A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse
2016年11月17日
The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.
该程序的总体目标是创建一个可重复、可持续和持续的角膜缘干细胞缺陷小鼠模型。这种简单的技术提供了一致的角膜缘干细胞缺陷动物模型，而不会对眼睛造成不必要的伤害，这是标准化学损伤模型难以实现的。该模型可用于在细胞和分子水平上长期研究疾病过程。
用于测试或比较新疗法的疗效。麻醉小鼠后，捏住脚趾以确保足够的麻醉深度。在裂隙灯下检查眼睛，以验证是否有任何先前的角膜损伤。
将 1% 盐酸丁卡因滴入眼睛，等待 60 秒。接下来，将 5% 聚维酮碘轻轻涂抹在眼睛和周围的头发上。一分钟后，擦去滴剂或将其涂抹在眼睛周围的头发上，以防止头发干扰工具的尖端。
准备一个无菌旋转毛刺和一对无菌弯曲镊子，并在手术过程中将它们放在无菌床单上。现在，用弯曲的镊子从鼻侧抓住眼睑，轻轻地压迫眼睛，以稳定眼睛。小心不要施加太大的压力。
在手术显微镜下，使用无菌旋转毛刺在角膜缘区域周围剃除两次。用旋转毛刺以圆形方式从角膜缘到角膜缘去除整个角膜上皮，并处理其尖端的外侧。为避免基质损伤，请勿重新刷洗已去除上皮的角膜部分。
不要对眼睛施加任何压力。根据需要清洁刷头。在角膜上滴一滴无菌 PBS，然后用柔软的清洁纸擦去任何脱落的上皮片。
然后，剃掉剩余的上皮细胞（如果有）。注意小鼠尾巴，以确保手术过程中有足够的麻醉深度。将一滴 Flourescein 钠滴在角膜上。
30 秒后清洁角膜，并在显微镜下用钴蓝过滤器检查，以验证上皮是否完全去除。手术后，将动物放在笼子里的加热毯上，观察 30-45 分钟，直到完全从麻醉中恢复。同时，将 1% 红霉素眼药膏涂抹在眼睛上，并继续每天使用抗生素一周。
此外，立即皮下注射 0.1mg/kg 丁丙诺啡，手术后 12 小时，并继续注射，每天两次，持续两天。这是手术后一个月角膜表型。您可以看到广泛的新生血管形成，这是角膜缘干细胞缺乏症的一个特征。
正常角膜表达细胞角蛋白 12，但缺乏细胞角蛋白 8 或杯状细胞。在角膜缘干细胞缺乏症中，细胞角蛋白 8 和杯状细胞出现在角膜上，而细胞角蛋白 12 丢失。一旦掌握了这项技术，将导致角膜新生血管形成，几乎覆盖整个小鼠角膜表面，并且可稳定长达三个月。
重要的是要避免重新刷洗已经去除上皮的角膜部分。这会导致不希望的基质炎症和混浊。在角膜缘干细胞缺乏症发展后，可以测试和比较实验性治疗方法。
或者，可以在受伤后不久开始治疗。该视频展示了如何有效去除角膜缘和角膜上皮以诱导小鼠角膜缘干细胞缺乏。经过一些修改，它也可以在其他动物身上进行。
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概述
本文介绍了一种可重复的、用于建立可持续性小鼠角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）模型的技术。该模型对于研究疾病发生过程以及测试新型治疗方法至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 眼科学
背景
- 角膜缘干细胞缺乏会影响角膜健康和视力。
- 现有模型常引起非预期的损伤，使研究复杂化。
- 长期研究需要一种可持续的模型。
- 该技术旨在填补这一空白。
研究目的
- 建立稳定的LSCD小鼠模型。
- 促进对细胞和分子疾病过程的研究。
- 评估潜在治疗方法的有效性。
使用的方法
- 对小鼠施用麻醉。
- 使用裂隙灯检查小鼠眼睛是否有既往损伤。
- 采用特定技术诱导LSCD，同时避免额外损伤。
- 对模型进行长期监测。
主要结果
- 该模型成功模拟了LSCD，且不会造成非预期的眼部损伤。
- 它可用于长期的细胞和分子水平研究。
- 利用该模型可有效测试新型治疗方法。
- 实验结果表明，这是一种可靠的未来研究方法。
结论
- 该技术为LSCD研究提供了有价值的工具。
- 它有助于加深对角膜缘干细胞疾病的理解。
- 未来的研究可在此模型基础上进一步改善治疗方案。
常见问题
行业重要性概述
建立可重复的角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）小鼠模型，满足了眼科药物研发中对疾病相关系统的迫切需求。该模型能够实现对靶向角膜疾病再生疗法和抗炎治疗的临床前评估进行机制性风险排除和预测性验证。其稳定的表型特征和良好的转化一致性，有助于推动研发管线的稳健发展，并实现不同项目间的可比性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够探究角膜缘干细胞功能及角膜再生通路。
- 通过提供一致且可控损伤的疾病模型，支持生物学风险降低。
- 促进针对角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）候选治疗药物的功能性靶点验证。
- 提高眼表疾病研究中转化相关性的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的体内定量评估治疗效果的平台。
- 实现对细胞和分子终点指标（如细胞角蛋白表达和新生血管形成）的标准化评估。
- 支持对用于角膜修复的新化合物或生物制剂进行可重复、可扩展的筛选。
- 可在受控环境中可靠地比较不同治疗方式的效果。
转化与临床前研究
- 与人类角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）病理特征一致，支持转化生物标志物的开发。
- 支持从发现到再生治疗策略临床前验证的全过程连续性研究。
- 为靶向干细胞缺乏的眼科治疗药物提供基于风险评估的推进决策支持。
- 揭示疾病进展及治疗反应的潜在作用机制。
流程与工作流整合
该LSCD模型融入了从发现到临床前研究的连续过程，可用于眼表治疗策略的假设验证、先导化合物筛选和转化验证。
- Discovery Biology：支持对角膜缘干细胞丢失及角膜修复机制的假设驱动型研究。
- Screening：提供可重复、定量的读数，用于评估候选干预措施的有效性和安全性。
- Analytics：可测量分子标志物（例如，细胞角蛋白谱型）和新生血管化，以进行比较分析。
- Translational Research：通过模拟持续存在的角膜缘干细胞缺乏表型，将临床前发现与临床意义相衔接。
- Enterprise Reuse：提供标准化且可灵活调整的平台，用于跨项目评估眼用治疗药物。
运营与企业影响
- 科学价值：提高眼部药物开发中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强临床前LSCD研究的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：优化眼科产品组合的立项/终止决策及资本使用效率。
- 组合影响：实现对再生性和抗炎性候选药物的风险调整后优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备小动物眼科手术及术后护理的专业知识。
- 需要配备手术显微镜、电动磨钻和分子分析工具。
- 要求跨团队统一损伤诱导和表型评估的操作规程。
- 经适当操作调整后，可适用于其他小动物模型。
- 操作技术需谨慎细致，以避免角膜基质损伤并确保模型的一致性。
