快速获取三维图像的高分辨率表面荧光显微技术

本方案的总体目标是利用常规实验室设备，快速获取生物样本的高分辨率三维数字图像。该方法通过可视化复杂形态特征及其动态变化，可解答发育生物学领域中的关键问题。该技术的主要优势在于使用常规实验设备，且无需过多的前期经验。

本实验操作将由我实验室的研究生 Jungang Huang 演示。按照文本方案所述完成胚胎的解剖和固定后，用透明溶液替换固定液，并在室温下于摇床上轻轻振荡孵育一至两周。孵育结束后，将样本转移至10%福尔马林溶液中，继续在摇床上振荡放置两天。

第三天，用 PBS 清洗样品，每次五分钟，共清洗三次。然后在室温下，将样品置于摇床上，依次用浓度递增的乙醇进行脱水，每种浓度脱水两小时。在100%乙醇脱水后，将样品转移至染色液中染色一小时，并避光处理。

然后，更换为新鲜的染色液，对样本进行过夜标记。次日早晨，将样本浸入等体积的新鲜配制的渗透液与染色液混合溶液中，在4°C条件下于摇床上孵育至少三小时。孵育结束后，将胚胎转移至渗透液中，继续在摇床上于4°C条件下孵育三小时。

然后将上清液更换为新鲜的浸润液，在4°C下继续摇动三天。第四天，将胚胎置于包埋模具中并把模具放在冰上。将B溶液与浸润液混合，然后将模具轻轻浸入4°C的冷包埋液中。

大约三小时后，用枪头确认溶液是否已凝固，并将样本从模具中推出。修去多余的包埋材料，然后将样本块在新模具中重新定向为交叉方向。接着，将整个装置放置于冰上，并置于通风橱中。

轻轻将包埋液加入新模具中，直至模具完全浸没。然后将包埋盒置于模具顶部。三至四小时后，剥去包埋模具，将组织块置于带有斜射照明的体视显微镜下，以确定标本在组织块内的位置。

在包埋块表面，于样本周围标记网格线，并利用这些线条作为修除多余包埋材料的参考。为成像样本，首先将包埋块夹紧于切片机上，切出样本的新鲜表面。然后将体视变焦显微镜水平安装，使其正对样本的包埋块表面，并打开显微镜及其配套计算机。

接下来，启动图像采集软件，并使用成像软件中的实时预览模式将光学系统对焦至组织块表面。根据需要调整显微镜与切片机，使组织块表面位于取景器中心。该操作流程中最关键的步骤之一是在切片机的固定原点位置采集图像。

调整放大倍数，确保整个切块表面位于取景器视野范围内。然后选择绿色荧光蛋白滤光片。继续预切切块，直至样本组织出现，并根据需要重新对焦图像。

手动测量并设置曝光时间后，每次新鲜切片后均需采集并保存切面图像，并记录重要的图像采集参数。成像结束后，将所有图像文件导出并转换为 JPEG 格式，使用适当的图像处理软件对所有原始图像进行反相处理，并根据需要调整图像的亮度和对比度。按照说明，将所有处理后的图像上传至三维可视化软件。

使用自动模式对所有图像进行配准，并显示三维和二维结果。此为代表性图像，为经上述方法制备并成像的胚胎第15.5天小鼠胚胎的整体封片表面观。可观察到皮肤的详细形态学特征，包括须垫及正在发育的毛囊。

重要的是，通过该方法成像的胚胎第15.5天样本的虚拟切片视图分辨率与标准组织学切片相似。一旦掌握整个操作流程，经过透明化溶液预处理后，可在一周内完成后续步骤（前提是操作正确）。在进行该实验时，需注意在渗透和包埋步骤中，应将染色液置于4°C避光保存。

完成此操作后，还可采用其他方法（如标度染色）来进一步探究不同类型细胞的特异性分布模式。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用实验室设备获取生物样本的高分辨率三维图像，以进行形态计量分析。请注意，处理固定剂、染色液和浸润溶液时具有极高的危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如在通风橱内操作并始终佩戴手套。