Name: 一个简单的机械过程来创建在小鼠角膜缘干细胞缺乏症 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 了解在小鼠中创建角膜缘干细胞缺乏症模型的简单机械方法。该技术可避免额外眼损伤，适用于长期细胞与分子水平研究及新型治疗方案的疗效评估。

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作者感谢Ruth Zelkha（理学硕士）在成像方面提供的大力支持。本研究由临床科学家发展计划项目K12EY021475（授予M.E.）、R01 EY024349-01A1基金（授予A.R.D.）、美国国立卫生研究院国家眼科研究所核心基金EY01792，以及防盲研究组织的无限制资助支持。A.R.D. 获得了防盲研究组织职业发展奖。

所有动物实验操作均符合视觉与眼科研究协会关于动物在视觉研究中使用的声明。实验使用了14只4至6月龄的雄性/雌性C57BL/6J野生型小鼠：其中10只用于损伤模型，4只作为对照动物（未损伤角膜）。
1. 动物准备
<ol>
	<li>通过腹腔注射100 mg/kg的氯胺酮和5 mg/kg的赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。麻醉起效后，捏压脚趾以确认麻醉深度；小鼠应无反应。</li>
	<li>在进行实验前，使用裂隙灯检查眼睛，确认角膜无既往损伤。</li>
	<li>在眼部滴入一滴1%盐酸丁卡因。60至90秒后，测试角膜反射以确认感觉消失。也可使用0.5%盐酸丙帕卡因替代。</li>
	<li>确认角膜感觉丧失后，轻柔地在眼部及眼周毛发上滴加一滴5%聚维酮碘。1分钟后擦去药液，或将药液涂抹于眼周毛发，以防止毛发干扰工具尖端。</li>
</ol>
2. 磨削角膜上皮
<ol>
	<li>佩戴外科手套和手术服。准备所需器械：无菌旋转钻头和一把无菌镊子。为便于操作，建议使用弯头镊子。操作过程中将器械放置于无菌敷布上。</li>
	<li>使用弯头镊子从鼻侧夹住眼睑，轻轻固定眼球并使其轻度突出。避免施加过大压力。</li>
	<li>在手术显微镜下，使用无菌旋转钻头围绕角膜缘区域进行360°剃除，重复两次。每圈操作速度控制在5至6秒。 
	注意：钻头为固定转速。但要达到设定转速，必须将&#34;末端螺母&#34;完全拧紧。</li>
	<li>使用旋转钻头将角膜上皮从一侧角膜缘至对侧完全去除。为获得更佳效果，应以环形方式移动器械，并使器械与角膜表面保持一定平行度，利用其尖端侧面进行操作。注意避免对已去除上皮的区域重复刷擦，以防损伤基质层。操作时切勿对眼球施加压力。根据需要及时清洁刷头。</li>
	<li>在角膜表面滴加一滴无菌磷酸盐缓冲液，并用柔软的清洁纸巾轻轻擦去脱落的上皮组织。</li>
	<li>如有残留上皮，需进一步剃除。</li>
	<li>手术过程中应注意观察小鼠尾巴的状态。 
	注意：若出现尾部活动，表明麻醉深度已不足，需追加注射。追加剂量应为初始注射量的三分之一至三分之二即可。切勿过量使用麻醉药物。</li>
	<li>在对另一只眼睛使用前，必须对所有器械进行灭菌处理。</li>
</ol>
3. 确认上皮完全去除
<ol>
	<li>在角膜上滴加一滴 1 mg/ml 荧光素钠。30 秒后清洁角膜，并在显微镜下使用钴蓝滤光片检查，以确认上皮已完全去除。 
	注意：角膜上皮缺损区域呈绿色显示。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将动物置于加热垫上，并在其恢复期间放置于安全处（例如，放入其笼中）。切勿将无意识的动物与有意识的动物同置一处。</li>
	<li>涂抹1%红霉素眼膏，以预防眼部干燥。术后每日继续使用该抗生素，持续一周。</li>
	<li>手术后皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，12小时后再次注射。此后每日注射两次，持续两天。</li>
	<li>观察动物30至45分钟，直至其完全从麻醉中恢复。 
	注意：恢复期间腹侧呼吸肌的轻微运动表明动物状态良好。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本文介绍了一种可重复且相对简单的构建小鼠LSCD模型的技术。该模型有几个重要特点值得注意。首先，与使用化学物质的模型11, 12不同，这种损伤主要局限于角膜表面上皮（及基底膜），对角膜基质层或其他眼内结构的损害极小。因此，炎症反应和瘢痕形成均较轻微，而这两种情况都可能使操作复杂化，并增加评估针对角膜缘干细胞干预措施效果的难度。Li et al.10近期一项有趣的研究比较了旋转钻头与不同手术和化学处理组合在兔体上建立LSCD模型的效果，结果也发现使用钻头更为安全且有效。其次，该模型的病理状态似乎至少可稳定维持三个月1。建立该模型所用的旋转钻头是角膜临床工作者以及从事小鼠创伤研究的研究人员所熟悉的工具。与使用钝性刮匙相比，其优势在于造成的损伤更加均匀且可重复1。
为更有效地破坏角膜缘干细胞，对角膜缘区域进行了两次处理。根据小鼠眼球操作经验，超过两次的处理常会磨损角膜缘血管并导致出血。若该技术应用于其他动物，此步骤可根据角膜上皮厚度进行相应调整。本研究中使用了带有0.5 mm磨头的电...

角膜上皮对于维持角膜的透明性和完整性至关重要。它在整个生命过程中由位于角膜与结膜交界处狭窄区域——角膜缘中的上皮干细胞不断更新。这些具有自我更新能力的角膜缘干细胞在正常情况下以及损伤后对角膜上皮的再生起着关键作用。这些干细胞的部分或完全缺失将导致反复发作的角膜糜烂、疼痛、角膜瘢痕和新生血管形成、杯状细胞出现，若不加治疗，最终可致角膜盲。这种状况被称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），其病因可以是特发性、遗传性，或由化学伤、热烧伤、长期佩戴隐形眼镜及慢性炎症等获得性因素引起1-6。
LSCD 的研究需要一种合适的动物模型，该模型不仅能够模拟人类的疾病状况，而且具有可重复性和可持续性，同时对其他角膜和眼部结构造成的损伤最小。这种模型对于评估治疗方法以及在分子和细胞水平上阐明疾病机制至关重要。如前所述1，通过使用旋转磨头，可以轻松建立一种具有上述优点且持续至少三个月的小鼠 LSCD 模型。本研究的目的是建立一种简单、可重复且可持续的小鼠 LSCD 模型。
旋转钻头是一种便捷的工具，可均匀地去除上皮层，同时不损伤其下方的基质1。该工具已被用于在伤口愈合研究中诱导中央角膜上皮缺损7, 8。本文所介绍的在小鼠中建立角膜缘干细胞缺乏（LSCD）的技术此前尚未见报道。以往采用钝性刮匙刮除上皮的方法所造成的损伤均匀性较差——尤其是在角膜缘区域——且表型变异较大1, 9，更易出现正常角膜上皮的修复1。与钝性刮除工具不同，旋转钻头还可同时去除上皮基底膜7, 8, 10。其他已报道的破坏干细胞的方法包括使用化学物质，如氢氧化钠、正庚醇和苯扎氯铵，这些物质不仅可能对眼球深层结构造成非预期损伤，还可能引发显著的炎症反应，进而导致角膜混浊或上皮鳞状化生11-15。而旋转钻头则不会引起此类严重并发症。手术切除角膜缘上皮（单独或联合化学方法）10, 11, 16操作难度较大，尤其不适用于眼表尺寸较小且角膜缘上皮较薄的动物（如小鼠）。此外，令人意外的是，角膜缘切除术仍可能残留部分角膜缘上皮10。
以下所述的技术将导致出现伴有新生血管化和结膜化的角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），其表现与患者中完全性LSCD的临床表现相似，并可持续至少三个月1。该技术适用于旨在研究小鼠角膜缘干细胞缺乏症或伤口愈合病理生理学、免疫学及潜在治疗方法的研究人员。可能经过适当改良后，该操作也可应用于大鼠或兔10。由于旋转钻头可高效去除上皮层，因此该方法还可用于任何与角膜上皮擦伤/损伤相关的研究，以及相关治疗或分子生物学研究。

<table><tbody><tr><td>旋转磨头：AlgerBrush II 锈环去除器&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, 美国克利尔沃特</td><td>16-141</td><td>0.5 mm 磨头。其他公司亦有供应。</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Wild Heerbrugg, 瑞士</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Nikon, 泰国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 裂隙灯</td><td>Nikon, 日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多克隆抗 CK12 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, 美国加利福尼亚州</td><td>SC-17101</td><td>1:100 浓度</td></tr><tr><td>单克隆抗 CK8 抗体</td><td>TROMA-I-s, 美国爱荷华州爱荷华城</td><td>AB_531826</td><td>1:50 浓度</td></tr></tbody></table>

一种建立小鼠角膜缘干细胞缺乏症的简易机械方法

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）是一种角膜缘上皮干细胞功能障碍或缺失的状态，其后果是角膜上皮被结膜组织取代。患者会出现反复的角膜缺损、疼痛、炎症以及视力丧失。
此前，已有研究描述并比较了三种小鼠LSCD模型。其目标是建立一种稳定的小鼠LSCD模型，既能模拟人类疾病的表型，又能维持足够长的时间，以便研究疾病的病理生理机制并评估新的治疗方法。本文对此技术进行了更为详细的描述。
已设计一种带有旋转磨头的电动工具，用于清除角膜表面的铁锈环，或对翼状胬肉切除后的创面进行修整。该工具适用于构建理想的角膜缘干细胞缺乏（LSCD）模型。它是一种易于获取且操作简便的设备，具有精细的尖端，适合在小眼球（如小鼠）上进行操作。该工具的应用可避免对眼睛造成不必要的创伤，且不会像化学损伤模型那样导致意外的组织损伤。与钝性刮刀不同，该工具能够连同基底膜一并去除上皮组织。在本实验方案中，先对角膜缘区域进行两次刮擦，随后将整个角膜上皮从一侧角膜缘到另一侧角膜缘完全剃除。为避免损伤角膜基质，在上皮已被完全去除后，不再对角膜表面进行刷拭操作。

采用该技术后一个月内，100%的角膜出现浅层新生血管化（图1A。照片使用连接裂隙灯的相机在明场和钴蓝滤光片下拍摄）。在20只眼中的18只（90%）中，新生血管化累及整个角膜表面（图1A）。在20只眼中的2只（10%）中，新生血管化出现在四个角膜象限中的三个，但仍延伸至角膜中央。
为了验证鳞状上皮干细胞缺乏症（LSCD）的发展，进行了整体免疫染色1。此步骤不属于本实验方案的一部分，可根据具体目标和研究兴趣进行调整。LSCD的三个特征性变化被作为评估指标：角蛋白（CK）12的缺失，这是一种正常角膜上皮细胞特有的中间丝蛋白17, 18；角蛋白CK8的出现，CK8是一种单层上皮标志物20，在正常角膜中不存在；以及角膜表面出现杯状细胞。为了评估角膜上皮表型，在损伤后三个月对整体样本进行CK12和CK8的双重免疫染色，方法如先前所述...

以下文章提供了一种简便且可重复的技术，用于有效建立可持续的小鼠角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）模型。该动物模型可用于测试和比较针对角膜缘干细胞疾病治疗方法的有效性。

角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）是一种角膜缘上皮干细胞功能障碍或缺失的状态，此后角膜上皮被……所取代

本实验的总体目标是建立一种可重复、可持续且稳定的角膜缘干细胞缺乏小鼠模型。该简单技术可提供一致的角膜缘干细胞缺乏动物模型，且不会对眼睛造成不必要的损伤，而这一点在标准的化学损伤模型中难以实现。该模型适用于在细胞和分子水平上长期研究疾病的发生发展过程。以及用于测试或比较新型治疗方法的有效性。在小鼠麻醉后，捏压其脚趾以确认麻醉深度足够。在裂隙灯下检查眼睛，以确认角膜无既往损伤。在眼部滴入一滴1%盐酸四环卡因，等待60秒。随后，轻柔地将5%聚维酮碘涂抹于眼部及周围毛发上。一分钟后，擦去药液或将其涂抹至眼部周围的毛发上，以防止毛发干扰工具尖端。准备一个无菌的旋转钻头和一把无菌弯头镊子，并在操作过程中将其放置于无菌敷布上。现在，用弯头镊子从鼻侧夹住眼睑以固定眼球，并轻柔地外旋眼球。注意不要施加过大的压力。在手术显微镜下，使用无菌旋转钻头在角膜缘区域剃除两次。用旋转钻头以环形方式从一侧角膜缘到另一侧角膜缘彻底去除整个角膜上皮，并使用其尖端的侧面进行操作。为避免损伤基质，切勿对已去除上皮的角膜区域重复刷擦。切勿对眼球施加压力。根据需要清洁刷头。在角膜上滴加一滴无菌 PBS，用柔软的清洁纸巾擦去任何脱落的上皮片。然后，如有残留上皮，需将其剃除。注意观察小鼠尾巴，以确保手术期间麻醉深度足够。在角膜上滴一滴荧光素钠。30 秒后清洁角膜，并在显微镜下使用钴蓝色滤光片检查，以确认上皮已完全去除。手术后，将动物放回笼中并置于加热毯上，观察 30-45 分钟，直至其从麻醉中完全恢复。在此期间，向眼部涂抹 1% 红霉素眼膏，并继续每日使用抗生素眼膏一周。此外，立即皮下注射0.1 mg/kg的布托啡诺，并在手术后12小时再次注射，之后每天注射两次，持续两天。此为手术一个月后的角膜表型，可见明显的新生血管形成，这是角膜缘干细胞缺乏的特征表现。正常的角膜表达细胞角蛋白12，但不表达细胞角蛋白8，也不含杯状细胞。在角膜缘干细胞缺乏的情况下，角膜表面会出现细胞角蛋白8和杯状细胞，同时丢失细胞角蛋白12的表达。掌握该技术后，可在一个月内诱导出几乎覆盖整个小鼠角膜表面的角膜新生血管，且该状态可稳定维持达三个月。避免重复刷除已去除上皮的角膜区域，以免引起不必要的基质炎症和混浊。在建立角膜缘干细胞缺乏模型后，可对不同的实验性治疗方法进行测试和比较。或者，治疗可以在损伤后不久开始。本视频展示了如何有效去除小鼠角膜缘和角膜上皮，以诱导角膜缘干细胞缺乏症。经过一些修改后，该方法也可应用于其他动物。

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医学

一个简单的机械过程来创建在小鼠角膜缘干细胞缺乏症

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。...

经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射

关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠

本文介绍了使用R26R-Confetti小鼠进行多色谱系示踪实验的设计与操作原理，并提供了一种针对角膜上皮细胞追踪的具体实验方案，该方案可经修改后适用于其他感兴趣的组织。...

使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

本方案介绍了一种在无异种成分且无饲养层细胞的培养条件下，将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞的简单两步法。此处提供的细胞培养方法能够以较低成本大规模生产具有临床质量的细胞，适用于角膜细胞治疗。...

高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

本方案描述了一种在小鼠模型中诱导精确且可重复的角膜和角膜缘碱烧伤的方法。该方案的优点在于能够使损伤均匀地分布于曲率较高的小鼠角膜和角膜缘区域。...

采用打孔-角膜环钻技术在小鼠模型中诱导角膜和角缘碱烧伤损伤

本文介绍了一种分离和鉴定人角膜缘微环境细胞的实验方案。...

角膜缘微环境细胞的分离与鉴定

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

我们通过角膜上皮刮除联合角膜缝线的方法建立了一种大鼠严重角膜炎症模型。该研究评估了角膜炎症模式、上皮细胞增殖以及炎症条件下角膜缘干细胞的变化。...

基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型

本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.

从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案

了解在小鼠中创建角膜缘干细胞缺乏症模型的简单机械方法。该技术可避免额外眼损伤，适用于长期细胞与分子水平研究及新型治疗方案的疗效评估。

一种建立小鼠角膜缘干细胞缺乏症的简易机械方法

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