Name: 使用3D图像的快速采集高分辨率显微镜落射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习使用标准实验室设备对小鼠胚胎进行高分辨率三维落射显微镜成像的技术。该方法可在发育生物学研究中实现详细的形态计量分析，一周内即可完成整个实验流程。

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感谢黄一尘（Yichen Huang）、郭春明（Chunming Guo）和周振芳（Zhenfang Zhou）博士提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK，项目号：1R01DK091645-01A1，XL）和美国心脏协会（AHA，项目号：13GRNT16950006，XL）资助。

所有动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会批准。
1. 样品制备
<ol>
	<li>定时交配
	<ol>
		<li>将一只 C57Bl6 野生型雄鼠与一只雌鼠共同放入同一笼中。</li>
		<li>次日清晨检查是否形成交配栓。交配栓（又称阴道栓或交配栓）是一种硬化凝胶状沉积物，可阻塞阴道。</li>
		<li>将发现交配栓的当天定为胚胎发育第 0.5 天（e0.5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠胚胎的分离
	<ol>
		<li>采用 CO2 窒息法处死怀孕雌鼠。</li>
		<li>将小鼠仰卧置于吸水垫上，并用 70% 乙醇喷洒腹部区域。</li>
		<li>提起皮肤，使用手术剪在腹部尾侧区域做一约 5 mm 的初始切口。剪开并移除腹部皮肤，充分暴露内脏器官。</li>
		<li>在靠近阴道处剪断，取出整个子宫。</li>
		<li>沿子宫角在着床部位之间进行切割。每个片段或胚体应仅包含一个胚胎。</li>
		<li>将子宫片段置于 1× 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎解剖
	<ol>
		<li>在体视显微镜下，将每个胚体分别置于盛有冰冷 PBS 的培养皿中。</li>
		<li>使用精细解剖镊依次去除子宫组织、胎盘及胎儿膜。</li>
		<li>使用大口径移液器将解剖后的胚胎转移至含有 1× 冰冷 PBS 的 50 ml 离心管中。避免直接用镊子夹取胚胎，以尽量减少组织损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>将解剖后的胚胎置于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，在 4 °C 下固定超过 24 小时，固定液体积至少为样本体积的 10 倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预处理
	<ol>
		<li>配制透明溶液：在双蒸水中加入 4 M 尿素、10% 甘油和 4% 十二烷基硫酸钠（SDS）。</li>
		<li>用透明溶液替换固定液。</li>
		<li>将样本置于摇床上，室温下轻柔振荡 1 至 2 周。在第 2 天和第 3 天各更换一次透明溶液。样本将逐渐变得透明且半透明。</li>
		<li>用 10% 福尔马林替换透明溶液，并在摇床上继续振荡 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水
	<ol>
		<li>用 1× PBS 洗涤预处理后的样本，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>在温和振荡条件下，于室温下使用递增浓度的乙醇系列进行脱水。对于 E15.5 胚胎，依次使用 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95% 和 100% 乙醇，每步 2 小时。对于更晚期的胚胎，需延长孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>配制染色液：将 0.1375 克伊红 Y 二钠盐和 0.0275 克吖啶橙半（氯化锌）盐溶于 50 ml 100% 乙醇中，搅拌 2 小时，用滤纸过滤。室温保存，并用铝箔包裹避光。</li>
		<li>将样本转移至染色液中，染色 1 小时。</li>
		<li>更换新鲜染色液，继续染色过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浸透
	<ol>
		<li>配制浸透液：取 100 ml JB-4 包埋试剂盒中的溶液 A，加入 1.25 g 催化剂 C、0.275 g 伊红 Y 二钠盐和 0.055 g 吖啶橙半（氯化锌）盐，于冰浴中搅拌混合（200 rpm）2 小时，然后用滤纸过滤。</li>
		<li>将浸透液储存于 4 °C，用铝箔包裹避光保存。</li>
		<li>将胚胎转移至浸透液与染色液按 1:1 混合的溶液中，在 4 °C 摇床上孵育至少 3 小时。</li>
		<li>将胚胎转移至纯浸透液中，在低温室摇床上继续孵育 3 小时。</li>
		<li>每天更换一次浸透液，并在低温室中于轻柔振荡条件下继续孵育三天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 包埋
<ol>
	<li>将溶液B和渗透溶液置于冰上。</li>
	<li>包埋前立即配制包埋溶液（按溶液B与渗透溶液1:25的比例混合）。</li>
	<li>将样品在包埋模具中定向，然后轻轻倒入冷的包埋溶液至模具中。如有需要，可用细针重新调整样品方向。</li>
	<li>用细针检查包埋溶液是否已完全凝固。推出样品块，必要时进行修整。</li>
	<li>使用独立的模具重新定向样品块，以获得横切方向。</li>
	<li>将样品块夹持器置于包埋模具上方，轻轻向模具中倒入包埋溶液，直至模具和块夹持器完全浸没于包埋溶液中。</li>
	<li>将样品置于次级容器中，在通风橱内冰上静置3–4小时。</li>
	<li>将凝固后的样品储存于4 °C环境中。</li>
	<li>剥离包埋模具，将样品块置于解剖显微镜下，采用斜射照明观察样品在块中的位置，并在块的表面围绕样品标记网格线。</li>
	<li>以标记的网格线为参考，修去多余的包埋材料。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>将样本块夹紧在切片机上并获得一个新鲜的切削面。设置切片厚度（例如，e9.5-10.5，1.5 µm；e11.5-12.5，2.0 µm；e13.5-15.5，2.5 µm；e16.5及以后，3 µm）。将样本/包埋块保持在切片机的初始位置。</li>
	<li>将体视变倍显微镜水平放置，使其镜头朝向样本的包埋面。</li>
	<li>打开计算机和显微镜，启动图像采集软件。</li>
	<li>在体视显微镜下观察并聚焦至组织块表面 &#34;实时观察&#34; 成像软件的模式</li>
	<li>必要时调整显微镜和切片机，使组织块表面位于视野中心。</li>
	<li>调整放大倍数，使整个切块表面位于取景器视野范围内。</li>
	<li>选择绿色荧光蛋白（GFP）滤光片（激发波长470 ± 20 nm，二向色镜495 nm，发射波长525 ± 25 nm），必要时重新对焦。</li>
	<li>手动测量并设置曝光时间（例如， 80 - 400 毫秒</li>
	<li>每次新鲜切片后获取切面图像，并在可能的情况下自动保存图像。</li>
	<li>记录重要参数，包括分辨率、切片厚度和缩放倍数。</li>
	<li>完成整个样本后，如有必要，导出所有图像文件并将其转换为 JPEG 格式。</li>
	<li>使用图像处理软件将所有原始图像反转，并调整亮度和对比度。</li>
	<li>将所有处理后的图像保存在单独的文件夹中。</li>
</ol>
4. 三维可视化
<ol>
	<li>按照说明将所有处理后的图像上传至3D可视化软件。</li>
	<li>输入分辨率和切片厚度，以将所有图像转换为体数据（即， 体素大小）并保存三维文件。</li>
	<li>使用自动模式对齐所有图像。如有需要，可手动调整单个图像。</li>
	<li>将对齐后的图像保存为新的文件名。</li>
	<li>使用3D可视化软件分析样本的形态计量特征。</li>
</ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
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<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种改进的实验方案，利用常规实验室设备获取连续的高分辨率显微光学切片断层成像（HREM）图像，适用于复杂结构的快速三维可视化与形态计量分析。由于高分辨率图像是直接从组织块表面获取，而非来自单个切片，因此精细的形态学特征得以保留，并可在三维可视化软件中快速进行数字化重建。
三维成像在可视化和理解复杂形态特征方面具有显著优势。大多数三维成像技术依赖于专用设备1-4。相比之下，EFIC和HREM成像仅使用常规实验室设备，包括配备数码相机的体视显微镜和切片机14。显微镜与切片机的功能耦合可实现整个图像采集过程的自动化。然而，我们已证明功能耦合并非必需8。取而代之的是，我们将体视显微镜水平安装，使其镜头正对标准切片机在静止限位位置时的组织块断面。这种简单装置的主要局限在于HREM图像必须手动采集。据估算，平均每张图像采集耗时约5秒。另一局限是单幅图像可能从一个位置偏移至另一位置，但在三维重建过程中可轻松重新对齐，因此该问题并不显著。
利用HREM技术，我们分析了...

3D成像技术的出现为系统分析胎儿发育过程中详细的形态学特征提供了可能。目前已有多种3D成像方式可供选择，包括显微磁共振成像（micro-MRI）、显微计算机断层扫描（micro computed tomography）、高频超声、光学相干断层扫描、光学投影断层成像以及表层显微镜技术1-4。每种成像方式在分辨率、对比度、成像速度、成本、子宫内（in utero）应用能力及可及性方面均具有各自独特的特点。
表面荧光成像（EFIC）和高分辨率表面显微技术（HREM）是两种表面显微成像方法4。在此类技术中，高分辨率的连续图像直接从组织块表面持续获取，而非来自切片后的组织样本。所获得的图像能够真实反映精细的形态学特征，且几乎不存在或仅有轻微的组织形变。获取的三维数据可直接转换为适用于精确形态测量分析的高分辨率三维图像。由于成本相对较低且分辨率高，HREM 和 EPIC 已成为系统评估人类出生缺陷小鼠模型的优选替代方法2,4-8。
EFIC 和 HREM 方法均需要将样本包埋在合适的介质中。EFIC 检测来自包埋组织的自发荧光。因此，该方法仅限于具有较强自发荧光的样本，而不适用于自发荧光较弱的样本，例如早期胚胎9。为了克服对自发荧光的依赖，HREM 成像中通常使用荧光染料（如伊红）对样本进行染色。染料和染色方法的选择也使 HREM 更适合在组织结构和形态背景下检测分子信号4,10。
本文介绍了一种改进的高分辨率表型成像（HREM）方案，适用于晚期小鼠胚胎的全身评估。为了促进染色效果，我们在流程中增加了一个预处理步骤以增强组织通透性，从而实现对较晚期小鼠胚胎的HREM成像。

<table><tbody><tr><td>小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>C57BL/6</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 证明，无水，ACS/USP/犹太认证级</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>澄清液</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>澄清溶液</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>澄清溶液</td></tr><tr><td>伊红Y二钠盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP241925</td><td>渗透溶液</td></tr><tr><td>吖啶橙半（氯化锌）盐</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>渗透溶液</td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>通用电气</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 包埋试剂盒 - A 液</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>渗透溶液</td></tr><tr><td>JB-4 包埋试剂盒 - 溶液 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>包埋剂</td></tr><tr><td>JB-4&amp;nbsp;嵌入试剂盒 - 催化剂</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>渗透溶液</td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 毫米</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 快速包埋模具</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm × 22 mm 方形，截角为 12 mm × 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&amp;nbsp;塑料块状样品架</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>一次性刻度移液管</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>胚胎解剖</td></tr><tr><td>不锈钢镊尖</td><td>&amp;nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>胚胎解剖</td></tr><tr><td>格劳弗组织镊</td><td>&amp;nbsp;ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>胚胎解剖</td></tr><tr><td>精细手术剪</td><td>&amp;nbsp;ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>胚胎解剖</td></tr><tr><td>14 ml 聚丙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml（3.4 oz.）防静电聚苯乙烯称量皿</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml（11.2 盎司）防静电聚苯乙烯称量皿</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>滨松光子学</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>照明器</td><td>卡尔·蔡司</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视变倍显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>一次性切片刀</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>单边分配器</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>卡尔·蔡司</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D 软件</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell T7600，2 块 900 GB SAS 硬盘和 64 GB DDR3 RDIMM 内存</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床平台振荡器</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>标准加热板搅拌器</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>梅特勒-托利多</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

快速获取三维图像的高分辨率表面荧光显微技术

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

高分辨率表层显微成像（HREM）技术能够快速获取高分辨率的数字化体积数据和三维（3D）形态测量数据。本文中，我们描述了对完整小鼠胚胎进行成像的详细实验方案。该方案主要包括四个主要步骤：样品制备、包埋、图像采集以及最终的三维可视化。该技术要求样品使用荧光染料染色，但对于较大或较致密的样品，染色可能难以渗透。为克服这一限制，我们改进了现有方案，通过在染色前使用含尿素和十二烷基硫酸钠的溶液对样品进行预处理，以增强染料在组织中的渗透能力。本方案仅需常规实验室设备和试剂，易于在标准实验室环境中推广应用。我们证明，所获得的高分辨率三维图像能够真实再现小鼠胚胎内部器官的精细形态特征，从而支持形态测量学分析。综上，我们提供了一种使用常规实验室设备获取小型和大型样品高分辨率三维图像的详细且优化的实验方案。

我们已报道了小鼠胚胎在 e9.5 至 e13.5 期间的高质量 HREM 图像8。然而，由于荧光染料伊红的组织穿透能力有限，晚期胚胎的图像质量显著下降。为了提高染色效率，我们测试了多种适用于荧光成像的预处理方法11。具体而言，对 e15.5 小鼠胚胎分别采用 Sca/e A212 或全组织 CUBIC13 进行处理。我们还测试了简化配方——透明化溶液（4 M 尿素、10% 甘油和 4% 十二烷基硫酸钠）。所有预处理方法均提高了染色效率。经透明化溶液处理 1 周后，胚胎变得半透明。处理后未检测到明显的组织损伤。预处理后的胚胎经过脱水、染色和浸润等步骤，随后包埋于塑料包埋介质中。按照上文第 3 节（图像采集）所述方法，对包埋样本进行 HREM 图像采集，并使用 3D 可视化软件进行显示。e15.5 胚胎整体封片表面观的一个示例展示了皮肤的精细形态特征，包括胡须垫和正在发育的毛囊（图 1）。虚拟切片视图的分辨率与组织学切片相当（图 2</st...

我们介绍了一种利用高分辨率显影显微镜获取小鼠胚胎三维（3D）图像的详细方案。该改进方案采用改良的组织制备方法，以增强荧光染料的渗透性，从而允许对大小不同的样本进行形态计量分析。

高分辨率表层显微（HREM）技术可实现高分辨率数字三维容积图像的快速获取……

本方案的总体目标是利用标准实验室设备快速获取生物样本的高分辨率三维数字图像。该方法通过可视化复杂形态特征及其动态变化，可回答发育生物学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于使用常规实验仪器，且无需过多的前期经验。本实验操作将由我实验室的研究生 Jungang Huang 演示。按照文本方案所述完成胚胎的解剖和固定后，用透明溶液替换固定液，并在室温下轻轻振荡孵育一至两周。孵育结束后，将样本转移至10%福尔马林溶液中，继续在振荡器上放置两天。第三天，用 PBS 清洗样品，每次五分钟，共清洗三次。然后在室温下，将样品置于摇床上，依次用浓度递增的乙醇进行脱水，每个浓度脱水两小时。完成 100% 乙醇脱水后，将样品转移至染色液中染色一小时，并避光处理。然后，更换为新鲜的染色液，对样本进行过夜标记。次日早晨，将样本浸入等体积新配制的渗透液与染色液的混合溶液中，在4摄氏度下于摇床上孵育至少3小时。孵育结束后，将胚胎转移至渗透液中，继续在摇床上于4摄氏度孵育3小时。然后将上清液更换为新鲜的浸润液，在4°C下继续摇动三天。第四天，将胚胎置于包埋模具中并放置于冰上。将B溶液与浸润液混合，随后将模具轻轻浸入4°C的冷包埋液中。约三小时后，用枪头确认溶液是否已凝固，并将样本从模具中推出。修去多余的包埋材料，然后将样本块重新置于新模具中，呈交叉方向定位。接着，将整个装置放置于冰上，并置于通风橱中。轻轻将包埋液加入新模具中，直至模具完全浸没。然后将包埋盒盖置于模具顶部。三至四小时后，剥去包埋模具，将组织块置于解剖显微镜下，采用斜射照明，以确定标本在组织块中的位置。在包埋块表面，于样本周围标记网格线，并利用这些线条作为修除多余包埋材料的参考。为成像样本，首先将包埋块夹紧于切片机上，切出样本的新鲜表面。然后将体视变焦显微镜水平安装，使其正对样本的包埋块表面，并打开显微镜及其配套计算机。接下来，启动图像采集软件，并使用成像软件中的实时预览模式将光学系统对焦至组织块表面。根据需要调整显微镜与切片机，使组织块表面位于视野中心。该操作流程中最关键的步骤之一是在切片机的固定原点位置采集图像。调整放大倍数，确保整个块面位于取景框内。然后选择绿色荧光蛋白滤光片。继续预切组织块，直至样本组织显现，并根据需要重新对焦图像。手动测量并设置曝光时间后，每次新鲜切片后均需采集并保存切面图像，并记录重要的图像采集参数。成像结束后，将所有图像文件导出并转换为 JPEG 格式，使用适当的图像处理软件对所有原始图像进行反相处理，并根据需要调整图像的亮度和对比度。按照说明将所有处理后的图像上传至三维可视化软件。使用自动模式对所有图像进行对齐，并显示三维和二维结果。本图为代表性图像，显示的是经上述方法制备并成像的胚胎第15.5天小鼠胚胎的整体封片表面观。可观察到皮肤的详细形态学特征，包括须垫和正在发育的毛囊。重要的是，通

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用3D图像的快速采集高分辨率显微镜落射

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。...

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

四维（4D）成像技术被用于研究活体脊椎动物神经末梢中两种内体之间的行为及其相互作用。这些微小结构的运动在三维空间中得以表征，从而能够确认内体融合和胞吐等事件的发生。...

活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。...

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

我们提供了简单且可靠的方案，用于处理多种物种的活检材料、生物医学模式生物的胚胎以及其他有机组织样本，以通过高分辨率显式光学切片显微技术生成数字体积数据。...

高分辨率表层显微成像技术（HREM）——用于有机材料处理与可视化的简易且稳健的实验方案

近期，我们绘制了活细胞中各种蛋白质在初级纤毛内转运的三维（3D）空间路径。本文详细描述了应用于活体初级纤毛的新型3D超分辨率荧光成像技术的实验装置、生物样本处理过程以及数据分析方法。...

高速超分辨率SPEED显微镜在活体初级纤毛中的应用

本方案介绍了如何制备和装载细菌样品以进行活体三维成像，以及如何从这些图像中重建大肠杆菌（E.

用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

本文介绍了用于可视化和分析小鼠胚胎在体轴伸长和体节形成过程中三维和四维图像数据的计算工具与方法，这些图像数据通过整体光学投影断层成像技术、活体成像以及基于多光子显微镜的全胚免疫荧光染色获得。...

三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。...

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

学习使用标准实验室设备对小鼠胚胎进行高分辨率三维落射显微镜成像的技术。该方法可在发育生物学研究中实现详细的形态计量分析，一周内即可完成整个实验流程。

快速获取三维图像的高分辨率表面荧光显微技术

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