研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

本方法的总体目标是通过薄层色谱和高效液相色谱技术，研究中性粒细胞在释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）过程中脂质组成的变化。该方法可用于更深入地了解参与中性粒细胞胞外诱捕网形成（简称NET形成）的相关机制。该实验流程的主要优势在于，通过易于操作的标准化方案，提供有关脂质在中性粒细胞整体功能中所起作用的信息。

人血源性细胞的分离将由本实验室前博士生Ariane Neumann演示，Friederike Reuner将协助她完成。用于脂质分析的细胞制备将由本实验室博士后Graham Brogden以及生物化学专业硕士研究生Diab Husein进行演示。

为分离人血液来源的中性粒细胞，需在火焰附近将约20 mL血液缓慢铺加到20 mL泛影葡胺/右旋糖酐溶液上，切勿混合。以470 × g离心30分钟，禁止使用刹车。关键在于避免血液相与密度梯度溶液相混合。

离心步骤完成后，需小心移除单个核细胞，以避免细胞污染或非特异性激活。去除单个核细胞及淡黄色的血浆层。将多形核细胞（PMN）层转移至新的50 mL离心管中，并用1×磷酸盐缓冲液补至50 mL。

以470 × g离心样品10分钟，开启制动。随后，弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL无菌水中，涡旋5秒以裂解红细胞。立即用1× PBS将离心管补至50 mL，再次离心样品。

吸除上清液后，沉淀应呈白色。如果仍为红色，需重复上述步骤。然后将沉淀重悬于 1000 µL 的罗斯韦尔帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，简称 RPMI）培养基中。

使用台盼蓝染色法并在光学显微镜下用血细胞计数板计数细胞数量。用RPMI将细胞重悬，配制成浓度为每毫升两百万个细胞的细胞悬液。从20 mL血液中大约可收获2500万个中性粒细胞。

进行脂质分析的药理学处理时，使用已制备的1500万个中性粒细胞。将样品置于反应管中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。样品离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于300微升HBSS中。

使用相同参数再次离心样品后，将细胞沉淀重悬于1 mL氯仿:甲醇（1:1）溶液中。然后使用26号针头，通过将样品在1 mL注射器中推入和推出10次，使重悬的沉淀充分匀浆。为从人外周血来源的中性粒细胞中分离脂质，取制备好的中性粒细胞并置于冰上。

用移液器将中性粒细胞转移至一支带有聚四氟乙烯密封垫的15 mL螺口玻璃管中，振荡1分钟以匀浆化。随后加入2 mL甲醇，1分钟后加入1 mL氯仿。再次振荡1分钟后，将玻璃管在室温下以50 rpm转速旋转30分钟。

接下来，将溶液在 7 摄氏度、1,952 ×g 条件下离心 10 分钟，以沉淀蛋白质组分。小心地将上清液倾入新的 15 mL 玻璃螺口管中，留下含有蛋白质的沉淀物。将沉淀物于 20 摄氏度保存，用于后续定量分析。

加入 1 mL 氯仿，静置 1 分钟。然后加入 1 mL 双蒸水，将装有样品的玻璃螺旋盖管颠倒混合 30 秒。按之前方法离心样品后，移除并弃去上层液相，至但不包括乳白色层。

将样品在60摄氏度的真空浓缩仪中干燥，并在20摄氏度下保存直至使用。开始时，将每种溶液最多5 mL加入相应的玻璃室中。在每个室中加入任意类型的滤纸以提高运行速度。

将一块20×10 cm的HPTLC硅胶60玻璃板预先在第一种展开剂中预平衡。当展开剂升至板的顶端后，在110摄氏度下干燥10分钟。将之前经真空浓缩仪干燥后获得的脂质沉淀溶解于所需体积的1:1氯仿:甲醇溶液中，并在37摄氏度孵育15分钟以充分溶解。

接下来，使用直尺和软铅笔标记所需数量的样品点样位置，并至少留出一个标准品的位置。对于第一种电泳液，标记约 4 cm 的电泳距离；对于第二种电泳液，标记约 6 cm 的电泳距离。加样时，在加载每个新样品前，先用 1:1 的氯仿:甲醇溶液冲洗 10 微升注射器三次。

逐滴加入10微升每种样品，尽量将样品集中于尽可能小的区域。将板垂直放入第一个含有运行液一的 chamber 中。确保板与玻璃 chamber 的壁面平行，以获得均匀的迁移速度。

注意将薄层色谱板平行放置于玻璃展开室的后壁，并确保溶剂前沿不要展开过远，以保证脂质有效分离。当溶剂线到达第一个标记时，取出板子，干燥后将其放入第二种展开剂中。对第二和第三种展开剂重复类似步骤。

将板留在溶液中，直至溶剂前沿到达板的顶部。然后取出板，在室温下干燥一分钟。将板放入硫酸铜溶液中七秒钟。

将平板彻底干燥后，在170摄氏度的烘箱中烘烤7分钟。从烘箱中取出平板，使其冷却。进行高效液相色谱（HPLC）时，将色谱柱连接到仪器的保护柱上，并加热至32摄氏度。

以甲醇作为流动相，流速为每分钟1 mL，压力为65 bar。将紫外检测器设置为在202纳米波长下检测，以定量各样品中的胆固醇含量。在分析样品前，需彻底清洗高效液相色谱仪，并按照文本方案中所述建立胆固醇标准曲线。

最后，将样品重新悬浮于500 µL的1:1氯仿:甲醇溶液中，置于带红色PTFE/白色硅胶螺旋盖的琥珀色1.5 mL玻璃瓶中，然后上样至HPLC仪器。图中显示的是中性粒细胞在HPTLC板上的脂质谱型。通过将迁移距离与标准品比较，可对脂质进行鉴定。

图中还显示了一个HPLC色谱图，其中有两个较大的峰。位于两分钟前的第一个峰是氯仿。位于五分钟处的第二个大峰是胆固醇。

图中显示了通过高效液相色谱法（HPLC）和高效薄层色谱法（HPTLC）测定的胆固醇标准曲线。与HPTLC标准曲线相比，HPLC获得的标准曲线在更宽的浓度范围内呈线性。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离人血液来源的中性粒细胞，并进一步分析其脂质组成。

进行此操作时，务必记住佩戴腈手套，以保护双手免受有害的氯仿:甲醇暴露，并且应在通风橱中操作。未来的实验将提供有关中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成机制及中性粒细胞一般功能的进一步信息，而这些机制目前尚未完全阐明。请勿忘记，使用人原代血液来源细胞进行实验需获得伦理许可，并采取适当的安全防护措施，例如在相应的生物安全实验室中操作，以避免暴露于人类病原体的风险。

最后，我们研究的目的是基于先天免疫系统寻找抗感染治疗的新靶点，特别是脂质组成对我们而言非常有意义，因为它将帮助我们理解中性粒细胞为何在感染过程中发挥抗菌作用。