418 选择性抗生素，开始对转染细胞进行筛选，持续培养一周，每三天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用荧光激活细胞分选（FACS）39,40 从经 G418 筛选后的转染细胞中富集荧光阳性细胞群体。
	<ol>
		<li>用 5 ml PBS 洗涤细胞，加入 1.5 ml 0.25% 胰蛋白酶。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 2 分钟，然后加入至少等体积的完全 DMEM 混匀。</li>
		<li>收集细胞悬液，以 280 × g 离心沉淀，再将细胞重悬于 1 ml 无菌 0.1%（w/v）BSA/PBS 缓冲液中。</li>
		<li>将细胞悬液通过 40 µm 滤网过滤，并用 0.1% BSA/PBS 缓冲液调整体积至 1 ml，用于分选。</li>
		<li>使用 FACS 分选仪根据荧光光谱对荧光最强的前 10% 细胞群体进行分选41。</li>
		<li>将分选后的细胞在选择性培养基（含 700 µg/ml G418 的完全 DMEM）中继续培养一周。</li>
		<li>通过流式细胞术重复步骤 1.3.1 至 1.3.6，再次筛选荧光标记细胞。</li>
		<li>完成第二轮筛选后，按前述方法（步骤 1.3.1–1.3.4）进行胰酶消化、过滤并重悬于 0.1% BSA/PBS 中，调整细胞浓度至 2 × 106 个细胞/ml，用于使用 FACS 分选仪进行单细胞分选至 96 孔板。</li>
		<li>准备 3–5 块 96 孔板，每孔加入 100 µl 完全 DMEM 用于收集细胞。为提高分选后细胞存活率，可向每孔添加 100 µl 来自 EO771-LG 细胞培养皿的过滤后培养上清液42。</li>
		<li>将细胞分选至 96 孔板后，置于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 2 天。</li>
		<li>在倒置显微镜下以 5 倍放大倍数观察，识别含有存活单克隆的孔。</li>
		<li>对存活的单克隆进行胰酶消化、扩增并冻存备用。
		<ol>
			<li>用 100 µl 无菌 PBS 洗涤含有生长中克隆的孔，加入 50 µl 0.25%（w/v）胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 2 分钟。加入 50 µl 完全 DMEM，转移至无菌 V 型底或圆底 96 孔板，以 280 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>将细胞重悬于 100 µl 含 700 µg/ml G418 的完全 DMEM 中，将每个克隆接种至 12 孔板中。加入 400 µl 含 G418 的完全 DMEM，培养至细胞融合。</li>
			<li>用 500 µl PBS 洗涤孔，加入 100 µl 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 2 分钟。加入 100 µl 完全 DMEM，以 280 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 100 µl 含 G418 的完全 DMEM 中，接种至 6 孔板中继续培养至融合。</li>
			<li>待细胞融合后，进行胰酶消化，离心沉淀，重悬于含 10% DMSO 的 FBS 中，用于冻存细胞株。</li>
			<li>将细胞悬液的十分之一继续留在培养中，接种于 100 mm 组织培养皿中，用于评估其转移潜能。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测所选克隆的转移潜能。
	<ol>
		<li>将细胞进行胰酶消化后重悬于生理盐水中，调整浓度至 2.5 × 106 个细胞/ml，通过尾静脉向 C57BL/6 小鼠静脉注射 200 µl。</li>
		<li>两周后，按照先前描述的方法23取肺组织，通过表面结节数量计数或体视学方法43量化肿瘤负荷，选择具有高转移潜能的克隆用于活体成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>饲养 MacBlue 报告基因小鼠（一种髓系特异性启动子驱动青色荧光蛋白（CFP）表达的模型（Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP16））44。 
	注：通常使用 8 至 12 周龄的小鼠，但已有实验表明 7 至 20 周龄的小鼠也可适用。</li>
</ol>
2. 多光子显微镜的设置与成像准备
注意：本实验方案可在任何多光子显微镜上进行，但用于获取本方案中所示数据的系统此前已有详细描述45。
<ol>
	<li>至少在预定成像时间前一小时，开启所有显微镜和激光组件，包括双光子激光器和探测器。</li>
	<li>手术开始前，将光学功率计探头置于显微镜前方的光路中，测量输入显微镜的光功率，并调节激光腔末端反射镜旋钮，直至光学功率计显示在 880 nm 处达到最大光强。</li>
</ol>
3. 真空系统设置
<ol>
	<li>将盖玻片粘接到成像窗内（补充材料） 图1用氰基丙烯酸酯固定。至少等待4小时，使胶水完全干燥。 
	注意：此步骤也可提前完成。</li>
	<li>切下 100 &#181;将移液管吸头置于小开口处的第一条线位置，并将未切割的一端连接至细的真空管。</li>
	<li>根据说明连接真空系统 图1 和 补充图2.</li>
	<li>开启真空并堵塞开放端后，调节真空调节器 &#60;3 inHg 
	注意：最终的真空度调节需通过观察血管结构来完成 体内.</li>
	<li>在成像板的底面涂抹一层薄薄的石油脂，以防止成像板吸走物镜浸没介质。</li>
	<li>将成像板放置在显微镜载物台上。 
	注意：定制成像板（补充图3）是一片 1/8&#34; 厚铝块经过精密加工，既可嵌入载物台插槽，其中心又设有通孔用于固定成像窗口。</li>
	<li>将真空窗插入成像板中，盖玻片朝下。</li>
	<li>用70%乙醇对所有表面和器械进行消毒，包括成像用载物台板和成像窗口。</li>
	<li>将移液器吸头的切割端连接至真空窗，并用胶带将软管固定在成像板上。</li>
	<li>将物镜靠近成像窗口，并在物镜与盖玻片之间放置一大滴水。</li>
	<li>通过封闭真空窗的中央开口，并确认物镜与盖玻片之间的水滴未被吸走，确保盖玻片无泄漏。 
	注意：在窗口上放置一个老式计算机鼠标球有助于遮挡中央开口。</li>
</ol>
4. 手术
<ol>
	<li>准备无菌手术区域。
	<ol>
		<li>将所有器械放置在触手可及的位置。使用70%乙醇对包括手术区域和手术器械在内的所有表面和器械进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一段3英寸长的2-0缝合线系在导管上， &#188; 英寸高于衬套处打双结。</li>
	<li>按照 Harney 发表的方案制备尾静脉导管 等 46.</li>
	<li>使用红外线（IR）加热灯，在笼内将动物加热约5分钟，以增加尾静脉的血流量，便于导管插入。&#160;建议在整个手术过程中使用加热灯或加热垫，使动物保持在生理温度。</li>
	<li>用 5% 异氟烷麻醉动物，并验证其对脚趾夹捏无反应。</li>
	<li>将眼用软膏涂抹于动物的眼睛。</li>
	<li>涂抹脱毛乳液10-30秒&#160;去除动物左侧从胸部中线开始的毛发； &#188; 从背部和腋下至肋缘下方</li>
	<li>用70%酒精清洁皮肤上多余的乳液并消毒暴露的皮肤。</li>
	<li>将一支装有 PBS 的无菌注射器连接至尾静脉导管，并根据 Harney 发表的方案插入导管并用胶带固定 等 46确保胶带牢固地粘附在针头本身上，且在针尾与胶带之间的间隙中没有松动部分。</li>
	<li>按照 Das 发表的方案对小鼠进行插管 等人 47 或由 DuPage 完成 等. 48</li>
	<li>打开呼吸机，将其设置为每分钟提供 135 次呼吸，潮气量为 200 &#181;异氟烷-氧气混合气体的升</li>
	<li>将气管导管连接至呼吸机。</li>
	<li>将小鼠转移至手术区域。操作时需格外小心，避免导管脱落。</li>
	<li>用2-0缝线在小鼠门齿下方绕过其吻部打结固定。</li>
	<li>将导管固定在鼻部。</li>
	<li>将左侧前肢用胶带固定在导管上，以使其远离手术区域。</li>
	<li>将异氟烷麻醉水平降低至2.5%的维持浓度，并确认对脚趾夹捏无反应。</li>
	<li>使用锋利的剪刀，剪除1 cm2 左胸壁上方的皮肤</li>
	<li>抬起乳腺脂肪垫，并使用电灼笔灼烧任何暴露的血管。</li>
	<li>用锋利的剪刀剪除脂肪垫。</li>
	<li>用锋利的剪刀剪开肌肉层，直至暴露肋骨。注意不要剪到前肢基部走行的腋静脉。</li>
	<li>用镊子夹起并提起 6th 肋骨。使用以浅角度（约5&#176;在皮肤切口边缘附近剪断肋骨。务必格外小心，避免触碰暴露的肺组织。</li>
	<li>通过切除四根连续的肋骨，扩大胸壁切口以充分暴露整个肺叶。 
	注意：保持切口距离胸骨至少5 mm，以避免损伤心脏。</li>
	<li>小心抓住小鼠的尾巴和气管导管，将小鼠提起并移至显微镜成像平台。</li>
	<li>关闭真空泵后，用 PBS 填充真空窗的腔室。</li>
	<li>将小鼠翻转，并将暴露的肺置于真空成像窗口上方。</li>
	<li>缓慢打开球阀，将真空度调节至约3-5英寸汞柱。</li>
	<li>将一张卫生纸对折两次后制成的固定带放置在小鼠胸部，并用胶带将其固定在成像平台板上，如图所示 补充图2.</li>
	<li>将脉搏血氧仪的大腿传感器夹在动物的大腿上并启动软件。</li>
	<li>将环境舱置于载物台上，并开启加热以维持小鼠的生理温度。</li>
	<li>将异氟烷浓度降低至1-1.5%，以维持麻醉并保持血流。</li>
</ol>
5. 活体成像
<ol>
	<li>将 25 × 0.95 数值孔径（NA）物镜移至接近盖玻片的位置，并在两者之间加入一大滴水。</li>
	<li>使用落射荧光模式，观察 FITC 通道，并将肺组织调至焦平面。</li>
	<li>如果手术前尚未进行，通过尾静脉导管注射肿瘤细胞。
	<ol>
		<li>将 PBS 注射器从尾静脉导管上断开。</li>
		<li>用无菌注射器吸取 100 µl 肿瘤细胞悬液（最大浓度为 2 × 107 个细胞/ml，溶于 PBS 中）。 
		注意：此步骤可预先完成，以研究肿瘤细胞在不同时间点到达肺部的情况。</li>
		<li>将含有肿瘤细胞的注射器连接到尾静脉导管上。</li>
		<li>缓慢将肿瘤细胞注入尾静脉。</li>
		<li>将含有肿瘤细胞的注射器从尾静脉导管上断开。</li>
		<li>重新将 PBS 注射器连接至尾静脉导管。 
		注意：在注射葡聚糖之前，需先确定所有肿瘤细胞的位置，因为注射后通过目镜难以区分肿瘤细胞与葡聚糖信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位待成像的肿瘤细胞
	<ol>
		<li>对于单个肿瘤细胞的成像，需定位所有肿瘤细胞，并使用软件的多点面板记录其位置。
		<ol>
			<li>通过显微镜目镜观察肿瘤细胞，确定所有待成像的视野位置。</li>
			<li>在软件中，点击“多点”按钮切换至多点面板，并点击“添加位置”按钮以存储细胞位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于拼接成像，需定位拼接图像的起点并设置成像坐标
		<ol>
			<li>在待捕获结构的左上角选择一个位置。</li>
			<li>按下载物台控制器上的“归零”按钮，将 x、y 和 z 坐标归零。</li>
			<li>点击“加载”按钮并选择相应的坐标列表，以载入适当的拼接坐标列表。 
			注意：例如，对于一个视野为 500 µm、重叠率为 20% 的 2 × 2 拼接图像，其坐标示例为：位置1 = (0,0)，位置2 = (400,0)，位置3 = (0,400)，位置4 = (400,400)。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将尾静脉导管上的 PBS 注射器取下，更换为含有葡聚糖的注射器。</li>
	<li>通过尾静脉导管缓慢向小鼠体内注射最多 100 µl 的 20 mg/ml 155 kDa 罗丹明标记葡聚糖（溶于 PBS），随后注射 50 µl 无菌 PBS 以冲洗管路。切勿引入任何气泡。必要时，应在肿瘤细胞注射至少一小时后注射葡聚糖，以确保小鼠每小时接受的总液体量不超过 4 ml/kg。</li>
	<li>设置成像参数。
	<ol>
		<li>将显微镜切换至双光子模式。</li>
		<li>点击“时序信号”按钮，并将“缩放因子”字段设置为 2 倍，以设定缩放倍数。</li>
		<li>点击“探测器与激光”按钮，然后将 Tsunami 功率滑块调整至 10，使激光功率约为 10%（样品处约为 10–15 mW）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个位置进行成像，以确认肿瘤细胞的存在，并观察血管的血流情况和完整性。 
	注意：血管应完全灌注，红细胞流动正常，荧光葡聚糖应局限于血管内，无渗漏至血管外区域。预计在真空窗的清晰视野范围内可观察到约 10–20 个肿瘤细胞。</li>
	<li>调整每个待成像位置的起始深度。
	<ol>
		<li>对每个位置，通过旋转载物台控制器上的调焦旋钮，调整 z 位置，以成像肿瘤细胞的最表层切片。</li>
		<li>将细胞置于视野中心。</li>
		<li>点击“多点”按钮，点击视野位置以高亮显示，然后依次点击“添加”和“删除”按钮，以更新多点列表中该细胞的存储位置。</li>
		<li>目视观察每个位置中肿瘤细胞的相对亮度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击多点面板中的“保存”按钮，保存每个细胞的新位置，并指定文件名。</li>
	<li>对于单个肿瘤细胞的成像，选择三个亮度大致相同的细胞，并通过点击列表中的位置，然后点击“删除”按钮，从多点列表中删除其余所有位置。</li>
	<li>点击“探测器与激光”按钮，调整绿色和红色通道45的 PMT 增益滑块，使信号低于饱和水平。</li>
	<li>调整蓝色通道45的滑块，使巨噬细胞呈现青色。 
	注意：任何二次谐波信号将仅出现在蓝色通道中，可通过此前描述的通道减法程序45将其与青色巨噬细胞信号区分开。</li>
	<li>将 z 轴堆栈的起始深度设为 0 µm，终止深度设为 24 µm，方法是将 z 载物台移至相应位置，然后分别点击“起始”和“终止”按钮。 
	注意：在此深度范围内的细胞将获得最佳的信噪比和分辨率。</li>
	<li>将 z 轴步进大小设为 3 µm。</li>
	<li>根据此前描述的参数45,49设置成像参数。
	<ol>
		<li>对于单个肿瘤细胞的成像，点击“时序信号”按钮，将缩放因子字段设为 4 V（相当于 1.5 倍缩放），在帧平均字段中输入 3，点击“时间序列”按钮，并在时间序列字段中输入 10。 
		注意：这些设置将每 3 秒采集一帧图像。</li>
		<li>对于拼接成像，点击“时序信号”按钮，将缩放因子设为 1.5 V（相当于 4 倍缩放），帧平均数设为 3，点击“时间序列”按钮，并在时间序列延迟字段中输入 10。 
		注意：这些设置将每 3 秒采集一帧图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击多点、z 轴堆栈和时间序列成像模式的按钮，启用这些成像模式。</li>
	<li>按下“记录”按钮以开始采集图像。 
	注意：肺组织非常脆弱，易受光损伤。若在时间序列成像后观察到成像区域血流停止，则激光功率可能过高，后续对其他区域的成像必须在较低功率下进行。</li>
	<li>每 30–45 分钟，缓慢注射 50 µl PBS 或生理盐水，以维持动物的水合状态。</li>
</ol>
6. 安乐死
<ol>
	<li>将异氟烷浓度提高至 5%。</li>
	<li>维持动物处于 5% 异氟烷环境中，直至其停止呼吸后 30 秒，然后将动物从显微镜载物台上移除。</li>
	<li>实施颈椎脱位以确保完全安乐死。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>对于单细胞成像实验：
	<ol>
		<li>将图像载入 Fiji 并将其格式化为 Hyperstack。</li>
		<li>针对 Hyperstack 中的每个 z 切片，播放延时电影并观察是否存在残余的 x-y 方向移动。若发现残余的 x-y 移动，则对图像堆栈应用名为 StackReg 36 的插件以消除该移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于拼接成像实验：</li>
	<li>将图像载入 Fiji，并通过打开“拼接图像”宏（补充代码文件 Mosaic Stitching），输入有关图像的信息（如目录、文件基名、拼接图像中 x 和 y 方向的视野数量、切片数和时间点数）来拼接图像。 
	注意：由于 Java 对目录的解析方式，文件夹名称中必须使用两个反斜杠作为子文件夹分隔符。由于内置插件 Pairwise Stitching 的限制，文件基名中不得包含任何连字符。</li>
	<li>为清晰显示血管结构的边界，将血流通道的所有时间点平均合并为单幅图像，然后将该图像复制作为其他通道电影每一帧的背景。 
	注意：此步骤可通过直接运行“执行血液信号平均”宏（补充代码文件 Perform Blood Averaging）完成。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高分辨率 体内 将光学成像与荧光标记的功能性标签（如蛋白质和抗体）相结合，极大地加深了我们对转移级联过程的理解。该技术实现了对肿瘤细胞、宿主细胞及其微环境中的单细胞和亚细胞参数进行直接可视化与定量分析。在原发性肿瘤内的成像研究已促成例如支持肿瘤生长、侵袭或播散的特定微环境的发现 6,7在发生侵袭的情况下， 体内 成像研究揭示了巨噬细胞与肿瘤细胞共迁移流在内渗过程中的优先作用 7,50.
在肺等继发部位，要了解肿瘤细胞在转移最早阶段（包括单个或少量肿瘤细胞到达并与血管内皮相互作用的微转移前定植阶段）的行为动态，必须借助高分辨率光学成像技术才能实现。常规临床成像方法无法提供足够的分辨率，以观察毛细血管网的精细结构或在单细胞水平上解析细胞的形态及其相互作用。本实验方案中介绍的成像技术能够完成这一具有挑战性的任务。
活体成像窗口，例如下所列 表1 相较于……具有显著优势 离体 通过维持适当的肺部生理状态，...

高分辨率活体光学成像已被证明对于理解许多生物学过程至关重要，可实现对单细胞及亚细胞参数的测量与定量。在癌症研究中，对肿瘤细胞和间质细胞的活体成像揭示了多种仅存在于完整动物体内的微环境相互作用6-11。
利用单细胞分辨率光学成像技术揭示乳腺癌肿瘤细胞内渗及播散相关微环境的研究 体内 甚至为乳腺癌患者的预后及治疗反应带来了新的标志物 12-16目前可用于观察完整内部重要器官深部结构的最佳成像技术是临床成像手段（MRI、PET、CT），这些技术能够清晰显示整个器官的结构，并可在病理出现临床症状之前揭示病变。然而，由于缺乏单细胞分辨率，这些技术无法揭示转移的最早阶段以及驱动肿瘤进展的细胞机制。当肺转移灶在这些成像手段中可见时，通常已形成稳定且正在增殖的病灶。据估计，到达肺部的播散性肿瘤细胞中约有90%无法存活 17 或最初保持休眠状态 18，以及观察到它们到达的时间比先前预期的要早得多 19对肿瘤细胞到达远处部位并存活的最初阶段进行成像，对于理解转移性定植及肿瘤复发过程至关重要。
然而，在肺部进行此类观察已被证明极为困难；绝大多数成像研究采用的是离体（ex vivo）或肺组织外植体准备方法20-23，这些方法仅能提供肺部在单一时间点的图像信息。尽管这些样本制备方法确实能提供有用的信息，但无法全面揭示微环境各组分之间相互作用、因果关系及动态变化过程。由于缺乏完整的循环系统（以及随之而来的稳态失衡），且与机体其余免疫系统失去连接，因此有必要在完整活体组织（in vivo）中验证这些离体实验所得出的结论。
许多研究团队已对完整肺组织进行过活体成像2,4,5,24-33，其中Wearn和German首次通过手术暴露胸膜层24，Terry则首次使用了可植入式成像窗口25。
肺部的高分辨率成像因肺组织持续运动而受到极大限制，为此已开发出多种技术以克服这一难题。Wagner 和 Filley27研究了犬肺的自然运动，并据此设计手术方案，将植入的观察窗定位在相对静止的区域；而 Wagner 在其手术准备中还利用真空固定技术以 immobilize 组织28。自那时以来，已有多种技术被用于肺部成像，包括：支气管夹闭、序贯性呼吸暂停与门控成像、过采样采集、肺叶粘连固定以及真空固定技术34。这些方法各有优缺点，目前尚无任何一种技术被证明明显优于其他方法34。例如，支气管夹闭和序贯性呼吸暂停会改变肺内正常的气体交换，可能导致肺不张。门控成像和过采样采集虽无上述缺点，但需要高速或专用成像设备，而这类设备尚未广泛普及。最后，肺叶粘连固定和真空固定技术均可避免前述问题，但如果操作不当，可能因剪切力导致组织损伤。近年来，真空观察窗已实现微型化，并已适配用于小鼠的共聚焦显微镜和多光子显微镜成像4,5,33，实现了优异的高分辨率成像效果2。表1总结了这一领域的丰富发展历程，并突出了那些描述活体肺成像窗应用中创新进展的研究论文。
本方案描述了利用延长时程的活体多光子延时显微技术，以尽可能高的亚细胞分辨率对活体完整肺组织中的转移过程进行成像。使用配备高数值孔径物镜和多个光电倍增管（PMT）检测器的多光子显微镜，可连续采集长达12小时的图像。通过转基因小鼠模型，对内源性巨噬细胞进行荧光标记，同时使用荧光高分子量葡聚糖以及转染荧光蛋白的肿瘤细胞（分别用于标记血管系统和肿瘤细胞）。尽管这种荧光标记细胞的选择有助于观察肿瘤细胞-内皮细胞-巨噬细胞之间的相互作用及其动态过程，但本方案适用于任何品系的荧光或非荧光小鼠。图像采集后，可利用Fiji插件35,36消除残余漂移运动（如有），并通过自定义宏对血管通道进行时间平均处理，以消除未标记循环血细胞引起的闪烁现象。
尽管本方案主要关注转移灶的成像，但这些技术同样适用于肺部高分辨率单细胞成像可观察到的许多其他生物学过程。

<table><tbody><tr><td>镀镍黄铜真空调节器 1/8 NPT 内螺纹，带压力表，0 - 20&quot; Hg 真空</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&amp;nbsp;</td><td>真空调节器</td></tr><tr><td>用于 1/4 英寸的黄铜带刺软管接头适配器&quot; 软管内径 X 1/8&quot; NPTF 雄性管螺纹</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>真空调节器软管接头</td></tr><tr><td>Pyrex 品牌带支管抽滤瓶，瓶颈适配 4 号橡胶塞，容量：50 ml</td><td>康宁生命科学玻璃</td><td>5360-50</td><td>真空瓶</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片，厚度 #1.5，0.16 - 0.19 mm，直径 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>Exel International 一次性安全型静脉导管；22 号 × 1 英寸&amp;nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>气管导管</td></tr><tr><td>PERMA-HAND 黑色编织丝线缝合线，ETHICON LIGAPAK 分装卷轴，规格 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>字符串</td></tr><tr><td>液体超级胶水，透明，0.14 盎司</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>氰基丙烯酸酯胶水</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明异硫氰酸酯&amp;ndash;葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD 葡聚糖</td></tr><tr><td>实验室透明Tygon PVC管，1/16英寸&quot; ID，1/8&quot; OD，1/32&quot; 管壁厚度，25英尺长度</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>细管 &amp;和鲁尔接头管路</td></tr><tr><td>抗裂聚乙烯管，1/8英寸&quot; 编号，1/4&quot; OD，1/16&quot; 管壁厚度：白色，50英尺长度&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&amp;nbsp;</td><td>厚壁管</td></tr><tr><td>脱毛乳液</td><td>Nair</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微小医用管路 95 邵氏硬度 LDPE</td><td>Scientific Commodities 公司</td><td>BB31695-PE/1</td><td>尾静脉导管用导管</td></tr><tr><td>30 G × 1 英寸 BD PrecisionGlide 针头</td><td>BD</td><td>305128</td><td>尾静脉插管用针头</td></tr><tr><td>Puritan 非无菌棉签&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>透明聚碳酸酯带倒刺管接头，变径直通型，适用于3/32英寸管径&quot; x 1/16&quot; 管编号</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>管路连接件</td></tr><tr><td>单孔橡胶塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>真空瓶塞</td></tr><tr><td>SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-100，100 个装 &amp;micro;l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>移液器吸头</td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>008897</td><td>眼用软膏</td></tr><tr><td>Gemini电凝套装</td><td>哈佛仪器</td><td>726067</td><td>电烙笔</td></tr><tr><td>Graefe 显微解剖镊；带齿；微弯；0.8 mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td><td>Roboz 外科手术器械</td><td>RS-5135&amp;nbsp;</td><td>镊子</td></tr><tr><td>超细显微解剖剪 4&quot; 直型锐缘/锐缘 24 毫米</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>锋利的剪刀</td></tr><tr><td>微型解剖剪 4&quot; 直型钝端/钝端</td><td>Roboz 外科手术器械</td><td>RS-5980</td><td>钝头剪刀</td></tr><tr><td>湿巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&amp;nbsp;</td><td>固定装置</td></tr><tr><td>PhysioSuite 系统</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>生命体征监护仪</td></tr><tr><td>1 ml 注射器，结核菌素滑动针头</td><td>BD</td><td>309659</td><td>注射器</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯</td><td>订书钉</td><td>LOC1647358</td><td>盖玻片粘合剂</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>防水屏障</td></tr><tr><td>适配器鲁尔接头套管 1.5 - 2.2 毫米</td><td>哈佛仪器公司</td><td>734118</td><td>导管连接器</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT 脉搏血氧仪</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>脉搏血氧仪</td></tr><tr><td>异氟醚（异氟烷）</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>氧气</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PVC球阀，推入式连接，1/4英寸</td><td>格雷格纳</td><td>3CGJ7</td><td>真空阀</td></tr><tr><td>小型动物呼吸机</td><td>哈佛仪器</td><td>683</td><td>可选产品来自 Kent Scientific：MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM 低血清培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985062&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue 转基因小鼠 Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>026051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>定制显微镜的替代方案</td></tr><tr><td>环境封闭装置</td><td>精密塑料</td><td>FV1000用腔室</td><td>定制 enclosure 的替代方案</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>激光功率计</td><td>相干的</td><td>FieldMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>激光功率计探头</td><td>相干的</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover 荧光蛋白载体</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418硫酸盐选择性抗生素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo 荧光激活细胞分选仪&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA 1x</td><td>康宁</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 网格</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>康宁</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>康宁</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 1×</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

转移到肺、肝和骨等继发部位是一种创伤性事件，死亡率约为90% 1在这些部位中，肺部由于位于体内深处、组织脆弱且在维持正常生理功能中起关键作用，因此利用活体光学成像进行评估最为困难。尽管临床成像手段（如正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT））能够无创地获取该组织的图像，但其分辨率不足以观察到最早期的定植事件，单个像素所代表的区域几乎包含近一千个细胞。目前关于肺转移定植的模型认为，肿瘤细胞到达肺部后的早期事件对其存活及后续增殖具有决定性作用。这意味着需要具备单细胞分辨率的实时活体成像技术 2 需要对播种细胞的表型进行定义并验证这些模型。尽管已采用多种方法对肺部进行高分辨率光学成像 离体 制备过程中，这些实验通常是单时间点检测，由于环境发生显著改变（温度、灌注、细胞因子），容易产生假象，可能导致错误结论 等等。) 由于从胸腔和循环系统中移除所导致的结果 3最近的研究表明，使用真空稳定成像窗口可实现对完整肺组织进行延时活体光学成像。 2,4,5 然而，典型的成像时间通常被限制在约6小时。本文介绍了一种利用此类窗口进行长达12小时的肺部活体长时程时间序列成像的实验方案。通过该方法获得的时间序列图像序列可实现对肺组织中细胞间相互作用、细胞膜动态变化以及血管灌注情况的可视化与定量分析。此外，我们还描述了一种图像处理技术，可前所未有地清晰呈现肺部微血管结构。

为了展示该方法可实现的实验结果类型，我们在不同时间点将表达荧光蛋白Clover的E0771-LG肿瘤细胞经尾静脉注射至MacBlue小鼠44体内。手术后，通过静脉注射155 kD罗丹明标记的葡聚糖以标记血管系统，并进行延时成像。
注射后24小时对小鼠进行成像时，可在血管内观察到单个细胞，其与巨噬细胞和单核细胞发生相互作用。图2A（补充视频1）展示了这一现象的实例。该图显示了一个孤立的肿瘤细胞（绿色）嵌顿于肺部血管内约12 µm深度处，连续成像5小时20分钟，期间该细胞与一个常驻巨噬细胞（青色）发生短暂相互作用。血管结构通过高分子量葡聚糖标记。成像稳定性良好，可连续获取该区域的z轴层扫图像，并进行三维重建（图2B，补充视频2）。
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本方案描述了使用真空稳定成像窗口，通过多光子显微镜对完整肺组织进行长期、高分辨率、单细胞水平的实时成像技术。

转移到肺、肝和骨等继发部位是一种创伤性事件，其死亡率约为90%1。在这些转移部位中，肺……

本方法的总体目标是利用真空稳定成像窗口对完整肺组织进行长期、高分辨率的单细胞成像。该方法有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如在转移的最初阶段，间质细胞与肿瘤细胞之间发生了哪些相互作用。该技术的主要优势在于，理论上可对活体完整肺组织进行长达12小时的单细胞分辨率成像。首先，用一段3英寸长的2-0缝线，在气管导管接头上方四分之一英寸处打双结，将缝线系在导管上。然后，将眼膏涂抹于麻醉小鼠的眼睛上，并使用脱毛膏去除动物左侧从胸部中线至背部四分之一区域、以及从腋窝至肋缘下方的毛发。清除残留的脱毛膏，并用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。接下来，对动物进行插管，并在鼻吻部前端牙齿下方用2-0缝线固定。将动物转移至手术区域，注意避免移位导管，然后开启呼吸机。将呼吸机连接至气管导管，然后用胶带将导管固定于鼻部及左前肢。确认足趾夹捏无反应后，使用锐利剪刀去除左侧胸壁上方一平方厘米的皮肤。抬起乳腺脂肪垫，并电凝任何暴露的血管。接着，切除脂肪垫并去除肌肉层，直至肋骨区域，注意不要损伤前肢基部的腋静脉。用镊子抬起第六根肋骨。然后，将锋利的剪刀保持约五度的浅角，从皮肤切口边缘处剪断肋骨。移除四根连续的肋骨，以扩大胸壁切口，充分暴露整个肺叶。随后，小心地将小鼠转移至显微成像载物台。关闭真空泵，用 PBS 填充真空窗的内腔。将小鼠倒置，使暴露的肺组织位于真空成像盖玻片窗口上方。缓慢开启真空泵。将由滤纸对折两次后制成的固定带置于小鼠胸部，并用胶带将固定带粘贴在载物台上。然后将脉搏血氧仪连接到动物的足爪上。接着将环境舱放置在载物台上，并开启加热装置，以维持小鼠的生理体温。当动物体位固定后，将25倍、数值孔径为95的物镜移至盖玻片附近。在落射荧光模式下观察fitzy通道，并将肺组织调至清晰对焦。随后，用100 µL无菌注射器吸取肿瘤细胞悬液，从尾静脉导管中移除PBS注射器，并连接装有肿瘤细胞的注射器。缓慢将肿瘤细胞注入尾静脉。然后将PBS注射器重新连接至尾静脉导管，通过显微镜目镜观察肿瘤细胞在肺组织中的分布情况。接着，取下PBS注射器，换上装有100微升罗丹明葡聚糖的注射器，通过尾部导管缓慢将葡聚糖注入小鼠体内。在给予葡聚糖后，用50微升无菌PBS冲洗。随后对先前定位的每个肿瘤细胞位置进行成像，以观察血管的血流情况和完整性。注射后24小时，可观察到单个肿瘤细胞与血管内的巨噬细胞和单核细胞相互作用。成像的稳定性使得可以连续获取视野的Z轴层扫图像，并生成三维重建图像。此处展示的是单个转移性病灶在注射后第12天，于肺表面下15微米深度处，历时200分钟、每5分钟采集一次的5×5拼接成像视野，覆盖890微米的视场范围。尽管视场较大，但构成拼接图像的基础图像具有高分辨率，能够捕捉到细胞亚水平的事件，例如由染色体分离所证实的单个细胞有丝分裂过程。注射高分子量的荧光标记葡聚糖可标记血管腔；然而，未标记的循环红细胞和白细胞可能会阻塞葡聚糖。在肺部的小毛细血管中，这种阻塞会导致葡聚糖信号闪烁，并使血管边界模糊不清。本方案提供的高空间稳定性允许对血流通道进行时间平均处理，且不会产生模糊，从而恢复暂时性的阻塞区域。随后可将其他信号通道叠加到血管结构上，以清晰显示血管边界。若操作得当，掌握该技术后可在大约一小时内完成实验。在进行该操作时，需特别注意避免切割较大的血管，若需切断应先进行电灼处理，同时应完全避免接触肺组织。通过此操作，可以观察到肿瘤细胞扩散和增殖的最早阶段。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在完整肺组织中利用真空稳定成像窗口进行活体成像。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

长期高分辨率活体显微镜在肺与真空稳定成像窗口

我们展示了如何使用双光子显微镜观察感染肺组织中中性粒细胞的动态行为，包括其中性粒细胞吞噬病原体或形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程。...

利用双光子显微镜直接观察感染肺组织中中性粒细胞的吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成

关键词：中性粒细胞，吞噬作用，中性粒细胞胞外诱捕网（NET），双光子显微镜，肺部感染，活体成像

在本视频中，我们介绍了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以实现对细胞动态的长期可视化观察。...

活体成像：通过稳定成像窗口在细胞水平观察小鼠胰腺的方法

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。...

通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。...

用于研究癌细胞肺转移的永久性窗口

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的关键组成部分。多光子显微镜是一种能够以高时空分辨率追踪细胞动态的高效工具。 体内...

多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。...

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

活体荧光显微镜可用于实时研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及毛细血管灌注。本方案描述了利用真空稳定肺成像系统对肺微循环中的这些参数进行成像和定量的方法。...

采用真空稳定成像系统对实验性急性肺损伤中肺微循环进行活体宽场荧光显微观察

本文介绍了一种利用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体成像的实验方案。该方法为实时研究小鼠肺移植后细胞动态变化及细胞间相互作用提供了有力工具。...

活体小鼠肺移植的双光子显微成像

本文介绍了一种利用永久性肺窗对小鼠肺部经减毒且获得生物安全二级（BSL-2）许可的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

衰减营养缺陷型的活体成像 结核分枝杆菌 小鼠肺脏在早期血管内感染期间的变化

学习使用真空稳定成像窗口对小鼠肺部进行长期高分辨率单细胞活体成像技术。该方法利用多光子显微镜可视化肿瘤微环境相互作用，为癌症转移研究提供关键工具。

利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

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