半定量、中通量结核分枝杆菌计数的活性炭琼脂刃天青检测法可视化

CARA 的总体目标是提供一种中等通量的半定量方法，用于评估化合物对复制期和非复制期分枝杆菌的活性。该技术的主要优势在于，作为菌落形成单位（CFU）的替代方法，CARA 能够快速检测化合物的剂量依赖性和时间依赖性。该方法有助于回答结核病药物研发领域中的关键问题，例如确定某种化合物对复制期细菌是抑菌性还是杀菌性，以及其是否对非复制期细菌具有杀菌活性。

演示该方法的是本实验室的Julia Roberts。向一个1升的玻璃烧杯中加入450毫升水，或向一个2升的锥形瓶中加入900毫升水。在烧杯或锥形瓶中放入一个可高压灭菌的搅拌子。

接下来，将 Middlebrook 7H11 粉末、活性炭加入终浓度为 0.4% 的溶液中，并加入 50% 甘油溶液以达到终浓度为 0.2%。用铝箔覆盖烧瓶或烧杯的开口，并用高压灭菌胶带固定在玻璃器皿上。培养基高压灭菌后，在磁力搅拌器上以低速冷却至约 55 至 65 摄氏度，以保持活性炭处于悬浮状态。

在配备磁力搅拌器的生物安全柜中进行无菌操作时，取下培养基的铝箔封口，分别向两升锥形瓶或一升烧杯中加入100或50毫升OADC补充剂，并继续搅拌混合。使用带有八个或十二个滤芯吸头的多通道移液器，从试剂储液槽或烧杯中将7H11-OADC-活性炭培养基快速加入96孔微孔板中，每孔200 µL，操作需迅速以避免琼脂凝固和气泡产生。将CARA微孔板叠放后置于可密封的塑料袋中，防止干燥，并于4°C保存。

将耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）接种于含有4毫升或20毫升Middlebrook 7H9-ADN或7H9-OADC培养基的聚丙烯圆底或锥形离心管中，接种量使OD580达到0.01至0.1。将耻垢分枝杆菌培养物在37°C、20% O2条件下振荡培养，使其生长至对数中期，即OD580约为0.5。为在复制和非复制条件下进行最小抑菌浓度（MIC）类型的实验，将OD580为0.01的7H9-ADN培养液中的菌悬液200 µL接种至透明平底、经组织培养处理的96孔板的每个孔中。

对于非复制性实验，使用含有0.02% tyloxapol的PBS洗涤细胞两次，并使用非复制性培养基重悬细胞。用非复制性培养基将细胞稀释至OD580为0.1，并从新配制的1摩尔储备液中加入硝酸钠，使其终浓度为0.5至5毫摩尔。

将OD580为0.1的细胞以每孔200微升的量加入透明底、经组织培养处理的96孔板的所有孔中。根据文本方案配制测试试剂后，向A至E行各孔加入2微升测试试剂一，向E至H行各孔加入2微升测试试剂二，并充分混匀。对于重复实验，将M. smegmatis微孔板在37°C、20% O₂和5% CO₂条件下孵育1至48小时。

在需要将CARA作为检测读数的时间点，使用设置为50至75微升的p200多通道移液器，通过上下吹打5到10次，小心地重悬MIC90样式的检测板中各孔的内容物。然后使用移液器吸头以圆周运动轻轻搅动各孔中的液体。将10微升未稀释的检测孔内容物转移至CARA微孔板的对应孔中，转移过程中避免飞溅，并确保10微升的样品准确点样至CARA微孔板各孔的中央位置。

使用板带将CARA微孔板堆叠固定，然后放入可密封的塑料袋中。将M. smegmatis CARA微孔板在37摄氏度、20% O₂条件下孵育，复制型培养板孵育一至两天，非复制型培养板孵育两至三天。当阴性对照孔中出现细菌生长的菌膜或较大的肉眼可见菌落时，使用一套12个p200吸头配合多通道移液器，沿孔壁加入40微升无菌PBS，使PBS覆盖在琼脂/细菌微菌落表面并均匀分布。

通过将5毫克刃天青与50毫升含5%吐温80的PBS混合，配制CARA显色试剂。向CARA微孔板的每个孔中加入50微升新鲜配制的CARA显色试剂。随后将微孔板前后轻轻摇动数次，以帮助试剂均匀分布于各孔的琼脂及细菌层中。

将平板放入可重复封口的塑料袋中，在37摄氏度下孵育至少30分钟（适用于耻垢分枝杆菌）。在读取荧光之前，将CARA微孔板置于生物安全柜中，室温下静置15分钟，并取下盖子。当在生物安全柜外使用BSL3级分光光度计时，需在微孔板表面贴上光学级PCR封膜，并用柔软的纸巾轻轻按压封膜表面，确保密封紧密。

采用顶部读数法检测荧光，激发波长为 530 纳米，发射波长为 590 纳米。无需对酶标板进行空白校正。数据分析时，将抑制剂浓度以 log10 标度绘制在 X 轴上，荧光值以线性标度绘制在 Y 轴上。

请参阅文字版实验方案以获取更多细节。导致CARA荧光无法升高至背景水平以上的测试剂浓度即为CARA-MBC ≥ 99，如图所示。下标“≥ 99”表示CARA-MBC提供的测试剂浓度估计值可实现≥ 2 log10的细菌杀灭效果。

如果化合物显示出静态窗口（定义为 MIC 与 CARA 曲线之间向右偏移超过四倍），则怀疑其具有抗生素后效应。静态窗口表明，对复制中的结核分枝杆菌具有活性的分子可能是抑菌性的，而非杀菌性的。对于具有强效抗生素后效应的分子，静态窗口可能难以观察，仅在扩大 CARA 荧光 Y 轴范围后才能显现，如此处所示。

此处展示了通过 MIC90 和 CARA 检测的复制性和非复制性活性分子。尽管异烟肼和利奈唑胺在 MIC90 检测中显示出对非复制性细菌具有活性，但 CARA 结果表明，它们在所测试的非复制性条件下无活性。在此 CARA 实验中，将 M. smegmatis 暴露于浓度递增的利福平后，仅一小时即观察到影响，并在三至 24 小时内表现出逐渐增强的杀菌活性，在 24 小时时于约 10 µg/mL 浓度下杀灭细菌数量达到或超过 2 至 3 log₁₀。

一旦掌握，该技术可在约两小时内完成平板制备，不到一小时将细胞转移至CARA平板，并在操作正确的条件下，再用约一至两小时完成CARA平板的荧光显影与测量。在进行该实验时，重要的是要牢记将CARA用作一种预测性检测方法，以确定化合物对正在复制或非复制状态的分枝杆菌具有杀菌还是抑菌活性。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立CARA实验体系，并以有助于预测化合物活性类型的方式分析数据。

感谢观看，祝您的实验顺利。