Name: 方法来研究中性粒细胞脂质的改变和中性粒细胞胞外陷阱随后形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 了解中性粒细胞脂质组成分析方法，使用HPTLC和HPLC技术研究NET形成机制。该方法通过人血来源中性粒细胞分离与脂质分析，为免疫学研究提供实用方案。

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本工作得到了德国汉诺威兽医大学“动物与人畜共患感染”博士项目以及动物健康研究院（AfT）提供的博士后奖学金资助，获资助者为Ariane Neumann。

本方案中采集外周血的步骤已获得当地人类研究伦理委员会的批准。所有人类受试者均提供了书面知情同意书。
1. 通过密度梯度离心法分离人血液来源的中性粒细胞
<ol>
	<li>分离人血液来源的中性粒细胞
	<ol>
		<li>在火焰附近将约 20 mL 血液小心地铺在 20 mL 泛影葡胺/右旋糖酐溶液上，避免混合。</li>
		<li>以 470 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。</li>
		<li>移除单个核细胞层和淡黄色的血浆层。将多形核细胞（PMN）层（第二层，细胞聚集层；图 1 和 图 2）转移至新的 50 mL 离心管中，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）补至 50 mL。</li>
		<li>以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀用 5 mL 无菌水重悬 5 秒，以裂解红细胞。</li>
		<li>立即用 1× PBS 补至 50 mL，并以 470 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。沉淀应呈白色。若仍呈红色，重复步骤 1.1.5 和 1.1.6。</li>
		<li>将沉淀用 1,000 µL RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基重悬。在光学显微镜下使用台盼蓝染色法通过血细胞计数板计数细胞数量。</li>
		<li>用 RPMI 培养基配制浓度为 2 × 106/mL 的细胞悬液。从 20 mL 血液中可大约收获 2.5 × 107 个中性粒细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于脂质分析的中性粒细胞药物处理
	<ol>
		<li>取步骤 1.1.9 中的 5 × 107 个细胞。在 1.5 mL 反应管中，用纯 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）调整细胞数量，可选择加入或不加入 10 mM MβCD 或 25 nM PMA，总体积为 300 µL。</li>
		<li>将反应管中的样品在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。</li>
		<li>以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀用 300 µL HBSS 重悬。</li>
		<li>以 470 × g 离心 10 分钟，使用刹车。</li>
		<li>将细胞沉淀用 1 mL 氯仿/甲醇（1:1）重悬，使用 26 号针头连接 1 mL 注射器反复抽吸 10 次进行匀浆，随后将样品于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于免疫荧光定量 NET 的中性粒细胞药物处理
	<ol>
		<li>准备包被多聚-L-赖氨酸的 48 孔板，内含玻璃盖玻片。
		<ol>
			<li>在每个孔中放入一片 8 mm 玻璃盖玻片，加入 55 µL 无菌 0.01% 多聚-L-赖氨酸，室温（RT）孵育约 20 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 200 µL 1× PBS 洗涤两次。每孔加入 200 µL 1× PBS，将板置于冰箱中保存，直至使用。</li>
		<li>将步骤 1.1.9 得到的细胞悬液（2 × 105/100 µL）小心地在每孔盖玻片中心加入 100 µL。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 终浓度为 10 mM MβCD 或终浓度为 25 nM PMA 的溶液。</li>
		<li>以 370 × g 离心 5 分钟，使用刹车。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。</li>
		<li>以 370 × g 离心 5 分钟，使用刹车。</li>
		<li>用 155 µL 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，用保鲜膜包裹，于 4 °C 过夜或室温固定 10 分钟。 
		注：有关 MβCD 诱导 NET 形成的数据，请参见 Neumann et al.15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人源性中性粒细胞的脂质分离与分析
<ol>
	<li>根据布莱格和戴尔法从人外周血来源的中性粒细胞中分离脂质22 和 Brogden 等23
	<ol>
		<li>取1.2.6步骤中的中性粒细胞，置于冰上。</li>
		<li>在冰上，将中性粒细胞（存在于甲醇和氯仿溶液中）用移液器转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的15 mL螺口玻璃管中，并通过振荡1分钟进行匀浆。使用玻璃管可防止脂质结合到塑料表面；使用PTFE瓶盖可避免橡胶/塑料带来的污染。</li>
		<li>加入2 mL甲醇，1分钟后加入1 mL氯仿。再次振荡1分钟。</li>
		<li>将玻璃管在室温下以50 rpm转速旋转30分钟。</li>
		<li>在7 °C、1,952 × g条件下离心10分钟，使蛋白质组分沉淀。</li>
		<li>小心地将上清液倾入一个新的15 mL玻璃螺口管中，留下含有蛋白质的沉淀。将沉淀于-20 °C保存，用于后续定量分析。</li>
		<li>加入1 mL氯仿，静置1分钟，加入1 mL双蒸水，将含有样品的玻璃螺口管颠倒混匀30秒。</li>
		<li>在 7 °C、1,952 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上层相，直至但不包括浑浊层。</li>
		<li>如有需要，可重复步骤 2.1.8 进行额外的纯化。</li>
		<li>在真空浓缩仪中于60 °C下干燥样品，并于-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高效薄层色谱法（HPTLC）半定量分析多种脂质（包括胆固醇、磷脂和鞘磷脂）的含量
	<ol>
		<li>配制以下四种电泳运行缓冲液和染色液。
		<ol>
			<li>溶液1：混合乙酸乙酯（26.6%）、1-丙醇（26.6%）、氯仿（26.6%）、甲醇（26.6%）和氯化钾（9.6%）。通过将0.25 g KCl溶解于100 mL HPLC级水中制备KCl溶液。</li>
			<li>溶液2：混合正己烷（73%）、乙醚（23%）和柠檬酸（2%）。</li>
			<li>溶液3：100% 正己烷。</li>
			<li>将蒸馏水（90 mL）与7.5 g硫酸铜混合，配制染色液，然后加入10 mL磷酸。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在每个独立的玻璃室中分别加入每种溶液至5 mm高度。在每个室中添加任意类型的滤纸以提高运行速度。</li>
		<li>将一块20 × 10 cm的HPTLC硅胶60玻璃板在第一种展开剂中预展开，直至展开剂前沿到达板的顶端。随后在110 °C下干燥10分钟。 
		注意：这些平板可用铝箔包裹后保存以备将来使用，使用前在110 °C下干燥10分钟。</li>
		<li>将步骤2.1.10中获得的脂质沉淀物溶于200 µL氯仿/甲醇（1:1）溶液中，于37 °C孵育15分钟以充分溶解。</li>
		<li>使用直尺和软铅笔标记所需数量的样品加样位置，并至少标记一个标准品位置。分别在约4 cm和6 cm处标记第一种和第二种电泳溶液的电泳距离。</li>
		<li>为上样，每次加载新样品前，先用氯仿/甲醇（1:1）冲洗10 µL注射器3次。每份样品取10 µL逐滴上样，尽量将样品集中于尽可能小的区域。每个样品至少需设置两个重复。</li>
		<li>将凝胶板垂直放入第一个含有运行溶液1的电泳槽（步骤2.2.1.1）中，确保凝胶板与玻璃槽壁平行，以获得均匀的迁移速度。</li>
		<li>当溶剂前沿到达第一个标记线时，取出薄层板，干燥后放入第二种溶液中。对第二和第三种展开溶液重复类似步骤；将薄层板置于溶液中，直至溶剂前沿到达薄层板顶端，然后取出并在室温下干燥1分钟。</li>
		<li>将平板放入硫酸铜溶液中放置7秒。取出平板，彻底干燥后，在170 °C下烘烤7分钟。待平板冷却。</li>
		<li>使用薄层色谱和凝胶分析软件以及图像处理软件，按照 Brogden 之前所述的方法进行扫描和分析 等23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高效液相色谱法（HPLC）定量胆固醇含量
	<ol>
		<li>将一根100 × 4.6 mm色谱柱连接至5 µm/4.6 mm保护柱芯，并加热至32 °C。以甲醇为流动相，流速为1 mL/min，压力为65 bar，采用在202 nm处检测的紫外检测器定量各样品中的胆固醇含量。</li>
		<li>在分析样品前，彻底清洗高效液相色谱仪，执行以下步骤：清洗泵、清洗进样针、冲洗样品瓶、排出注射器中的气泡，以及清洗泵的排空阀。所有步骤均用水清洗。最后，以5 mL/min的流速用甲醇进行系统排空5分钟。</li>
		<li>为建立胆固醇标准曲线，需在氯仿/甲醇（1:1）溶液中配制至少4个浓度梯度的胆固醇溶液，浓度范围为0.05 mg/mL至2 mg/mL24.</li>
		<li>将步骤 2.1.10 获得的样品重悬于 500 µL 氯仿/甲醇（1:1）中，置于带螺口红色聚四氟乙烯/白色硅胶盖的棕色 1.5 mL 玻璃瓶中。</li>
		<li>使用步骤 2.3.3 中制备的标准品定量胆固醇浓度。 
		注意：填写采样方案时，需至少包含一个标准品和一个阴性对照，随后为待测样本。</li>
		<li>以曲线下面积表示结果，并使用任意统计软件对适当样本进行比较。 
		注意：结果也可根据标准曲线进行定量，并以每毫升、每克或每细胞数的总胆固醇含量表示。标准曲线方程应使用步骤 2.3.3 中获得的数值计算得出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NETs 的可视化与定量分析
<ol>
	<li>中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的可视化 
	注意：NETs 的可视化基于 Neumann 之前发表的研究工作 等15.
	<ol>
		<li>用 200 µL 1x PBS 将步骤 1.3.8 中的固定样品洗涤 3 次。</li>
		<li>每孔加入100 µL含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS溶液，室温孵育45分钟，进行封闭和透化处理。</li>
		<li>加入100 µL一抗：小鼠单克隆抗DNA-组蛋白1抗体（用含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS将原液稀释至2.2 mg/mL，按1:5,000比例稀释）或抗髓过氧化物酶（MPO）多克隆抗体（兔抗MPO；用含2% BSA和0.2% Triton X-100的PBS按1:300比例稀释）。4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用 200 µL 的 1x PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>加入100 µL二抗（荧光标记的山羊抗小鼠抗体，1:1,000稀释于BSA-PBS-Triton X-100中；山羊抗兔抗体，1:1,000稀释于BSA-PBS-Triton X-100中），室温避光孵育1小时。</li>
		<li>用200 µL 1x PBS洗涤3次。</li>
		<li>用镊子取下盖玻片，将其有样本的一面朝下，置于含有3 µL含DAPI封片剂的载玻片上。</li>
		<li>使用配备 HCX PL APO 40X 0.75-1.25 油浸物镜的共聚焦倒置荧光显微镜观察样品15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NET释放细胞核的定量分析
	<ol>
		<li>打开图像处理软件（例如， ImageJ）并将感兴趣的图片拖放到工具栏中。</li>
		<li>点击 &#34;插件，&#34; &#34;分析，&#34; 和 &#34;细胞计数仪&#34;</li>
		<li>按压 &#34;初始化&#34; 计数器窗口中的按钮并选择计数器类型（例如， 单击红色的 7 选择释放 NET 的细胞，单击黄色的 8 选择不释放 NET 的细胞，如图所示 图 6B-i 和 ii). 
		注意：NET阳性细胞的判定标准：细胞核呈绿色阳性染色，且细胞核密度降低（失去分叶状结构）或细胞核圆形结构消失，同时伴随细胞核体积增大，或出现明显的细胞外突起。</li>
		<li>点击符合上述标准的每个细胞，并将计数的细胞数量记录到分析软件的数据表中。</li>
		<li>使用计数的NET释放细胞和非释放细胞的数量，计算NET释放细胞的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可用于通过高效薄层色谱（HPTLC）或高效液相色谱（HPLC）分析特定脂质（如胆固醇），并研究药理性脂质改变对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的影响（参见 Neumann et al.15）。
HPTLC 是一种相对经济且简单的方法，可用于分析大量样本中的多种脂质。该方法已广泛应用于多个研究领域，包括抗生素定量25、溶酶体贮积病中的脂质贮存26，以及上皮细胞中胆固醇和胆固醇葡萄糖苷水平的测定27。本文所述方法经过修改和优化，用于从纯化的中性粒细胞群体中分离脂质；然而，经过轻微调整后，该方法也可用于组织样本中的脂质提取（参见 Brogden et al.23）。利用该方法，可对脂质进行有效分离、鉴定，并以已知标准品为参照进行半定量分析。该方法中的一个关键步骤是使用指定名称的缓冲液，因为使用其他任何...

脂质已被证实在线粒体稳态、细胞死亡、宿主-病原体相互作用以及细胞因子释放中发挥重要作用1随着时间的推移，人们对脂质在宿主-病原体相互作用或炎症中作用的兴趣和认识不断增加，多项研究证实了某些脂质，尤其是类固醇胆固醇，在细胞应答中的核心作用。他汀类药物可通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）来阻断胆固醇的生物合成，其药理学治疗可通过降低血清中白细胞介素6和C反应蛋白水平而发挥抗炎作用。2富含胆固醇和糖鞘脂的结构可被多种病原体（如细菌和病毒）用作入侵宿主的门户3,4,5,6. 鞘脂类（例如， 鞘磷脂）已被证明可被病原体利用以增强其致病性7在巨噬细胞中，分枝杆菌利用富含胆固醇的膜区进入细胞；胆固醇的耗竭可抑制分枝杆菌的摄取8此外，用病原体感染巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌， 一种引起土拉菌病（又称兔热病）的人畜共患致病因子9，导致了一种感染，而当细胞膜中的胆固醇被耗竭后，该感染即被消除10同样，宿主细胞被入侵的过程由 大肠杆菌 通过富含脂质的结构的途径被证明依赖于胆固醇4此外， 鼠伤寒沙门氏菌 上皮细胞感染实验表明，胆固醇对病原体进入细胞至关重要11. 胆固醇耗竭抑制了沙门氏菌的摄取11此外，Gilk最近的一项研究 等. 证明了胆固醇在摄取过程中起着重要作用 Coxiella burnetii12此外，Tuong 等发现25-羟基胆固醇在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞的吞噬作用中发挥关键作用13当使用药物处理巨噬细胞以耗竭胆固醇时，吞噬作用减弱14因此，胆固醇及其他脂质在感染与炎症过程中似乎发挥着重要作用，因为其含量的降低可减少多种病原体入侵的风险。10,11,12.
最近，我们已能够证明脂质的改变，特别是细胞内胆固醇的耗竭，可诱导人外周血中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）15。自2004年发现NETs以来，研究已表明其在捕获细菌以及阻止感染扩散方面发挥着关键作用16,17。NETs由DNA骨架与组蛋白、蛋白酶及抗菌肽共同构成16。中性粒细胞释放NETs可由入侵的病原体18,19或化学物质（如佛波酯-豆蔻酸-乙酸盐（phorbol-myristate-acetate, PMA）或他汀类药物）所诱导16,20。然而，该过程的具体细胞机制，尤其是脂质在此过程中的作用，目前仍不完全清楚。对脂质的分析有助于更深入理解多种细胞过程及相互作用的机制，例如NETs的释放。胆固醇和鞘磷脂是细胞膜及脂质微区的重要组成成分，它们可增强膜的稳定性，并促进参与蛋白质转运和信号转导事件的蛋白质聚集21。为了研究特定脂质的机制性作用，可使用两亲性药理学试剂，例如环状寡糖甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD），在体外（in vitro）改变细胞的脂质组成并降低胆固醇水平15。本文介绍了一种利用高效薄层色谱法（HPTLC）分析中性粒细胞在MβCD处理后脂质组成变化的方法。同时采用高效液相色谱法（HPLC）检测中性粒细胞群体中胆固醇水平的变化。此外，我们还描述了一种通过免疫荧光显微镜观察人外周血中性粒细胞在MβCD刺激下形成NETs的方法。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;中性粒细胞分离、NET染色与定量&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Alexa Flour 633 山羊抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>抗MPO&amp;alpha;抗体</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer 改良计数板</td><td>Celeromics</td><td>MF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 TCS SP5 AOBS 带串联扫描仪</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td>用水稀释1:10以获得1x工作液</td></tr><tr><td>Dy Light 488标记的高度交叉吸附抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/组蛋白1抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>甲基-&amp;beta;-环糊精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>溶于水，加热至65 &amp;deg;C，并加入1 N NaOH至溶液澄清</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>储存液浓度为16 &amp;micro;M，溶于1x PBS中</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>含CaCl和Mg的HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>0.4%溶液</td></tr><tr><td>水</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>无内毒素</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;脂质分离与分析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 注射器</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &amp;micro;l</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Carl Roth</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)</td><td>Merck</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS 软件</td><td>Lazarsoftware</td><td>2.0</td><td></td></tr><tr><td>Chromolith HighResolution RP-18 封端柱 100-4.6 mm</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪 Chromaster</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>参数取决于具体HPLC仪器</td></tr><tr><td>HPLC紫外检测器</td><td>Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>HPLC色谱柱温箱</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>HPLC自动进样器</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC泵</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>研钵</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>HPTLC硅胶60板</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge plus 基础装置</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 细胞培养48孔板，平底</td><td>Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1198882</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD 结核菌素注射器 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

通过高效薄层色谱法（HPTLC）进行脂质分析是一种相对简单且成本较低的方法，可用于分析多种脂质。已有研究报道，脂质（例如在宿主-病原体相互作用或宿主细胞入侵过程中）在细胞过程中发挥着关键作用。本文介绍了一种利用HPTLC分析原代血液来源中性粒细胞中脂质组成（重点关注胆固醇水平）的方法，并与高效液相色谱法（HPLC）进行了比较。本研究旨在探讨脂质/胆固醇变化在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成过程中的作用。NET的释放是一种宿主防御机制，可阻止病原体在宿主体内扩散。因此，使用甲基-β-环糊精（MβCD）处理血液来源的人中性粒细胞，以诱导细胞内脂质改变。通过HPTLC和HPLC分析表明，MβCD处理可导致细胞脂质发生改变，并显著降低细胞内胆固醇含量。同时，免疫荧光显微镜结果显示，MβCD处理中性粒细胞可诱导NET的形成。综上所述，本文提供了一种详细的研究中性粒细胞脂质改变及NET形成的实验方法。

通过密度梯度离心法分离人外周血来源的中性粒细胞（图2）。为研究脂质改变对中性粒细胞的影响，使用10 mM MβCD处理细胞，以耗竭细胞内的胆固醇。随后，按照Brogden 等23描述的方法，采用Bligh和Dyer法从样品中提取脂质（图1，左图）。将制备好的脂质样品点样于硅胶HPTLC板上，并采用三相溶剂系统进行展开，该系统已优化以分离和可视化多种脂质，包括胆固醇、胆固醇酯、鞘磷脂、磷脂、三酰甘油、游离脂肪酸、单酰甘油、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱（图3A）。该方法无法检测胆固醇的氧化衍生物（氧固醇）。另采用高效液相色谱法（HPLC）对胆固醇进行定量分析（图3B）。在定量分析中，HPLC测定胆固醇的回归值显著优于HPTLC（图4A 与 图4B 对比）。为可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs...

已知脂质在细胞功能中发挥重要作用。本文介绍一种通过高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）分析中性粒细胞脂质组成的方法，重点检测胆固醇水平，以更深入理解中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制。

通过高效薄层色谱法（HPTLC）进行脂质分析是一种相对简单且成本效益较高的方法，可用于分析多种多样的……

本方法的总体目标是通过薄层色谱和高效液相色谱技术，研究中性粒细胞在释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）过程中脂质组成的变化。该方法可用于更深入地了解参与中性粒细胞胞外诱捕网形成（简称NET形成）的相关机制。该实验流程的主要优势在于，通过易于操作的标准化方案，提供有关脂质在中性粒细胞整体功能中所起作用的信息。人血源性细胞的分离将由本实验室前博士生Ariane Neumann演示，Friederike Reuner将协助她完成。用于脂质分析的细胞制备将由本实验室博士后Graham Brogden以及生物化学专业硕士研究生Diab Husein进行演示。为分离人血液来源的中性粒细胞，需在火焰附近将约20 mL血液缓慢铺加到20 mL泛影葡胺/右旋糖酐溶液上，切勿混合。以470 × g离心30分钟，禁止使用刹车。关键在于避免血液相与密度梯度溶液相混合。离心步骤完成后，需小心移除单个核细胞，以避免细胞污染或非特异性激活。去除单个核细胞及淡黄色的血浆层。将多形核细胞（PMN）层转移至新的50 mL离心管中，并用1×磷酸盐缓冲液补至50 mL。以470 × g离心样品10分钟，开启制动。随后，弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL无菌水中，涡旋5秒以裂解红细胞。立即用1× PBS将离心管补至50 mL，再次离心样品。吸除上清液后，沉淀应呈白色。如果仍为红色，需重复上述步骤。然后将沉淀重悬于 1000 µL 的罗斯韦尔帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，简称 RPMI）培养基中。使用台盼蓝染色法并在光学显微镜下用血细胞计数板计数细胞数量。用RPMI将细胞重悬，配制成浓度为每毫升两百万个细胞的细胞悬液。从20 mL血液中大约可收获2500万个中性粒细胞。进行脂质分析的药理学处理时，使用已制备的1500万个中性粒细胞。将样品置于反应管中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。样品离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于300微升HBSS中。使用相同参数再次离心样品后，将细胞沉淀重悬于1 mL氯仿:甲醇（1:1）溶液中。然后使用26号针头，通过将样品在1 mL注射器中推入和推出10次，使重悬的沉淀充分匀浆。为从人外周血来源的中性粒细胞中分离脂质，取制备好的中性粒细胞并置于冰上。用移液器将中性粒细胞转移至一支带有聚四氟乙烯密封垫的15 mL螺口玻璃管中，振荡1分钟以匀浆化。随后加入2 mL甲醇，1分钟后加入1 mL氯仿。再次振荡1分钟后，将玻璃管在室温下以50 rpm转速旋转30分钟。接下来，将溶液在 7 摄氏度、1,952 ×g 条件下离心 10 分钟，以沉淀蛋白质组分。小心地将上清液倾入新的 15 mL 玻璃螺口管中，留下含有蛋白质的沉淀物。将沉淀物于 20 摄氏度保存，用于后续定量

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

方法来研究中性粒细胞脂质的改变和中性粒细胞胞外陷阱随后形成

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

我们描述了从全血中分离犬中性粒细胞的方法，并利用荧光显微镜观察活体中性粒细胞中NET的形成。同时还介绍了使用免疫荧光显微镜定量NET形成及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）表达的实验方案。...

体外 犬中性粒细胞胞外诱捕网形成：基于荧光显微镜的动态与定量分析

本方案描述了一种高灵敏度、高通量的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测方法，可通过免疫荧光三维共聚焦显微镜对离体NET的形成进行半自动定量分析。该方案可用于评估不同刺激条件下NET的形成与降解过程，并可用于研究潜在的靶向NET治疗策略。...

一种用于评估和定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的高通量检测方法

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外...

由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。...

实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

本文描述了一系列方法，包括从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）、将HL-60细胞分化为类似中性粒细胞的细胞、在LDL存在条件下制备中性粒细胞胞外陷阱（NETs），以及用NETs与LDL的混合物刺激人主动脉内皮细胞。...

低密度脂蛋白存在下利用中性粒细胞胞外诱捕网刺激血管内皮细胞

低密度中性粒细胞（LDN）在多种疾病中显著增加。通常通过细胞分选来分离LDN。本文介绍一种获取高纯度且具有活性的LDN的实用方法。外周血经密度梯度离心后，细胞与磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN。...

快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

了解中性粒细胞脂质组成分析方法，使用HPTLC和HPLC技术研究NET形成机制。该方法通过人血来源中性粒细胞分离与脂质分析，为免疫学研究提供实用方案。

研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

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