研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

改进的染色质免疫沉淀和DNA超螺旋实验的总体目标是研究结构蛋白在人类细胞中由化疗或致癌剂诱导的位点特异性DNA损伤位点上的结合及其后续引发的拓扑学改变。该方法将帮助我们解答有关DNA损伤与修复的关键问题，从而促进发现癌症治疗中新的药理学靶点。我们的技术能够实现位点特异性DNA损伤的定向诱导，并有助于评估与人类癌症相关的关键DNA修复过程。

转染前24小时，将4×10⁵个哺乳动物细胞接种至每孔60毫米的培养皿中，培养基为添加10% FBS但不含抗生素的DMEM。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。在14毫升圆底试管中，加入30微升室温转染试剂与500微升已预热至37°C的1×生长培养基，混匀。

在第二个离心管中，将两微克含有TFO导向交联剂的质粒加入500微升1倍生长培养基中。将离心管在室温下孵育10分钟。将混合物一与混合物二混合，并用移液器上下吹打，充分混匀。

然后在室温下孵育溶液25至30分钟。接着用预热的PBS洗涤细胞两次。随后逐滴加入转染混合液，均匀分布于细胞培养板中。

向培养板中加入一毫升培养基，使最终体积达到两毫升。充分混匀后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。四小时后，更换为三毫升含10%胎牛血清（FBS）的培养基，继续孵育16小时。

孵育结束后，向每孔细胞中加入80微升新鲜的37%甲醛，在室温避光条件下孵育10分钟。每孔加入300微升预冷的甘氨酸以终止甲醛交联反应，孵育5分钟。随后吸除培养基，用预冷的PBS洗涤细胞两次。

接着，加入一毫升预冷的 PBS 后，用刮棒将细胞刮下并收集到预冷的微量离心管中，全程保持样品置于冰上。将样品在 13,400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，以制备细胞沉淀。然后弃去上清液，将沉淀置于冰上。

用 1 毫升预冷的缓冲液 A 均匀重悬沉淀，冰上孵育 10 分钟。然后像之前一样离心收集细胞。接着用 1 毫升预冷的缓冲液 B 均匀重悬沉淀，冰上孵育 10 分钟，期间通过倒置偶尔混匀。

然后像之前一样离心收集细胞。再次将细胞重悬于200微升预冷的缓冲液B中，加入2微升微球菌核酸酶（MNase），在室温下孵育反应10分钟。随后，将反应管置于冰上以终止MNase反应，并加入40毫摩尔的EDTA。

微球菌核酸酶的消化程度非常关键，因为过度消化可能导致信号丢失，而消化不足则可能导致大量非特异性背景。将细胞离心沉淀后，用100微升染色质免疫沉淀（ChIP）缓冲液重悬沉淀，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂混合物。然后，将细胞悬液转移至薄壁微量离心管中。

将样品置于水浴超声仪中进行超声处理20秒，随后在冰上放置20秒。重复该超声步骤九次，以产生约800至1,200个碱基对的片段。向20微升超声处理后的样品中加入3微升5摩尔的氯化钠溶液和1微升RNase A。涡旋混匀各管，并在37摄氏度下孵育30分钟。

然后，加入 2 µL 蛋白酶 K，在 65 °C 下孵育 2 小时。根据文本中的实验方案纯化样品后，将样品在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭显色。在三个预先冰浴并硅化处理的离心管中，分别加入 30 µL 裂解液和 70 µL 冰冷的含有蛋白酶抑制剂的 1× ChIP 缓冲液。

向各相应试管中加入一微克抗 IgG、抗组蛋白 H3 或抗 HMGB1 抗体。在冷室中持续旋转孵育过夜。在冷室中，重悬 Protein G 磁珠后，向每个反应管中加入四微升磁珠，并在冷室中旋转孵育两至四小时。

将离心管置于磁力架上，使磁珠沉淀，然后移除上清液。向沉淀物中加入200 µL含蛋白酶抑制剂混合物的1× ChIP缓冲液，在低温下旋转孵育5分钟进行洗涤。接着，使用高盐1× ChIP缓冲液进行一次额外洗涤。

然后，使用 160 µL 洗脱缓冲液重悬沉淀物，在 37 °C 条件下旋转孵育 30 分钟。离心收集磁珠沉淀，并将上清液转移至新的离心管中。加入 6 µL 5 M 氯化钠和 2 µL 蛋白酶 K，于 65 °C 孵育过夜。

根据文本方案纯化 DNA 后，使用针对目的区域或多个区域的引物组进行 PCR 反应，并在含溴化乙锭染色的 1% 琼脂糖凝胶上分离扩增产物。使用前，将预先配制的 DNA 修复合成缓冲液置于冰上解冻，并加入 40 毫摩尔磷酸肌酸和 2.5 微克肌酸磷酸激酶。根据文本方案配制 10X 超螺旋缓冲液后，在 10 微升反应体系中，使用 1 微升痘苗病毒拓扑异构酶 1 与 1X 超螺旋缓冲液共同作用，使 300 纳克超螺旋质粒 PCA FG1 线性化。

向松弛的质粒中加入 25 微升新鲜解冻的 HeLa 细胞提取物和 DNA 合成缓冲液。充分混匀后，向反应体系中加入 1 微升痘苗病毒拓扑异构酶 1，在 37°C 下孵育 1 小时。通过加入 1% SDS 和终浓度为 0.25 毫克/毫升的蛋白酶 K 终止反应，并在 65°C 下孵育 2 小时。

用1X TPE缓冲液制备1%琼脂糖凝胶后，向反应体系中加入DNA上样染料，并将样品直接上样至凝胶，各样品之间至少间隔四个泳道。在室温下，以1X TBE为电泳缓冲液，按每厘米2伏的电压进行第一维电泳，运行8至10小时，以分离拓扑异构体。另配制2升含3微克/毫升氯喹磷酸盐的1X TBE溶液。

将凝胶浸泡在 200 毫升溶液中，用铝箔包裹，放置 20 分钟。进行第二维电泳时，将凝胶顺时针旋转 90 度，在含有 1X TBE 的氯喹缓冲液中以每厘米 2 伏的电压电泳 4 至 6 小时，以分离正超螺旋和负超螺旋。电泳缓冲液及凝胶中氯喹的含量至关重要，同时第二维电泳必须在极低电压下进行，这对分离正负超螺旋同样至关重要。

根据文本方案对凝胶进行染色和脱色后，使用成像仪观察拓扑异构体的热分布情况。如本凝胶所示，与未交联的对照质粒相比，约79%含有TFO导向ICL的质粒在琼脂糖凝胶基质中迁移速度较慢。对转染了对照质粒或含有TFO导向ICL质粒的人U2OS细胞裂解液进行ChIP实验，结果显示，使用抗HMGB1抗体免疫沉淀后，与对照区域相比，P-ICL区域HMGB1富集明显。

当通过siRNA处理从细胞中耗竭HMGB1后，P-ICL特异性富集减弱。当使用抗IgG抗体对相同样品进行免疫沉淀时，仅检测到极低水平的PCR扩增。最后，在本图中，二维琼脂糖凝胶电泳显示，在HeLa细胞提取物中，HMGB1诱导TFO导向的含ICL质粒发生结构修饰，表现为负超螺旋结构。

一旦掌握，该技术若操作正确，大约可在五天内完成。在进行该实验过程中，必须牢记所有洗涤步骤均需在低温室中进行，因为室温下的洗涤可能会增加背景信号。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，例如通过siRNA介导的目标蛋白耗竭，随后进行突变筛选实验，以回答诸如目标蛋白是否参与DNA修复等科学问题。

或者，它是否会在此过程中显著改变突变谱？该技术为研究蛋白质与位点特异性DNA损伤之间的关联奠定了基础。观看本视频后，您应能充分了解如何研究结构蛋白与DNA交联靶向结合的关联，并进一步确定此类结合对DNA拓扑结构的影响。

请注意，溴化乙锭具有极高的危险性，因此在进行本实验时必须始终穿戴适当的防护装备。