利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

本方法的总体目标是利用真空稳定成像窗口对完整肺组织进行长期、高分辨率的单细胞成像。该方法有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如在转移的最初阶段，间质细胞与肿瘤细胞之间发生了哪些相互作用。该技术的主要优势在于，理论上可对活体完整肺组织进行长达12小时的单细胞分辨率成像。

首先，用一段3英寸长的2-0缝线，在气管导管接头上方四分之一英寸处打双结，将缝线系在导管上。然后，将眼膏涂抹于麻醉小鼠的眼睛上，并使用脱毛膏去除动物左侧从胸部中线至背部四分之一区域、以及从腋窝至肋缘下方的毛发。清除残留的脱毛膏，并用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。

接下来，对动物进行插管，并在鼻吻部前端牙齿下方用2-0缝线固定。将动物转移至手术区域，注意避免移位导管，然后开启呼吸机。

将呼吸机连接至气管导管，然后用胶带将导管固定于鼻部及左前肢。确认足趾夹捏无反应后，使用锐利剪刀去除左侧胸壁上方一平方厘米的皮肤。

抬起乳腺脂肪垫，并电凝任何暴露的血管。接着，切除脂肪垫并去除肌肉层，直至肋骨区域，注意不要损伤前肢基部的腋静脉。用镊子抬起第六根肋骨。

然后，将锋利的剪刀保持约五度的浅角，从皮肤切口边缘处剪断肋骨。移除四根连续的肋骨，以扩大胸壁切口，充分暴露整个肺叶。随后，小心地将小鼠转移至显微成像载物台。

关闭真空泵，用 PBS 填充真空窗的内腔。将小鼠倒置，使暴露的肺组织位于真空成像盖玻片窗口上方。缓慢开启真空泵。

将由滤纸对折两次后制成的固定带置于小鼠胸部，并用胶带将固定带粘贴在载物台上。然后将脉搏血氧仪连接到动物的足爪上。接着将环境舱放置在载物台上，并开启加热装置，以维持小鼠的生理体温。

当动物体位固定后，将25倍、数值孔径为95的物镜移至盖玻片附近。在落射荧光模式下观察fitzy通道，并将肺组织调至清晰对焦。随后，用100 µL无菌注射器吸取肿瘤细胞悬液，从尾静脉导管中移除PBS注射器，并连接装有肿瘤细胞的注射器。

缓慢将肿瘤细胞注入尾静脉。然后将PBS注射器重新连接至尾静脉导管，通过显微镜目镜观察肿瘤细胞在肺组织中的分布情况。接着，取下PBS注射器，换上装有100微升罗丹明葡聚糖的注射器，通过尾部导管缓慢将葡聚糖注入小鼠体内。

在给予葡聚糖后，用50微升无菌PBS冲洗。随后对先前定位的每个肿瘤细胞位置进行成像，以观察血管的血流情况和完整性。注射后24小时，可观察到单个肿瘤细胞与血管内的巨噬细胞和单核细胞相互作用。

成像的稳定性使得可以连续获取视野的Z轴层扫图像，并生成三维重建图像。此处展示的是单个转移性病灶在注射后第12天，于肺表面下15微米深度处，历时200分钟、每5分钟采集一次的5×5拼接成像视野，覆盖890微米的视场范围。尽管视场较大，但构成拼接图像的基础图像具有高分辨率，能够捕捉到细胞亚水平的事件，例如由染色体分离所证实的单个细胞有丝分裂过程。

注射高分子量的荧光标记葡聚糖可标记血管腔；然而，未标记的循环红细胞和白细胞可能会阻塞葡聚糖。在肺部的小毛细血管中，这种阻塞会导致葡聚糖信号闪烁，并使血管边界模糊不清。本方案提供的高空间稳定性允许对血流通道进行时间平均处理，且不会产生模糊，从而恢复暂时性的阻塞区域。

随后可将其他信号通道叠加到血管结构上，以清晰显示血管边界。若操作得当，掌握该技术后可在大约一小时内完成实验。在进行该操作时，需特别注意避免切割较大的血管，若需切断应先进行电灼处理，同时应完全避免接触肺组织。

通过此操作，可以观察到肿瘤细胞扩散和增殖的最早阶段。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在完整肺组织中利用真空稳定成像窗口进行活体成像。感谢观看，祝您的实验顺利成功。