Name: 木炭琼脂刃天青分析的可视化分枝杆菌的半定量，中等吞吐量枚举 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习木炭琼脂刃天青分析法，用于分枝杆菌药物筛选的半定量中等通量评估。该方法可快速区分杀菌与抑菌活性，加速结核病新药研发进程。

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我们感谢Kristin Burns-Huang对本文手稿的专家评审，以及J. David Warren（威尔康奈尔医学院）在开发CARA过程中提供的化学协助。本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会结核病药物加速器计划、Abby和Howard P. Milstein转化医学项目以及美国国立卫生研究院结核病研究单位（U19 AI111143）的资助。微生物学与免疫学系得到了威廉·伦道夫·赫斯特基金会的支持。SSK获得了美国国立卫生研究院资助K08AI108799的支持。

1. CARA 微孔板的制备
<ol>
	<li>在2 L锥形瓶中加入900 ml含0.2%甘油和0.4%活性炭的Middlebrook 7H11琼脂，或在1 L玻璃烧杯中加入450 ml，进行高压灭菌。在锥形瓶或烧杯中放入一个较大的可灭菌搅拌子。用铝箔覆盖瓶口或杯口，并用高压灭菌胶带固定在玻璃器皿上。</li>
	<li>将灭菌后的培养基置于磁力搅拌器上，低速搅拌至手感不烫（约55–65 °C），以保持活性炭悬浮状态。</li>
	<li>后续所有步骤均须在配备磁力搅拌器的生物安全柜内无菌操作进行。</li>
	<li>移去铝箔，向2 L锥形瓶中加入100 ml OADC补充剂（OADC补充剂以10%比例添加时，最终培养基中含0.2%葡萄糖、0.5%白蛋白、0.085% NaCl、0.0005%油酸和0.4 mg/ml过氧化氢酶），或向1 L烧杯中加入50 ml OADC补充剂，继续搅拌混合。</li>
	<li>若使用锥形瓶，将约25–40 ml 7H11-OADC-活性炭培养基倒入无菌试剂储液槽中；若使用烧杯，则无需使用试剂储液槽。</li>
	<li>用试剂储液槽或烧杯中的培养基向96孔微孔板每孔加入200 μl 7H11-OADC-活性炭。操作应迅速，避免琼脂凝固和气泡产生。避免将固体培养基溅至孔外，以防真菌污染。使用多通道移液器时，用一组12个带滤芯的吸头将7H11-OADC-活性炭转移至96孔板的8个排（A–H排）。 
	注意：该培养基凝固迅速。为避免堵塞移液器吸头，应频繁更换吸头。</li>
	<li>也可使用带滤芯吸头的P1000电子多通道移液器倾注CARA微孔板，以提高大量制板效率。 
	注意：由于微孔板孔体积较小，CARA微孔板中的琼脂在倾注后数分钟内即凝固。</li>
	<li>将CARA微孔板叠放后置于可密封塑料袋中，防止干燥。</li>
	<li>CARA微孔板储存于4 °C。</li>
</ol>
2. 建立可复制与非复制性 MIC90 检测
<ol>
	<li>接种 M. tuberculosis, M. bovis BCG 或 M. smegmatis 在 OD580 0.01–0.1，并扩增至对数中期（OD580 ~0.5) 于 Middlebrook 7H9-ADN（含0.2%甘油、0.2%葡萄糖、0.5%白蛋白和0.085% NaCl的Middlebrook 7H9）或7H9-OADC（含0.2%甘油和10% OADC补充剂的Middlebrook 7H9）中。</li>
	<li>培养 M. tuberculosis 和 M. bovis 在细胞培养瓶中将BCG作为约20 ml静置培养物培养 M. smegmatis 在聚丙烯圆底（4 ml 培养）或 50 ml 锥形离心管（10–20 ml 培养）中振荡培养。将致病性分枝杆菌在 37 °C、20% O₂ 条件下孵育2 和5% CO2，以及 M. smegmatis 在37 °C、20% O₂条件下2.</li>
	<li>建立最小抑菌浓度（MIC）90)-型实验，在复制和非复制条件下进行（图2). 
	注意：通常每个96孔微孔板设置重复2次或4次，以便分别检测4种或2种化合物。例如，在一个96孔板中，一种待测药物可在A-D行进行检测，另一种在E-H行进行检测。DMSO（溶剂对照）位于第1、2和12列，待测药物的浓度梯度从第3列（最低浓度）至第11列（最高浓度）依次递增。MIC90-型实验通常采用2倍稀释系列。目前已有多种用于分枝杆菌的非复制模型可供选择14-16,18,24,25 为说明目的，我们采用了一种非复制性的多重应激模型6,8,9.
	<ol>
		<li>对于复制测定实验，将200 μl处于7H9-ADN培养基中的细胞按OD值分配580 将0.01加入经组织培养处理的透明底96孔板的所有孔中。</li>
		<li>对于非复制性实验，用含有0.02% tyloxapol的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并将细胞重悬于非复制性培养基（0.05% KH2PO4，0.05% MgSO₄4，0.005% 柠檬酸铁铵，0.0001% ZnCl₂2，0.1% NH4Cl，0.5% BSA，0.085% NaCl，0.02% tyloxapol，0.05% butyrate；用2 N NaOH调节pH至5.0。
		<ol>
			<li>将细胞稀释至 OD580 在非复制培养基中调节至0.1，并加入NaNO₂2 从新配制的 1 M 储液中稀释至终浓度为 0.5 mM。</li>
			<li>将200 μl细胞悬液按OD值分配580 将0.1加入所有透明底、经组织培养处理的96孔板的孔中。 
			注意：将化合物稀释液配制成二甲基亚砜（DMSO）中的100倍储备液。因此，若需在最低抑菌浓度（MIC）板中测试某分子在终浓度0.4–100 μg/ml范围内的作用，则需配制0.04–10 mg/ml的DMSO储备液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将测试剂1的稀释液2 μl加入A-E行，将测试剂2的稀释液2 μl加入E-H行。充分混匀。</li>
		<li>向对照孔（通常为DMSO）加入2 μl溶剂对照，即第1、2、12列（A-H行）。充分混匀。</li>
		<li>每次实验均应包含至少一个阳性对照，例如利福平，浓度为 0.004 至 1 μg/ml（用于复制型实验）和/或 0.08 至 20 μg/ml（用于非复制型实验）。 
		注意：6-溴-1H-吲唑-3-胺的使用9 建议使用浓度为 0.1 至 25 μg/ml 的化合物作为对照，该化合物具有选择性，NaNO2非复制性多重应激模型中的依赖性活性</li>
		<li>对于重复性检测，将微孔板在37 °C、20% O₂条件下孵育2 和5% CO2 7天（M. tuberculosis 和 M. bovis BCG）或 1-48 小时（M. smegmatis）。对于非复制型多重应激模型，在37 °C、1% O₂条件下孵育微孔板7天2 和5% CO₂2 (M. tuberculosis 和 M. bovis BCG</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CARA 微孔板的接种
<ol>
	<li>在需要使用CARA作为检测读数的时间点，使用设置为50–75 μl的多通道移液器小心重悬MIC90型测定板各孔中的内容物。上下吹打至少5–10次，并用移液器吸头以圆周运动轻轻混匀孔内液体。</li>
	<li>将10 μl测定孔中的内容物转移至CARA微孔板。确保测定板上各孔内容物的排列顺序与CARA微孔板上一致。转移过程中避免飞溅，并确保将10 μl样品点加至CARA微孔板孔的中央位置。确认10 μl液体已完全被CARA微孔板吸收。 
	注意：在将细胞点加至CARA微孔板前，无需进行任何稀释。</li>
	<li>用封板膜将多块CARA微孔板叠放后密封，然后放入可重复封口的塑料袋中。将CARA微孔板置于37 °C培养，其中M. smegmatis在20% O2条件下培养，M. tuberculosis和M. bovis BCG则在1% O2和5% CO2条件下培养。</li>
	<li>对于M. tuberculosis和M. bovis BCG的复制型检测：培养7天；对于M. tuberculosis和M. bovis BCG的非复制型检测：培养10天；对于M. smegmatis的复制型检测：培养1–2天；对于M. smegmatis的非复制型检测：培养2–3天。 
	注意：上述时间为估计值，可根据不同的复制状态、非复制状态及应激条件进行相应调整。</li>
</ol>
4. 开发 CARA 微孔板
<ol>
	<li>当阴性（溶剂）对照孔中出现细菌生长的菌膜或更大、肉眼可见的菌落时，开始显色CARA微孔板。 
	注意：经过长时间孵育后，CARA微孔板的孔常会显得干燥，建议使用无菌PBS预先润湿孔内物质。这有助于防止活性炭吸附刃天青，从而避免荧光信号偏低或孔间差异增大。</li>
	<li>使用多通道移液器配合一组12个p200吸头，沿孔壁加入40 µl无菌PBS，并让PBS自然扩散覆盖琼脂表面及细菌微菌落。</li>
	<li>通过将5 mg刃天青（终浓度0.01%）与50 ml PBS中的5% Tween80混合，配制CARA显色试剂。充分涡旋混匀后进行无菌过滤。 
	注意：也可将市售的刃天青液体溶液与含10% Tween80的PBS按1:1（体积比）混合，作为替代的CARA显色试剂。</li>
	<li>使用12通道移液器向CARA微孔板的每个孔中加入50 µl新鲜配制的CARA显色试剂。轻轻前后摇动微孔板数次，以帮助试剂均匀分布于各孔的琼脂和细菌层表面。</li>
	<li>将微孔板放入可密封的塑料袋中，在37 °C孵育至少30分钟（用于M. smegmatis）或45–60分钟（用于M. tuberculosis或M. bovis BCG）。 
	注意：若溶剂对照孔在1小时内未变为粉红色，可重新密封后继续孵育更长时间。</li>
	<li>在读取荧光前，将CARA微孔板置于生物安全柜中，室温下静置15分钟并打开盖子。若在生物安全柜外使用BSL3级分光光度计，应在板上贴附光学级PCR封膜，并用软纸巾轻轻按压封膜表面，确保密封紧密。</li>
	<li>采用顶部读板模式检测荧光，激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。无需进行空白校正。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>以抑制剂浓度的对数10值为横坐标（X轴），以线性刻度的荧光值为纵坐标（Y轴）作图。采用散点图并使用曲线拟合方法，例如&#34;对数抑制剂-响应-可变斜率（四参数）&#34;。数据点以均值±标准误表示。</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+approaches+to+anti-infective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fresh approaches to anti-infective therapies.</a> Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).</li>
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</ol>

不存在任何利益冲突需要披露。

CARA最初是为了缓解非复制型或双活性分子研究中的瓶颈问题而开发的7。CARA在初筛命中化合物的浓度-反应确认与菌落形成单位（CFU）检测之间起到中间步骤的作用（图1）。由于单个CARA平板可替代大量用于制备系列稀释液的微量滴定板以及含琼脂的培养皿（用于计数存活细菌），因此CARA提供了一种简便方法，可快速评估化合物的活性，并同时测试多个变量，包括化合物浓度和化合物作用时间。
在菌落形成单位（CFU）实验中，除了通常可达106倍的系列稀释外，琼脂平板本身通常还会将分子额外稀释约800倍（10 μl加入8 ml的三联式培养皿中）。我们用于筛选对非复制状态M. tuberculosis具有活性化合物的两阶段、多应激筛选实验，其携带效应因子为5倍，即在非复制阶段存在的化合物，在后续生长（复制）阶段中的浓度仅为原始浓度的五分之一6-9。CARA通过使用活性炭隔离小分子，从而减轻携带效应。大多数结核病药物及临床候选药物均可迅速且完全地与活性炭结合，唯氨基糖苷类抗生素链霉素例外7。在CFU实验的琼脂平板中加入活性炭后，可防止因TMC207和PA-824残留携带而引起的细菌生长抑制或杀菌作用7,21,22。因此，通过在细菌学琼脂中加入活性炭，CARA方法不再依赖于细胞和测试试剂的系列稀释。
CARA可用于预测复制型活性物质的抑菌或杀菌作用，以及非复制型活性物质的杀菌作用。通常，CARA与标准的MIC90实验平行使用。CARA的预测能力来源于对MIC90和CARA结果的比较（图2和表1）。在研究抗分枝杆菌药物时，CARA能够准确预测药物活性属于复制型杀菌（图4a）、复制型抑菌（图4b）、非复制型杀菌（图4c）或双重活性（图4d）。CARA还允许对化合物在不同剂量和时间条件下的活性进行简便评估。单独使用CFU实验来评估化合物在广泛剂量和时间范围内的活性需要大量人力和材料，而当CARA结果将条件范围缩小至化合物明显具有活性的范围时，该任务变得易于实施（图5）。
尽管CARA在研究抗感染药物对分枝杆菌作用方面具有应用价值，但该检测方法存在局限性。CARA的动态范围较窄（2-3个log10），可能不适用于预期细菌杀灭效果不超过2至3个log10的情况。CARA的预测结果需要进一步采用更为严格和精确的细菌计数方法（如菌落形成单位测定法，CFU测定）进行验证。某些抗感染药物（如对氨基水杨酸，PAS）的抗生素后效应可能会干扰CARA作为区分针对复制期M. tuberculosis的杀菌性与抑菌性化合物的预测工具的准确性7。
提高CARA质量有两个建议。首先，在倒CARA微孔板时，必须在琼脂凝固前迅速操作，同时保持体积准确并避免将液体溅出微孔外。无论所需板子数量多少，建议每次配制0.5至1 L的培养基，以帮助在倒板所需时间内维持培养基的液态。在向微孔板加样过程中应频繁更换吸头，以避免使用部分堵塞的吸头。其次，必须尽量减少重复样本间荧光信号的人为差异。分枝杆菌微菌落，特别是像M. tuberculosis这样的致病性分枝杆菌，常常生长不规则。例如，生长在琼脂表面的微菌落可能在大小、形状、高度上存在差异，或延伸至微孔板孔壁内侧。一个挑战是如何使显色试剂均匀覆盖所有杆菌；另一个难题是，在37 °C长时间孵育后，CARA微孔板中的固体细菌培养基可能变干，容易吸收显色试剂。由于活性炭可结合刃天青并淬灭其荧光7，干燥的孔可能导致刃天青显色液被吸收，且活性炭会淬灭刃天青荧光，从而引起孔间差异。在加入显色试剂前，立即用PBS预润湿所有CARA微孔板孔的表面，可缓解这两个问题——显色试剂将均匀到达所有分枝杆菌菌落，同时刃天青保持在活性炭上方，避免干扰。CARA可能适用于鉴定和表征分枝杆菌突变体的表型，或用于其他细菌物种的中通量药物筛选实验。

结核分枝杆菌结核病的病原体可在宿主体内以潜伏状态存活，这种状态对抗生素根除具有抗性。表型（非遗传性）耐药性 M. tuberculosis 感染期间出现的情况部分归因于非复制性杆菌群体的存在1,2I类持留菌在大量药物敏感性细胞中通过罕见的随机机制产生，表现出表型耐药性3,4II类持留菌由于宿主免疫因素的作用而进入非复制状态，包括感染过程中所遭遇微环境中的外部应激因素。我们近期开发了一种 体外 II类非复制性持续感染模型，用于模拟所面临的条件 M. tuberculosis 在活化的巨噬细胞和肉芽肿中。II类持续性多应激模型包括减缓生长的条件（如脂肪酸作为碳源）以及完全停止生长的条件（如轻度酸性环境（pH 5.0）、低氧（1% O₂））。2，以及一氧化氮和其他活性氮中间产物5-9采用这种非复制性多重应激模型以及其他II类非复制模型进行的大规模筛选，已获得多种针对非复制状态发挥作用的活性分子5-7,9-18相同的非复制性筛选还揭示了一类对复制性和非复制性杆菌均具有活性的分子，称为 &#34;双重活性成分&#34;7,10,12,19,20.
在药物发现的苗头化合物到先导化合物阶段，需要对候选分子进行广泛表征，以筛选出可用于苗头化合物拓展的先导化合物，并开展初步药理学表征、靶点鉴定以及初步的体内药效学研究。作为早期步骤，抗感染药物首先根据其抑菌或杀菌作用机制进行分类；若为杀菌作用，还需进一步判断其杀菌效应是依赖于作用时间还是药物浓度，或两者兼有。菌落形成单位（CFU）测定法是回答这些问题的经典“金标准”方法。在CFU测定中，细菌暴露于待测药物后，定时取样，进行系列稀释，将稀释液等分点种于固体细菌培养基上，经孵育使存活细胞生长形成菌落，最终对菌落数量进行计数。该方法需要使用大量微孔板进行细胞稀释，并使用含琼脂的培养皿对存活菌落进行计数。对于生长缓慢的分枝杆菌，CFU测定受到其较长世代时间（18–24小时）的限制，菌落通常需要约3周才能在平板上可见。此外，在生物安全三级（BSL-3）专用设施中，孵育空间往往有限。
尽管操作繁琐，菌落形成单位（CFU）测定仍是表征非复制性及双重活性分子对分枝杆菌作用的金标准。由于许多非复制性检测常与复制性检测联合用于评估细胞活力，因此易产生较高的假阳性率。6-8例如，一种对复制中的病原体具有强效活性的化合物 M. tuberculosis (a &#34;复制活跃&#34;）可能在非复制阶段的实验中未能杀死目标，但仍可能因从非复制阶段残留至恢复阶段而产生杀伤作用，而恢复阶段是在支持复制的条件下进行的（&#34;复制条件&#34;化合物残留会进一步 complicates 双活性分子的分析，使得难以区分其活性是复制性、非复制性还是双重活性。
为了解决上述问题，我们开发了 c木炭 agar r刃天青 a用于快速半定量计数分枝杆菌属物种的 CARA 检测法 M. tuberculosis, M. bovis BCG，以及 M. smegmatis7 (图1 和 2）。在缓冲溶液中 体外活性炭可迅速吸附用于治疗结核病的大多数常规药物7活性炭在CARA微孔板中可结合可能从检测微孔板中残留转移的化合物，该特性使CARA无需在计数前对检测孔内的成分进行连续稀释。7,21,22通过向CARA微孔板的琼脂表面添加刃天青（一种蓝色染料）来估算分枝杆菌微菌落的数量，刃天青的还原产物为粉红色的试卤灵，其荧光强度可通过分光光度法测定。23CARA 微孔板孵育 1-2 天 M. smegmatis 7到10天，用于生长缓慢的分枝杆菌，例如 M. tuberculosis 和 M. bovis 卡介苗。CARA 的动态范围较窄，约为 2-3 个对数级10 菌落形成单位（CFU）的差异。相较于CFU实验，单个CARA微孔板可替代约五个用于系列稀释的96孔板以及120个用于涂布的三联琼脂平板。CARA数据的解读有助于指导后续研究，确定在更为繁琐的基于CFU的实验中应测试的孵育时间与化合物浓度。

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>298810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>BSA，热激</td><td>罗氏</td><td>3118958001</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Sigma</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>PBS，Dulbecco's Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 自由</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Sigma</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>6-溴-1H-吲唑-3-胺</td><td>Alfa Aesar</td><td>H34095</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>丁酸，液体</td><td>Sigma</td><td>B103500</td><td></td></tr><tr><td>刃天青粉末</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>配制好的刃天青溶液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>PCR 贴纸</td><td>丹维尔</td><td>B1212-5</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89094-678</td><td></td></tr><tr><td>可密封塑料袋</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>395-94602</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 聚丙烯圆底管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>康宁</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>透明平底经组织培养处理的96孔微孔板</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 for OS X</td><td>GraphPad</td><td>http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td></tr></tbody></table>

半定量、中通量结核分枝杆菌计数的活性炭琼脂刃天青检测法可视化

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

迫切需要发现和推进可缩短结核病（TB）治疗疗程的抗感染药物。 结核分枝杆菌， 结核病的致病因子由于存在表现出表型耐药的杆菌，对快速且持久的化学治疗具有抵抗性。 c木炭 agar r刃天青 assay（CARA）被开发为一种工具，用于表征通过高通量筛选实验发现的针对复制型和非复制型病原体的活性分子 M. tuberculosis在细菌学琼脂培养基中加入活性炭有助于减轻化合物残留的影响，并消除了在CARA微孔板上点样前对细胞进行预稀释的必要性。在37 °C培养7-10天后，生长于CARA微孔板孔表面的分枝杆菌微菌落可还原刃天青，通过荧光测定法可实现对细菌数量的半定量评估。CARA方法可检测到约2-3个数量级的减少10 细菌数量的差异，并预测可导致≥99%细菌杀灭的最小杀菌浓度（MBC）≥99CARA 可用于判断一种分子对正在复制的、非复制的或两者状态的分枝杆菌是否具有活性。通过 CARA 进行的初步实验有助于确定测试药物的浓度及化合物作用时间，以便进一步通过菌落形成单位（CFU）实验进行评估。此外，CARA 还可预测对复制期菌体起效的化合物是杀菌性还是抑菌性。

预期的CARA结果见图2，并总结于表1。对于复制性细胞，CARA与标准MIC90实验平行进行；而对于非复制性实验，CARA则与一种改良的MIC90实验平行进行，该实验结合了扩增培养阶段。当受试药物的浓度导致CARA荧光信号未能高于背景水平时，该浓度即为CARA-MBC≥99（图3a）。“≥99”下标表示CARA-MBC提供的是使细菌杀灭率达到≥2 log10（即≥99%杀灭）的受试药物估计浓度。
液体肉汤 MIC90 该检测方法无法区分杀菌活性与抑菌活性，此区别需通过菌落形成单位（CFU）实验来确定。按照惯例，区分慢生长分枝杆菌的杀菌与抑菌活性的阈值约为2-3个对数级10 7天内杀死7,26由于CARA的动态范围也是2-3个对数级10 杀灭时，CARA 可用于评估杀菌或抑菌活性。由于某些复制型活性化合物无法将 CARA 荧光降低至背景水平，CARA 可轻松识别其为抑菌性物质（图2）。然而，某些化合物对处于复制阶段的细菌具有抑菌活性 M. tuberculosis 具有显著的抗生素后效应，即在无化合物残留的情况下，仍能在恢复阶段持续抑制细菌的再生长。这种效应在CARA实验中可能难以识别。若化合物表现出“抑菌窗口”——定义为一种静态窗口——则怀疑其具有抗生素后效应。 &gt;MIC与CARA曲线之间向右移动4倍图3b）。静态窗口表明该分子对复制中的病毒具有活性 M. tuberculosis 可能是抑菌性的而非杀菌性的。在某些情况下，只有在对 CARA 荧光的 Y 轴进行扩展后观察时，抑菌窗口才变得明显图3c 和 3d).
CARA 和 MIC90 数据通常被一同绘制（图 4）。在 图 4 中展示了通过 MIC90 和 CARA 测定的具有复制活性和非复制活性分子的代表性数据。分子的活性可分为四大类：1）对复制期细菌具有杀菌作用（以异烟肼为例，图 4a）；2）对复制期细菌具有抑菌作用（以利奈唑胺为例，图 4b）；3）对非复制期细菌具有杀菌作用（以氧苯布特酮为例，图 4c）；以及 4）对复制期细菌具有活性（抑菌或杀菌）且对非复制期细菌具有杀菌作用（以 PA-824 为例，图 4d）。重要的是，图 4a 和 图 4b 表明，尽管异烟肼和利奈唑胺在 MIC90 检测中似乎对非复制期细菌表现出活性，但 CARA 结果提示它们在所测试的非复制条件下并无活性。为了验证 CARA 在预测分子时间依赖性和浓度依赖性作用方面的实用性，将处于复制期的 M. smegmatis 暴露于浓度递增的利福平中（图 5a–d），并在 1–24 小时之间的不同时间点取样，点样至 CARA 平板上。这些数据表明，利福平在 1 小时时即已产生作用（图 5a），在 3 至 24 小时期间杀菌活性逐渐增强（图 5b–d），并在 24 小时时于约 10 μg/ml 浓度下杀灭了 ≥2–3 log10 的细菌（图 5d）。若采用标准的基于菌落形成单位（CFU）的检测方法，进行包含溶剂对照四重复、9 个药物浓度及 4 个时间点的类似实验，将极为耗时且难以实施。
因此，CARA 可作为药物发现中的一种中通量、快速筛选方法，用于识别分子的活性谱。CARA 的预测结果应通过标准的菌落形成单位（CFU）实验进行严格评估。在用于 CFU 分析的培养皿中添加 0.4% 活性炭可能有助于提高与 CARA 数据的相关性，并获得更准确的 CFU 计数，校正幅度通常与化合物的效价成正比21,22.
<img alt="抗生素敏感性测试流程图；MIC₉₀ 评估；96孔、384孔板设置" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：CARA 是药物发现中的预测工具。该示意图总结了 CARA 在药物筛选（单点筛选、挑取验证及剂量反应实验）与耗时的苗头化合物到先导化合物筛选（CFU 实验及靶点鉴定）之间作为中间阶段的应用价值。[经许可改编自 Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="抗生素敏感性试验示意图；检测方法；药物暴露；OD580；荧光读数。" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 肉汤 MIC90 检测与 CARA 的示意图及预期结果。MIC90 和 CARA 的结果均展示了 8 种可能的活性。MIC90 微孔板孔位的颜色编码为白色（无生长）和棕色（有生长），CARA 微孔板的颜色编码为黑色（无荧光）和粉色（还原型刃天青荧光）。数据为假设性结果。[经许可改编自 Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗菌试验结果；抑制率与化合物关系；CARA荧光图示；药物测试。" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： CARA 专用术语与定义。 导致 CARA 荧光降至背景水平的分子最低杀菌浓度定义为 CARA-MBC≥99（a）。在细菌复制条件下，若 CARA-MBC≥99 相较 MIC90 向右偏移 ≥4 倍，通常提示具有抑菌活性，该现象称为“抑菌窗”（b）。对于具有显著抗生素后效应的分子，抑菌窗可能难以观察（c），需扩展 Y 轴（CARA 荧光信号）以清晰显示（d）。数据为假设示例。[经许可改编自 Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="复制性与非复制性杀菌和抑菌效果；抑制率与剂量关系图" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 部分化合物的代表性 MIC90 与 CARA 结果。 显示了（a）异烟肼（INH）、（b）利奈唑胺、（c）氧苯丁嗪、（d）PA-824 的 MIC90（红色）和 CARA（蓝色）数据。野生型 M. tuberculosis H37Rv 在标准复制条件下或非复制的多应激模型中暴露于化合物中，持续7天7-9。MIC90 检测与 CARA 按 图2 所示方法进行。[经 Gold 等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20157 许可改编] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同时间点（1、3、6、24 小时）下利福平浓度与 CARA 荧光的关系图；剂量-反应分析。" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图 5： 利福平的剂量与时间依赖性活性。 在复制条件下，将非致病性快速生长的 M. smegmatis 暴露于逐渐增加的利福平浓度中，并在 1（a）、3（b）、6（c）和 24（d）小时时取样进行 CARA 检测。[经许可改编自 Gold 等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 20157] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="抗菌试验分类表，包含参数、活性分类和测试结果。" src="/files/ftp_upload/54690/54690tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1：图 2 中预期结果的汇总。[经许可改编自 Gold 等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2015 7] <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690tbl1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>

炭琼脂刃天青检测法（charcoal agar resazurin assay，CARA）是一种半定量、中通量的方法，用于评估受试物质对正在复制、非复制或两类状态结核分枝杆菌的活性。CARA 可快速评价药物的时间依赖性和浓度依赖性活性，并确定进一步进行菌落形成单位（CFU）检测的相关参数。

迫切需要发现和推进能够缩短结核病（TB）治疗周期的抗感染药物。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是导致结核病的病原体，该……

CARA 的总体目标是提供一种中等通量的半定量方法，用于评估化合物对复制型和非复制型分枝杆菌的活性。该技术的主要优势在于，作为菌落形成单位（CFU）的替代方法，CARA 能够快速检测化合物的剂量依赖性和时间依赖性。该方法有助于回答结核病药物研发领域中的关键问题，例如确定某种化合物对复制型细菌是抑菌性还是杀菌性，以及其是否对非复制型细菌具有杀菌作用。演示该方法的是本实验室的Julia Roberts。向一个1升的玻璃烧杯中加入450毫升水，或向一个2升的锥形瓶中加入900毫升水。在烧杯或锥形瓶中放入一个可高压灭菌的搅拌子。接下来，将 Middlebrook 7H11 粉末、活性炭加入终浓度为 0.4% 的溶液中，并加入 50% 甘油以达到终浓度为 0.2%。用铝箔覆盖烧瓶或烧杯的开口，并用高压灭菌胶带固定在玻璃器皿上。培养基高压灭菌后，在磁力搅拌器上以低速冷却至约 55 至 65 摄氏度，以保持活性炭处于悬浮状态。在带有磁力搅拌器的生物安全柜中进行无菌操作时，揭开培养基的铝箔，分别向2升锥形瓶或1升烧杯中加入100毫升或50毫升OADC补充剂，并继续混匀。使用带有8个或12个滤芯吸头的多通道移液器，从试剂储液槽或烧杯中向96孔微孔板的每孔加入200 µL 7H11-OADC-活性炭培养基，操作应迅速，以避免琼脂凝固和气泡产生。将CARA微孔板堆叠后放入可密封的塑料袋中，防止干燥，并在4°C下保存。将耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）接种于含有4毫升或20毫升Middlebrook 7H9-ADN或7H9-OADC培养基的聚丙烯圆底或锥形离心管中，接种量使OD580达到0.01至0.1。将耻垢分枝杆菌培养物在37°C、20% O2条件下振荡培养，使其生长至对数中期，即OD580约为0.5。为在复制和非复制条件下进行最小抑菌浓度（MIC）类型的实验，将OD580为0.01的7H9-ADN培养液中的菌悬液200 µL接种至透明平底、经组织培养处理的96孔板的每个孔中。对于非复制性实验，使用含有0.02% tyloxapol的PBS洗涤细胞两次，并使用非复制性培养基重悬细胞。用非复制性培养基将细胞稀释至OD580为0.1，并从新配制的1摩尔储备液中加入硝酸钠，使其终浓度为0.5至5毫摩尔。将OD580为0.1的细胞悬液200微升均匀分配至透明底、经组织培养处理的96孔板的所有孔中。根据文本方案配制测试试剂后，向A至E行各孔加入2微升测试试剂一，向E至H行各孔加入2微升测试试剂二，并充分混匀。进行重复实验时，将耻垢分枝杆菌微孔板在37°C、20% O₂和5% CO₂条件下孵育1至48小时。在将 CARA 作为检测读数的时间点，使用设置为 50 至 75 微升的 p200 多通道移液器，通过上下吹打 5 到 10 次，小心地重悬 MIC90 样式测定板中各孔的内容物。然后使用移液器吸头轻轻以环形方式搅动各孔中的内容物。将未稀释的测定孔内容物各 10 微升转移至 CARA 微孔板的对应孔中，转移过程中避免飞溅，并确保 10 微升的样品准确点加至 CARA 微孔板各孔的中央位置。使用板带将CARA微孔板堆叠固定，然后放入可重复密封的塑料袋中。将M. smegmatis CARA微孔板在37摄氏度、20% O₂条件下孵育，复制型培养板孵育一至两天，非复制型培养板孵育两至三天。当阴性对照孔中出现细菌生长的菌膜或较大的肉眼可见菌落时，使用一套12个p200吸头配合多通道移液器，沿孔壁加入40 µL无菌PBS，使PBS覆盖在琼脂/细菌微菌落表面并均匀分布。通过将5毫克刃天青与50毫升含5%吐温80的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，制备CARA显色试剂。向CARA微孔板的每个孔中加入50微升新配制的CARA显色试剂。随后轻轻前后摇动微孔板数次，以帮助试剂在各孔的琼脂和细菌层中均匀分布。将平板放入可重复封口的塑料袋中，于37摄氏度孵育至少30分钟（适用于M.smegmatis）。在读取荧光前，将CARA微孔板置于生物安全柜中，室温下静置15分钟，并移除盖子。若在生物安全柜外使用BSL3级分光光度计，需在微孔板表面贴上光学级PCR封膜，并用柔软的纸巾轻轻按压封膜表面，确保密封紧密。通过顶部读取方式检测荧光，激发波长为 530 纳米，发射波长为 590 纳米。无需对酶标板进行空白校正。数据分析时，将抑制剂浓度以 log10 标度绘制在 X 轴上，荧光值以线性标度绘制在 Y 轴上。更多细节请参见文字版实验方案。导致CARA荧光无法升高至背景水平以上的测试剂浓度即为CARA-MBC ≥ 99，此处已显示。下标“≥ 99”表示CARA-MBC提供的测试剂浓度估计值可实现大于等于两个对数单位（log10）的细菌杀灭效果。如果化合物显示出静态窗口（定义为 MIC 与 CARA 曲线之间向右偏移超过四倍），则怀疑其具有抗生素后效应。静态窗口表明，对复制中的结核分枝杆菌具有活性的分子可能是抑菌性的，而非杀菌性的。对于具有强效抗生素后效应的分子，静态窗口可能难以观察，仅在扩大 CARA 荧光 Y 轴范围后才能显现，如此处所示。此处展示了通过 MIC90 和 CARA 检测的复制性和非复制性活性分子。尽管异烟肼和利奈唑胺在 MIC90 检测中表现出对非复制性细菌的活性，但 CARA 结果表明，在所测试的非复制性条件下，它们并无活性。在此 CARA 实验中，将 M. smegmatis 暴露于浓度递增的利福平后，仅一小时即观察到影响，并在三至 24 小时内表现出逐渐增强的杀菌活性，在 24 小时时于约 10 微克/毫升浓度下杀灭细菌数量达到或超过 2 至 3 个 log₁₀。一旦掌握，该技术可在大约两小时内完成平板制备，不到一小时内将细胞转移至 CARA 平板，并在适当操作下，用大约一到两小时完成 CARA 平板的荧光显影与测量。在进行该实验时，重要的是要牢记将 CARA 作为一种预测性检测方法，用于判断化合物对正在复制或非复制状态的分枝杆菌是否具有杀菌或抑菌活性。观看本视频后，您应能充分理解如何建立 CARA 实验体系，并以有助于预测化合物活性类型的方式分析数据。感谢观看，祝您的实验顺利。

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