Name: 工具来研究蛋白质建筑HMGB1的作用，螺旋窜改，站点特定的DNA间交联处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 了解利用改良染色质免疫共沉淀和DNA超螺旋实验研究HMGB1等蛋白质在特定位点DNA损伤处的结合及其拓扑修饰的方法。该技术有助于揭示DNA损伤修复机制并发现癌症治疗新靶点。

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作者感谢Vasquez实验室成员提供的有益讨论。本工作由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 [CA097175，CA093279 致 K.M.V.] 以及德克萨斯州癌症预防与研究研究所 [RP101501] 提供资助。开放获取费用资助来源：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 [CA093279 致 K.M.V.]。

1. 质粒底物上TFO导向ICL的制备
<ol>
	<li>在琥珀色离心管中，将等摩尔量的质粒 pSupFG110,11 DNA（5 µg 质粒 DNA 是一个合适的起始量）与补骨脂素偶联的 TFO AG30 在 8 µl 三链结合缓冲液 [50% 甘油，10 mM Tris (pH 7.6)，10 mM MgCl2] 和 dH2O 中混合，总体积为 40 µl。通过上下吹打充分混匀。将反应体系置于 37 °C 水浴中孵育 12 小时。</li>
	<li>预热 UVA 灯以确保其达到最大输出功率。将三链反应液置于石蜡膜上，并将石蜡膜放置在冰上，置于 UVA（365 nM）灯下。在灯与反应液之间放置一片 Mylar 滤光片。</li>
	<li>进行 UVA 照射，总剂量为 1.8 J/cm2。照射后将样品于 4 °C 保存以备后续使用。 
	注意：进行 UVA 照射时需佩戴适当的护目镜并穿着防护服。</li>
	<li>使用限制性内切酶 EcoR1 在 20 µl 总体积中线性化 200 ng 上述制备的质粒，反应体系中包含厂家提供的 10x 缓冲液。在 65 °C 加热 20 分钟以灭活酶。在 10,000 x g 离心 10 分钟后，将样品于 4 °C 保存。</li>
	<li>配制 50x 碱性缓冲液 [1.5 M NaOH，50 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)]。将 0.5 mg 琼脂糖加入 50 ml dH2O 中，煮沸至完全溶解，随后置于 50 °C 水浴中保温。</li>
	<li>待溶解的琼脂糖温度降至 50 °C 后，加入 1 ml 50x 碱性缓冲液，混匀后将凝胶倒入制胶槽中。在使用前于室温下静置，使凝胶充分凝固。</li>
	<li>向 20 µl 线性化 DNA 样品中加入 4 µl 0.5 M EDTA，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>向样品及 1 kb DNA ladder 中加入 6x 碱性凝胶上样缓冲液（300 mM NaOH，6 mM EDTA，18% (w/v) 高分子量多糖，0.06% 溴酚蓝溶于 dH2O 中）。 
	注意：必须使用 6x 碱性凝胶上样缓冲液，详见讨论部分。</li>
	<li>在低温室中将样品上样至凝胶，并在 1x 碱性缓冲液中以每厘米 3.2 伏特的电压电泳过夜（12–16 小时）。样品进入凝胶后，将玻璃板置于凝胶上方以防止其漂浮。</li>
	<li>将凝胶在中和缓冲液 [1 M Tris-Cl (pH 7.6)，1.5 M NaCl，3 M 醋酸钠 (pH 5.2)] 中浸泡 45 分钟，于室温下进行中和处理。</li>
	<li>在 50 ml 水中加入 4 µl 1% 溴化乙锭（EtBr），于室温下染色 1 小时。随后用清水脱色 15 分钟。使用成像系统观察 DNA。 
	注意：EtBr 为强效诱变剂，可经皮肤吸收。避免与 EtBr 直接接触。</li>
</ol>
2. 在人源细胞中转染含TFO导向ICL的质粒并进行免疫沉淀
<ol>
	<li>接种400,000个哺乳动物细胞（例如， 每60 mm培养皿中接种U2OS骨肉瘤细胞，置于添加10%胎牛血清（FBS）但不含抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，转染前培养24小时。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2.</li>
	<li>转染前，将培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）在水浴中预热至 37 °C。将转染试剂恢复至室温。</li>
	<li>将30 µl转染试剂与500 µl 1x生长培养基混合（混合物1），另将2 µg TFO导向的含ICL质粒溶于500 µl 1x生长培养基中（混合物2），分别置于14 ml圆底试管中，室温孵育10分钟。</li>
	<li>将混合液1加入混合液2中，用移液器上下吹打充分混匀。室温孵育25-30分钟。</li>
	<li>用预热的 PBS 洗涤细胞两次。将转染混合物逐滴加入，均匀分布于细胞培养板中。向培养板中加入 1 ml 生长培养基，使最终体积达到 2 ml。充分混匀。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。2 4小时</li>
	<li>更换为 3 ml 添加 10% FBS 的生长培养基，继续培养 16 小时。不要使用抗生素。</li>
	<li>每孔加入80 µl 37%新鲜甲醛，使终浓度约为1%，室温避光孵育10分钟。 
	注意：甲醛具有毒性，应根据其安全说明书进行操作。接触甲醛可能对皮肤、眼睛和呼吸道造成伤害。</li>
	<li>通过每孔加入300 µl预冷的甘氨酸（ commercially available kits 中提供）以终止甲醛交联反应，孵育5分钟。吸除培养基，用预冷的PBS洗涤两次，然后在1 ml预冷（4 °C）PBS中用刮棒刮下细胞，收集至微量离心管中。所有操作过程中样品均需置于冰上。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用台式冷冻离心机以13,400 x g离心5 min制备细胞沉淀。用移液器吸除上清液，将细胞沉淀置于冰上。</li>
	<li>将沉淀物在1 ml预冷（4 °C）的缓冲液A（商业试剂盒中提供）中均匀重悬，冰上孵育10分钟。通过倒置离心管偶尔混匀。按前述方法离心收集细胞（见上述步骤2.9）。</li>
	<li>将沉淀物在1 ml预冷（4 °C）的缓冲液B（商业试剂盒中提供）中均匀重悬，冰上孵育10分钟，期间偶尔通过倒置混匀。离心收集细胞沉淀（同前，参见步骤2.9）。</li>
	<li>再次将细胞重悬于200 µl预冷的缓冲液B中。加入2 µl微球菌核酸酶（MNase），室温孵育10分钟。通过轻弹管壁间歇混匀反应液。将反应管置于冰上并加入EDTA至终浓度40 mM，以终止MNase反应。按前述方法离心收集细胞（见上述步骤2.9）。</li>
	<li>用含有蛋白酶抑制剂混合物的100 µl 1×染色质免疫沉淀缓冲液（ChIP缓冲液， commercially available kits中提供）重悬细胞。</li>
	<li>将重悬的细胞置于薄壁微量离心管中。将样品置于水浴超声仪中，超声处理20秒，随后冰上孵育20秒。重复此超声步骤9次，以获得约800–1,200 bp的片段。
	<ol>
		<li>向20 µl超声处理的样品中加入3 µl 5 M NaCl和1 µl RNase A。涡旋充分混匀，37 °C孵育30分钟。随后加入2 µl蛋白酶K，65 °C孵育2小时。使用PCR纯化试剂盒纯化样品。将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭（EtBr）显影。 
		注意：所得 DNA 的最大强度应位于或低于 1,000 bp 处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在三个独立的离心管中，分别加入30 µl裂解液至预冷的硅化管中，随后加入70 µl含有蛋白酶抑制剂的预冷1×ChIP缓冲液。向各管中分别加入1 µg抗免疫球蛋白G（IgG）抗体、抗组蛋白H3抗体（作为阳性对照）或抗HMGB1抗体。在4°C冰箱中持续旋转孵育过夜。</li>
	<li>在冷室中将蛋白G磁珠充分重悬。每管加入4 µl蛋白G磁珠，于冷室中旋转孵育额外2-4小时。</li>
	<li>使用磁力架收集珠子并弃去上清液。向沉淀中加入200 µl 1× ChIP缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物），在低温室中旋转孵育5分钟进行洗涤。重复洗涤两次。</li>
	<li>用高盐 1x ChIP 缓冲液（含 70 mM NaCl）再洗涤一次。</li>
	<li>用160 µl洗脱缓冲液（ commercially available kits 中提供）重悬沉淀，37 °C旋转孵育30 min。</li>
	<li>离心沉淀珠子，并将上清液转移至新管中。加入6 µl 5 M NaCl和2 µl蛋白酶K，于65 °C孵育过夜。</li>
	<li>使用PCR产物纯化试剂盒纯化DNA，并用50 µl dH₂O洗脱DNA2O.</li>
	<li>进行PCR16 使用针对目标区域的引物组进行反应，并将产物在含溴化乙锭（EtBr）染色的1%琼脂糖凝胶上电泳分离。</li>
</ol>
3. 超螺旋实验与二维琼脂糖凝胶电泳
<ol>
	<li>配制DNA修复合成缓冲液（45 mM Hepes-KOH，pH 7.8；70 mM KCl；7.4 mM MgCl2；0.9 mM DTT；0.4 mM EDTA；2 mM ATP，20 µM dNTPs，3.4%甘油和18 µg牛血清白蛋白）。于-80 °C保存。使用前在冰上解冻，并加入40 mM磷酸肌酸和2.5 µg肌酸磷酸激酶。</li>
	<li>配制10×超螺旋缓冲液[500 mM Tris（pH 8.0），500 mM NaCl，25 mM MgCl2，1 mM EDTA]，室温保存。</li>
	<li>在10 µl反应体系中，使用1 µl Vaccinia拓扑异构酶I（5–15 U/µl）和1×超螺旋缓冲液，将300 ng超螺旋质粒pSupFG1 DNA完全线性化。37 °C孵育1小时。</li>
	<li>在冰上解冻HeLa无细胞提取物24。向完全松弛的质粒中加入25 µl HeLa无细胞提取物和DNA修复合成缓冲液，充分混匀。再向混合物中加入额外的1 µl Vaccinia拓扑异构酶I，37 °C孵育1小时。</li>
	<li>通过加入十二烷基硫酸钠（SDS）（终浓度1%）和蛋白酶K（终浓度0.25 mg/ml）终止反应。65 °C孵育2小时。</li>
	<li>用1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液制备1%琼脂糖凝胶。加入DNA上样染料，将反应产物直接上样至凝胶，各泳道之间至少间隔4个泳道。在室温下，以1×TBE缓冲液（第一维电泳）在2 V/cm电压下电泳8–10小时，以分离拓扑异构体。 
	注意：在1 L dH2O中加入54 g Tris碱、27.5 g硼酸和20 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），配制5×TBE储存液。</li>
	<li>用含3 µg/ml氯喹-磷酸盐的1×TBE缓冲液配制2 L溶液。将凝胶浸入200 ml该溶液中20分钟。用铝箔覆盖凝胶托盘。</li>
	<li>进行第二维电泳时，将凝胶顺时针旋转90°，在含氯喹的1×TBE缓冲液中以2 V/cm电压电泳4–6小时，以分离正超螺旋和负超螺旋。</li>
	<li>将凝胶在摇床上用溴化乙锭（EtBr）染色1小时，然后用dH2O脱色15分钟，随后使用成像仪观察拓扑异构体的热分布情况。</li>
</ol>

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<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

TFO导向的ICL高效形成依赖于两个关键因素：第一，适当的缓冲液成分（例如，MgCl2）以及TFO与其靶DNA底物孵育的时间（取决于TFO与其靶双链的结合亲和力及所用浓度）；第二，适当的UVA（365 nm）照射剂量，以高效形成补骨脂素交联。通过使用HPLC或凝胶纯化的TFO可实现最佳的三链结构形成。TFO中的杂质可能产生非预期的交联产物，从而进一步复杂化实验结果。为提高共价连接5'-HMT补骨脂素的TFO的稳定性，应将TFO分装后保存于-80 °C，因为反复冻融可能导致寡核苷酸降解。在三链结构形成后，将补骨脂素靶向至特定位点（例如，5'-TA-3'和5'-AT-3'是补骨脂素交联的优选位点），补骨脂素ICL的形成需要UVA照射。体外实验中，1.8 J/cm2的UVA剂量足以在质粒上实现ICL的最佳形成。照射时间应通过光度计测定确定。根据UVA灯源的不同，除了在365 nm发射紫外线外，灯源还可能发射较短波长的光，这可能导致在整个DNA骨架中产生非预期的DNA损伤。由于TFO导向的含ICL质粒将用于研究特定位置ICL的DNA修复，此类非预期...

三链体形成寡核苷酸（TFOs）通过Hoogsteen氢键以序列特异性方式结合双链DNA，形成三链螺旋结构1-5。三链体技术已被用于研究多种生物分子机制，例如转录、DNA损伤修复和基因靶向（参见文献6-8的综述）。TFOs已被广泛用于在报告质粒上诱导位点特异性损伤9,10。我们实验室及其他研究团队此前曾使用与补骨脂素分子连接的TFO（AG30），在质粒pSupFG1的supF基因上诱导位点特异性的DNA链间交联（ICLs）5,10-12。ICLs具有高度细胞毒性，因为这类损伤通过共价键将两条DNA链交联在一起，若未被修复，可阻断基因转录并阻碍DNA复制机器的运行13,14。由于其细胞毒性潜力，诱导ICLs的试剂已被用作治疗癌症及其他疾病的化疗药物15。然而，人类细胞中ICLs的加工与修复机制尚不明确。因此，更深入地理解人类细胞中ICLs加工涉及的机制，可能有助于提高基于ICLs的化疗方案的疗效。TFO诱导的ICLs及其修复中间产物可能导致DNA双螺旋结构发生显著畸变。此类结构畸变很可能成为结构调控蛋白的靶标，这些蛋白对畸变DNA的结合亲和力高于对标准B型双螺旋DNA的结合亲和力16-20。在此，我们通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，在补骨脂素交联的质粒上研究了在人类细胞中一种丰度极高的结构调控蛋白HMGB1与ICLs的关联，并在人源癌细胞裂解液中鉴定出HMGB1在调控补骨脂素交联质粒DNA拓扑结构中的作用。
HMGB1 是一种丰度极高的非组蛋白结构蛋白，广泛表达于各类细胞中，其与损伤DNA及非典型结构DNA底物的结合亲和力高于经典的B型DNA。17-20HMGB1 参与多种 DNA 代谢过程，如转录、DNA 复制和 DNA 修复16,21-23我们先前已证明，HMGB1 能够结合 TFO 定向的 ICLs 体外 高亲和力20此外，我们证明了HMGB1的缺失会增加TFO导向的ICLs的致突变性加工，并将HMGB1鉴定为核苷酸切除修复（NER）的辅助因子。23,24最近，我们发现HMGB1与人类细胞中TFO导向的ICL相关，且其向此类损伤位点的招募依赖于NER蛋白XPA16DNA的负超螺旋已被证明可促进核苷酸切除修复（NER）对DNA损伤的有效清除25，我们发现HMGB1优先诱导TFO导向的含ICL质粒底物产生负超螺旋（相对于无损伤的质粒底物）16，有助于更深入地理解HMGB1作为核苷酸切除修复（NER）协同因子的潜在作用。目前，人类细胞中对DNA交联损伤（ICLs）的修复机制尚未完全阐明；因此，基于本文所述分子工具所开发的技术与检测方法，有望鉴定出更多参与ICL修复的蛋白质，这些蛋白质可能成为药理学干预的靶点，从而被用于提升癌症化疗方案的疗效。
本文讨论了一种通过变性琼脂糖凝胶电泳有效评估TFO导向的质粒DNA中ICL形成的效率的方法。此外，利用含有TFO导向ICL的质粒，描述了采用改良的ChIP检测技术，在细胞环境中确定HMGB1与ICL损伤质粒结合的方法。另外，通过二维琼脂糖凝胶电泳进行超螺旋实验，建立了一种简便的方法，用于研究结构蛋白HMGB1在人细胞裂解液中对ICL损伤质粒底物引入的拓扑学改变。所述技术可用于进一步理解DNA修复蛋白和结构蛋白在人细胞中对质粒上靶向DNA损伤处理过程中的作用。
我们描述了在质粒DNA上形成TFO导向的位点特异性补骨脂素交联（ICL）的详细方案，以及后续的质粒染色质免疫沉淀（ChIP）和超螺旋检测方法，分别用于鉴定与这些损伤位点结合的蛋白质以及改变DNA拓扑结构的蛋白质。这些检测方法可进行修改，以适用于其他DNA损伤剂、TFO、质粒底物以及感兴趣的哺乳动物细胞系。事实上，我们已证明在人类基因组中每个注释基因内至少存在一个潜在的、独特的高亲和力TFO结合位点26。然而，为清晰起见，本文以我们在Mukherjee &amp;#38; Vasquez, 201616中所采用的实验体系为例进行说明：即在人U2OS细胞中，使用特定的补骨脂素偶联TFO（pAG30）作用于特定的突变报告质粒（pSupFG1）。

<table><tbody><tr><td>5'HMT 补骨脂素-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>定制订单</td><td>经 HPLC（或凝胶）纯化</td></tr><tr><td>Simple ChIP 酶法染色质免疫沉淀试剂盒</td><td>Cell Signaling Inc.</td><td>9003</td><td>制造商推荐方案针对染色质免疫沉淀优化，不适用于质粒免疫沉淀。对照 IgG 和 H3 抗体、Protein G 磁珠及微球菌核酸酶均由制造商提供。</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR 预混液</td></tr><tr><td>HMGB1 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>氯喹二磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>用于二维琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER 转染试剂</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>痘苗病毒拓扑异构酶 I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray 长波紫外灯</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA 灯</td></tr><tr><td>EpiSonic 多功能生物处理器 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>水浴超声仪</td></tr><tr><td>聚酯薄膜滤膜（Mylar 滤膜）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80112939</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ 系统</td><td>DNA 成像系统</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>用于交联&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA 上样染料</td></tr><tr><td>硅化管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>低吸附微量离心管</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>光度计</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA 剂量测定</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人 U2OS 骨肉瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>根据供应商建议进行培养&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>人宫颈腺癌 HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>根据供应商建议进行培养&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>近端正向引物</td><td>5&amp;prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>近端反向引物</td><td>5&amp;prime;-tag tta acc gga taa ggc gcag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>远端正向引物</td><td>5&amp;prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>远端反向引物</td><td>5&amp;prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

研究结构蛋白hmgb1在螺旋扭曲、位点特异性dna链间交联加工中作用的工具

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种非组蛋白的结构蛋白，在调控基因组的多种重要功能中发挥关键作用，如转录、DNA复制和DNA修复。HMGB1对结构发生畸变的DNA的结合亲和力高于对标准B型DNA的结合亲和力。例如，我们发现HMGB1能够结合DNA链间交联（ICLs），这种交联通过共价连接DNA双链，导致螺旋结构畸变，若未被修复，则可能引发细胞死亡。由于ICL具有细胞毒性潜力，目前临床上已有多种可诱导ICL形成的试剂被用作化疗药物。尽管形成ICL的试剂对某些特定碱基序列具有偏好性（例如， 5'-TA-3' 是补骨脂素（psoralen）优先交联的位点，但其诱导的DNA损伤通常缺乏特异性。然而，若将可诱导DNA链间交联（ICL）的试剂共价连接至可形成三链结构的寡核苷酸（TFO），由于TFO能够以序列特异性方式结合DNA，则可实现靶向性的DNA损伤。本文中，我们使用一种在5'端共价连接了4'-羟甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素（HMT）的TFO，在突变报告质粒上产生位点特异性的ICL，作为研究HMGB1在人细胞中对复杂DNA损伤进行结构修饰、加工及修复的工具。我们描述了在报告质粒上制备TFO导向的ICL的实验技术，并利用染色质免疫沉淀实验，在细胞环境中检测HMGB1与TFO导向ICL的结合情况。此外，我们还介绍了DNA超螺旋实验，通过测量HMGB1在补骨脂素交联的质粒上引入的超螺旋匝数，评估受损DNA的特异性结构修饰。这些技术可用于研究其他蛋白质在任何目标细胞系中对TFO导向ICL或其他靶向DNA损伤的加工与修复过程中的作用。

TFO介导的ICL的形成对于基于质粒的检测至关重要，该检测用于研究结构蛋白在人类细胞ICL加工过程中的作用。变性琼脂糖凝胶电泳是一种简便的方法，可用于测定TFO介导的ICL形成的效率。含有TFO介导ICL的质粒在琼脂糖凝胶基质中的迁移速度较慢（图1A，第3道），而未交联的对照质粒则迁移较快（图1A，第2道）。对第2道和第3道条带进行密度计量分析（图1A）显示，约70%的质粒群体迁移速度减慢（以黑色箭头标示），表明这些质粒上已形成TFO介导的ICL。
对转染了对照质粒（P）或含有靶向TFO的ICL质粒（P-ICL）的人类U2OS细胞提取物进行染色质免疫沉淀实验，结果显示，在使用抗HMGB1抗体进行免疫沉淀时，与对照区域（P）相比，P-ICL区域HMGB1富集增加（图2，上图，第2和第3泳道）。这些结果表明HMGB1在人类...

通过将DNA损伤剂连接至三链形成寡核苷酸（TFO），可实现靶向的DNA损伤。利用经修饰的TFO，结合本文所述的染色质免疫沉淀分析和DNA超螺旋分析方法，可在人细胞中研究DNA损伤特异性蛋白结合及DNA拓扑结构的改变。

研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种非组蛋白的结构蛋白，在调控基因组多种重要功能中发挥重要作用，……

改进的染色质免疫沉淀和DNA超螺旋实验的总体目标是研究在人类细胞中，由化疗或致癌剂诱导的位点特异性DNA损伤位点上，结构蛋白所引起的结合及其后续拓扑学改变。该方法将有助于我们解答有关DNA损伤与修复的关键问题，从而推动发现癌症治疗中新的药理学靶点。我们的技术能够实现位点特异性DNA损伤的定向诱导，并有助于评估与人类癌症相关的关键DNA修复过程。转染前24小时，将400,000个哺乳动物细胞接种至每60毫米培养皿中，培养基为添加10% FBS但不含抗生素的DMEM。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。在14毫升圆底试管中，将30微升室温转染试剂与500微升已预热至37°C的1×生长培养基混合。在另一个离心管中，将两微克含有TFO导向交联剂的质粒加入500微升1倍生长培养基中。将离心管在室温下孵育10分钟。将混合物一与混合物二混合，并用移液器吹打数次以充分混匀。然后在室温下孵育溶液25至30分钟。接着用预热的PBS洗涤细胞两次。随后以逐滴加入的方式添加转染混合液，使溶液均匀分布于细胞培养板中。向培养板中加入一毫升培养基，使最终体积达到两毫升。充分混匀后，将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下。四小时后，更换为三毫升含10%FBS的培养基，继续孵育16小时。孵育后，每孔加入80微升新鲜的37%甲醛，于室温避光孵育10分钟。每孔加入300微升预冷的甘氨酸，以终止甲醛交联反应，并孵育5分钟。随后吸除培养基，用预冷的PBS洗涤细胞两次。接着，加入一毫升预冷的 PBS 后，将细胞在冰上用刮棒收集至微量离心管中，全程保持样品处于冰上。通过在 4°C 条件下以 13,400 × g 离心 5 分钟制备细胞沉淀。然后弃去上清液，将沉淀置于冰上。用 1 毫升预冷的缓冲液 A 均匀重悬沉淀，冰上孵育 10 分钟。然后，同前法离心收集细胞。接着，用 1 毫升预冷的缓冲液 B 均匀重悬沉淀，冰上孵育 10 分钟，期间通过倒置管子轻轻混匀数次。然后像之前一样将细胞离心成沉淀。再次用200 µL预冷的缓冲液B重悬细胞后，加入2 µL微球菌核酸酶（MNase），在室温下孵育反应10分钟。接着，将反应管置于冰上以终止MNase反应，并加入40 mM EDTA。微球菌核酸酶的消化程度非常关键，因为消化过度可能导致信号丢失，而消化不足则可能导致大量非特异性背景。将细胞离心沉淀后，用100 µL染色质免疫沉淀（ChIP）缓冲液重悬沉淀，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂混合物。然后，将细胞悬液转移至薄壁微量离心管中。将样品置于水浴超声仪中进行超声处理20秒，随后置于冰上20秒。重复该超声步骤九次，以获得长度约为800至1,200碱基对的DNA片段。向20微升超声处理后的样品中加入3微升5摩尔的氯化钠溶液和1微升RNase A。涡旋混匀各管，于37摄氏度孵育30分钟。然后，加入 2 µL 蛋白酶 K，在 65 °C 下孵育 2 小时。根据文本中的实验方案纯化样品后，将样品在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭显色。在三个预先冰浴并硅化处理的离心管中，分别加入 30 µL 裂解液和 70 µL 冰冷的含有蛋白酶抑制剂的 1× ChIP 缓冲液。向各相应试管中加入一微克抗 IgG、抗组蛋白 H3 或抗 HMGB1 抗体。在低温室中持续旋转孵育过夜。在低温室中，重悬 Protein G 磁珠后，向每个反应管中加入四微升磁珠，并在低温室中旋转孵育额外两至四小时。将离心管置于磁力架上，使磁珠沉淀，移除上清液。向沉淀中加入200微升含蛋白酶抑制剂混合物的1×ChIP缓冲液，在低温下旋转孵育5分钟进行洗涤。随后，使用高盐1×ChIP缓冲液进行一次额外洗涤。然后，加入160 µL洗脱缓冲液重悬沉淀，37 °C旋转孵育30分钟。离心收集磁珠沉淀，将上清液转移至新的离心管中。加入6 µL 5 M氯化钠和2 µL蛋白酶K，65 °C过夜孵育。根据文本方案纯化DNA后，使用针对目标区域或多个区域的引物组进行PCR反应，并在含溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上分离扩增产物。使用前，将预先配制的DNA修复合成缓冲液置于冰上解冻，并加入40毫摩尔磷酸肌酸和2.5微克肌酸磷酸激酶。根据文本方案配制10X超螺旋缓冲液后，在10微升反应体系中，使用1微升痘苗病毒拓扑异构酶1与1X超螺旋缓冲液共同作用，使300纳克超螺旋质粒PCA FG1线性化。向松弛的质粒中加入 25 微升新鲜解冻的 HeLa 细胞提取物和 DNA 合成缓冲液。充分混匀后，向反应体系中加入 1 微升痘苗病毒拓扑异构酶 1，在 37°C 下孵育 1 小时。通过加入 1% SDS 和 0.25 毫克/毫升蛋白酶 K 终止反应，并在 65°C 下孵育 2 小时。用1X TPE缓冲液制备1%琼脂糖凝胶后，向反应体系中加入DNA上样染料，并将样品直接上样至凝胶中，各样品之间至少间隔四个泳道。在室温下，以1X TBE为电泳缓冲液，按每厘米2伏的电压进行第一维电泳，运行8至10小时，以分离拓扑异构体。用含有3微克/毫升氯喹磷酸盐的1X TBE缓冲液配制两升溶液。将凝胶浸泡在 200 毫升溶液中，用铝箔包裹，放置 20 分钟。进行第二维电泳时，将凝胶顺时针旋转 90 度，在含有 1× TBE 的氯喹溶液中以每厘米 2 伏的电压电泳 4 至 6 小时，以分离正超螺旋和负超螺旋。电泳缓冲液和凝胶中氯喹的含量至关重要，同时第二维电泳必须在极低电压下进行，这对分离正负超螺旋也极为关键。根据文本方案，在对凝胶进行染色和脱色后，使用成像仪观察拓扑异构体的热分布情况。如本凝胶所示，与未交联的对照质粒相比，约79%含有TFO导向ICL的质粒在琼脂糖凝胶基质中迁移速度较慢。对转染了对照质粒或含有TFO导向ICL质粒的人U2OS细胞裂解液进行ChIP实验，结果显示，使用抗HMGB1抗体免疫沉淀后，与对照区域相比，P-ICL区域HMGB1富集明显。通过siRNA处理从细胞中耗竭HMGB1后，P-ICL特异性的富集作用减弱。当使用抗IgG抗体对相同样品进行免疫沉淀时，仅检测到极微弱的PCR扩增信号。最后，本图中二维琼脂糖凝胶电泳结果显示，在HeLa细胞提取物中，HMGB1可诱导TFO导向的含ICL质粒发生结构改变，表现为负超螺旋化。一旦掌握，该技术若操作正确，大约可在五天内完成。在进行该操作时，必须牢记所有洗涤步骤均需在低温室中进行，因为室温下的洗涤可能会增加背景信号。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如通过siRNA介导的目标蛋白耗竭，随后进行突变筛选实验，以回答诸如目标蛋白是否参与DNA修复等科学问题。或者，它是否会显著改变该过程中的突变谱？该技术为研究蛋白质与特定位点DNA损伤之间的关联奠定了基础。观看本视频后，您应能充分了解如何研究结构蛋白与靶向DNA交联之间的关联，并进一步确定此类关联对DNA拓扑结构的影响。请勿忘记，溴化乙锭具有极高的危险性，因此在进行本实验时必须始终穿戴适当的防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

工具来研究蛋白质建筑HMGB1的作用，螺旋窜改，站点特定的DNA间交联处理

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

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DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

邻近连接测定法定位DNA损伤位点中的蛋白质

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

我们提出了一种通过天然γH2A.X染色质免疫沉淀（ChIP）快速高效检测常见脆性位点断裂的方法。该方法显著缩短了传统γH2A.X...

通过原生 &#947;H2A.X ChIP 捕获常见脆性位点断裂

了解利用改良染色质免疫共沉淀和DNA超螺旋实验研究HMGB1等蛋白质在特定位点DNA损伤处的结合及其拓扑修饰的方法。该技术有助于揭示DNA损伤修复机制并发现癌症治疗新靶点。

研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

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