Name: 制备及在体内使用基于活动的探针对ñ -acylethanolamine酸酰胺酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 了解基于活性的探针ARN14686的合成与应用方法，用于检测N-acylethanolamine acid amidase（NAAA）的活性形式。该技术可在细胞提取物和组织切片中实现酶活性的可视化检测，为炎症和神经退行性疾病研究提供可靠工具。

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作者感谢位于意大利热那亚的意大利技术研究院 Nikon 成像中心（NIC@IIT）。

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作者无任何利益冲突需要披露。

酶活性在多个水平上受到精细调控，包括RNA转录、蛋白质合成、蛋白质转运、翻译后修饰以及蛋白质-蛋白质相互作用。通常，仅酶的表达水平并不能反映其实际活性。为研究蛋白质在其天然状态下的活性，人们开发了活性为基础的蛋白质组分析（ABPP）技术。该技术需要两个关键要素：一种能够共价结合目标酶活性位点的化学探针，以及一种用于检测探针标记酶的报告标签。
探针的设计与合成是该实验流程中的关键环节。探针必须对其靶标具有足够的亲和力和选择性。此外，报告基团的存在不应影响探针对靶标的结合能力。这一问题可通过设计两步法活性探针（ABP）在很大程度上得以解决，即在探针捕获靶标之后再引入报告基团。无标签探针特别适用于活体（in vivo）研究，在此类研究中可于活细胞或活体生物内评估蛋白质活性，同时将外界干扰降至最低。NAAA探针ARN14686的设计正是为了满足上述要求。其β-内酰胺反应性弹头的选择基于先前在β-内酰胺类NAAA抑制剂研究中获得的结果16,26。这类化合物通过共价结合于酶的催化半胱氨酸残基，以高效且高选择性的方式抑制NAAA活性。此外，这些化合物已被证...

常用于研究蛋白质表达模式、相互作用及功能的方法，包括用于鸟枪法分析的液相色谱-质谱联用平台1,2，酵母双杂交方法3,4，以及 体外 检测方法在评估蛋白质天然状态下的活性方面存在局限性。基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling, ABPP）可用于弥补这一不足。该方法利用能够共价结合目标酶活性位点的小分子探针，并将其与报告基团偶联，从而实现对靶标的检测。通过点击化学（click chemistry, CC），报告基团可被直接整合至探针中，或在探针与靶标结合后引入5,6后者操作需要使用含有适当化学基团（如末端炔烃或叠氮化物）的探针，这些基团可通过生物正交反应（例如Cu(I)催化的Huisgen [3+2]环加成反应）与多种报告分子试剂进行修饰。7-9 或施陶丁格连接反应10,11.
最近，我们公布了化合物 ARN14686 作为首个针对 ABP 的探针 体外 和 体内 NAAA（N-乙酰氨基葡糖苷酶）的半胱氨酸水解酶活性检测12NAAA 催化饱和及单不饱和脂肪酸乙醇酰胺（FAEs）的水解失活，包括油酰乙醇酰胺（OEA）和棕榈酰乙醇酰胺（PEA），后者是抗炎核受体 PPAR-α 的内源性激动剂。13-15NAAA 主要在巨噬细胞和其他单核细胞来源的细胞以及 B 淋巴细胞中表达。14,16，表明其在调控先天免疫反应中具有作用。该酶在粗面内质网中以非活性形式合成，并在细胞的酸性区室中通过自蛋白水解机制被激活17自催化裂解产生一个新的 N末端半胱氨酸（小鼠和大鼠为C131，人类为C126），是负责FAE水解的亲核基团18,19药理学抑制NAAA活性会改变FAE的合成/降解平衡，导致细胞内FAE水平升高16,20,21多种β-内酯和β-内酰胺衍生物已被证明可高效且高选择性地抑制NAAA活性16,22-26这些抑制剂通过以下方式发挥作用 S-催化性半胱氨酸的酰化16,27,28.
化合物 ARN14686 是基于具有全身活性的丝氨酸衍生β-内酰胺类 NAAA 抑制剂 ARN726（4-环己基丁基-N-[(S)-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯)16. ARN726中的4-丁基-环己基被替换为带有末端炔基标签的C9饱和脂肪链，以便后续与含叠氮报告标签的分子进行碳-碳偶联反应。我们选择设计两步法的活性探针，以尽可能减少对原始骨架结构的修饰，从而保持探针对NAAA的亲和力。此外，由于避免引入大体积的标记基团，此类探针可能更适用于 体内 治疗效果优于直接的ABP。ARN14686以高活性抑制NAAA（hNAAA IC₅₀）50 = 6 nM，rNAAA IC50 通过与酶的催化半胱氨酸形成共价加合物（= 13 nM）12在活体大鼠实验中发现，该探针能够选择性捕获肺部表达的NAAA。当使用高浓度探针（10 µM）时，另一种与NAAA具有33-34%序列同源性的半胱氨酸酰胺酶——酸性神经酰胺酶，也被鉴定为低亲和力作用靶点。 体外，10 mg/ml 静脉注射，i.v.)12我们还使用 ARN14686 研究了在给予完全弗氏佐剂（CFA）后，炎症大鼠组织中是否存在有活性的 NAAA29.
此处，我们概述了一种制备 ARN14686 的方案（图1及其在NAAA激活机制研究中的应用 离体以一个实验为例，我们描述了在大鼠足爪注射CFA后，通过探针标记可视化NAAA的实验流程。该实验中，在静脉注射探针后提取足爪组织中的蛋白质，将探针标记的蛋白质组进行生物素-叠氮化物的点击化学反应（CC）。利用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的样品，并进行蛋白质印迹分析。在另一项应用中，我们描述了通过荧光显微镜对经探针处理的小鼠肺组织中具有活性的NAAA进行定位。在此情况下，组织被切片后，切片进行点击化学反应以偶联罗丹明荧光染料。工作流程示意图如图所示。 图2.

<table><tbody><tr><td>1,1&amp;rsquo;-亚磺酰基二咪唑&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>有害的</td></tr><tr><td>2-二吡啶基碳酸酯</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>有害的</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>易燃，有毒，对水生环境有害</td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>有毒</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>易燃，腐蚀性</td></tr><tr><td>乙腈&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>有害的</td></tr><tr><td>叠氮-PEG3-生物素</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>叠氮-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>离心柱</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅藻土</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>健康危害</td></tr><tr><td>硝酸铈铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>氧化性，有害</td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;0.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>环己二烯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>易燃，健康危害</td></tr><tr><td>环己烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>易燃，有害，健康危害，环境危害</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>有害，健康危害</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>易燃，有害</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 &lt;em&gt;d&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; （DMSO-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>易燃，有害</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>易燃，有害</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT 链霉亲和素</td><td>Li-Cor 生物科学</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>使用前短暂离心以沉淀蛋白质复合物</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>易燃，有毒，危害健康</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-二甲氨基丙基)-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;盐酸乙基碳二亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>有害，腐蚀性</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;二异丙基乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>易燃，腐蚀性，有毒</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>易燃，有害，健康危害</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;Cbz-L-丝氨酸</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>有害的</td></tr><tr><td>尼康A1共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>阅读用户手册</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>碳载钯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-茴香胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>有毒，健康危害，环境危害</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>有毒、吸入有害、腐蚀性、易燃</td></tr><tr><td>聚乙二醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>避免气泡产生</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>有毒、腐蚀性、易燃</td></tr><tr><td>氢化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>易燃</td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 成像扫描仪</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>阅读&amp;nbsp; 用户手册</td></tr><tr><td>链霉亲和素琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>叔丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>有毒，易燃</td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>易燃，有害，健康危害</td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>有毒，于50℃温育 &amp;deg;C 溶解</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦（TCEP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>吐温-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic 组织匀浆机</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十一碳-10-炔-1-醇</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>有害的</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>有毒，于 50 °C 保温 &amp;deg;C以溶解</td></tr></tbody></table>

制备与 在体实验 使用基于活性的探针 n酰基乙醇胺酸性酰胺酶

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）是一种利用靶向酶活性位点的化学探针，在复杂蛋白质组中鉴定目标酶的方法。通过在探针中引入报告标签，可借助凝胶内荧光扫描、蛋白质印迹、荧光显微镜或液相色谱-质谱联用技术对标记的酶进行检测。本文描述了化合物ARN14686的制备及其应用，该化合物是一种基于点击化学的活性探针（CC-ABP），可选择性识别N-酰基乙醇胺酸性水解酶（NAAA）。NAAA是一种半胱氨酸水解酶，通过失活内源性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-alpha激动剂（如棕榈酰乙醇胺（PEA）和油酰乙醇胺（OEA））促进炎症反应。NAAA最初合成的是无活性的全长前体酶，其在溶酶体的酸性pH环境中通过自蛋白水解被激活。定位研究表明，NAAA主要在巨噬细胞及其他单核细胞来源的细胞以及B淋巴细胞中表达。我们提供了应用ARN14686在啮齿类动物组织中通过蛋白质印迹和荧光显微镜进行ex vivo检测和定量活性NAAA的实例。

ARN14686 是基于 NAAA 抑制剂 ARN726 的骨架设计而成。ARN726 中的 4-丁基-环己基被一条带有末端炔基标签的 C9 饱和脂肪链取代（图1）。引入炔基标签旨在通过碳-碳键（CC）实现两步标记程序，从而添加荧光团或生物素分子。这一特性使 ARN14686 成为研究 NAAA 的一种极为通用的工具 体外 和 体内.
此处展示了 ARN14686 的两种应用，代表了该分子的潜在用途。图2 为本研究中所述实验流程的示意图。探针经静脉给药后，可采用两种不同的检测方法：i）通过蛋白质印迹法分析 NAAA 活性表达；ii）通过荧光显微镜分析 NAAA 活性表达及其在细胞内的定位。
首个代表性结果由我们课题组近期发表<su...

本文介绍了活性依赖性探针（ARN14686，十一碳-10-炔基-N-[(3S)-2-氧杂氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸酯）的制备与使用方法，该探针可用于体外（in vitro）和离体（ex vivo）条件下检测并定量炎症相关酶N-脂肪酸乙醇胺酸性水解酶（NAAA）的活性形式。

制备与 在体实验 使用基于活性的探针 N酰基乙醇胺酸性酰胺酶

基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling, ABPP）是一种通过使用化学探针在复杂蛋白质组中鉴定目标酶的方法。

本实验的总体目标是展示一种活性依赖性探针 ARN 14 six eight six 的合成方法，该探针特异性靶向 N-酰基乙醇胺酸性酰胺酶（N-acylethanolamine acid amidase, NAAA），并描述其在细胞提取物和组织切片中检测具有催化活性的 NAAA 酶的应用。该方法有助于解答关于 NAAA 在体（in viva）功能的问题，为理解 NAAA 在不同生理和病理条件（如炎症和神经退行性疾病）下的激活状态提供见解。其主要优势在于，在 NAAA 与探针发生反应后仅需简单的操作步骤，即可获得关于该酶在体激活状态的可靠信息。另一个优势是，与特异性抗体不同，我们的探针仅检测酶的活性形式，这在荧光显微镜分析中具有重要意义。对该方法进行直观展示至关重要，因为它融合了多种专业技术，从正确的合成到最终应用，完整地呈现了整个研究过程。在50毫升圆底烧瓶中，溶解350毫克十一炔醇和3.5毫升干燥的二氯甲烷。然后向该溶液中加入25毫克DMAP和530毫克DPC。在室温下搅拌混合物16小时。16小时后，向溶液中加入20毫升二氯甲烷。将混合物转移至分液漏斗中。加入15毫升水。振荡混合物，静置使其两相分离。接着打开活塞，收集下层的有机相，关闭活塞，将有机相重新转移回分液漏斗中。向混合物中加入15 mL饱和碳酸氢钠溶液。振荡分液漏斗，静置使两相分层。将有机层用硫酸钠干燥后，通过棉花过滤至分层的圆底烧瓶中。然后使用旋转蒸发仪在减压条件下将有机层蒸干。称量烧瓶，得到600毫克油状物，其为两种组分的混合物：吡啶基十一炔基碳酸酯和十一炔醇二氧吡啶羧酸酯，二者比例为1.7比1。在10毫升圆底烧瓶中，将60毫克乙炔基乙酰胺氧化物溶于2毫升无水二氯甲烷中。将溶液置于冰浴中冷却至0摄氏度，然后逐滴加入81微升二异丙基乙基胺。接下来，将含有十一炔醇二氧吡啶羧酸酯的350毫克粗混合物溶于2毫升无水二氯甲烷中。将溶解的混合物加入溶液中，室温下搅拌15小时。然后使用旋转蒸发仪在减压条件下将溶剂蒸干。使用自动柱层析装置，通过硅胶柱层析纯化该化合物。首先将样品吸附到硅胶上。用环己烯平衡柱子后，将样品加载到柱中。用环己烷中的乙酸乙酯以0到100的梯度洗脱样品，并将洗脱峰收集到试管中。使用旋转蒸发仪在减压条件下将对应于该化合物的各馏分溶剂完全蒸发，得到40毫克白色固体。按照文本方案中所述预清除样品后，加入11.3微升浓度为5毫摩尔的叠氮聚乙二醇生物素储备液，并涡旋混匀。然后向样品中加入11.3微升浓度为50毫摩尔的新鲜配制TCEP储备液，并涡旋混匀。将 34 微升新配制的 1.7 毫摩尔 TBTA 工作溶液与 11.3 微升 50 毫摩尔硫酸铜储备液预先混合后，加入 45.3 毫升该混合溶液至样品中，并涡旋混匀。使用带标签的容器。将反应体系在 25 °C 下孵育至少 2 小时。孵育一小时后，观察

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

制备及<em&gt;在体内</em&gt;使用基于活动的探针对<em&gt;ñ</em&gt; -acylethanolamine酸酰胺酶

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用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

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通过预包埋免疫电镜技术研究视网膜环路与分子定位

了解基于活性的探针ARN14686的合成与应用方法，用于检测N-acylethanolamine acid amidase（NAAA）的活性形式。该技术可在细胞提取物和组织切片中实现酶活性的可视化检测，为炎症和神经退行性疾病研究提供可靠工具。

制备与在体实验使用基于活性的探针 N酰基乙醇胺酸性酰胺酶

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