LED热流量 - 结合光遗传学与流式细胞仪
2016年12月30日
光学受控物质是研究信号通路的有力工具。为了扩大可能的实验范围，我们开发了一种使用流式细胞术实时研究光学受控物质的设备：LED Thermo Flow。
该方法的总体目标是在流式细胞术测量过程中刺激光学受控物质。这种新型设备通过将光学控制物质的强大功能与流式细胞术相结合，可以帮助回答细胞信号传导领域的关键问题。首次可以使用流式细胞术对光遗传学工具进行表征和分析。
直到今天，还没有类似的既定方法存在。首先，以每毫升 100 万个细胞的浓度悬浮转导的 Ramos B 淋巴细胞，并将它们转移到玻璃 FACS 管中。接下来，将流式细胞仪的黑色 O 形圈更换为橡胶 O 形圈，并涂抹硅脂以形成更好的密封。
将玻璃管插入流式细胞仪中，并在关灯的情况下将 LED 原型放在管周围。测量 GFP 通道中 Dronpa 的荧光强度。该程序最关键的步骤是处理玻璃管。
玻璃 FACS 管非常脆弱，因此，建议在进行实验之前练习将玻璃管插入细胞仪。然后，打开管外侧的 500 纳米 LED 灯，继续测量 Dronpa 的荧光强度。增加 LED 灯的强度，直到 Dronpa 荧光强度降低，以估计所需的最小光强度，以便测量 Dronpa-Linker-Dronpa 蛋白的光开关。
接下来，在管外打开原型的 400 纳米 LED 灯，继续测量 Dronpa 的荧光强度。增加 400 纳米 LED 灯的光强度，直到 Dronpa 荧光强度增加。首先按照随附文本协议中的设计和制造说明制造光开关 LED 器件的内层和外层。
将 400 和 500 纳米波长的 LED 插入设备的通道。将它们粘到位并按照指示接线。这些特定波长将用于在 Dronpa-Linker-Dronpa 融合蛋白的暗态和亮态之间切换。
然后，组装设备并确保它是防水的，以防止在给变压器通电之前泄漏。设备组装后，收获 Ramos B 淋巴细胞并将其悬浮在每毫升 3 至 1000 万个细胞的密度中。将 600 微升细胞转移到玻璃 FACS 管中。
将它们放在冰上并保护细胞避光，直到测量它们。将组装好的设备连接到加热水泵，并将温度调节到 37 摄氏度。然后，小心地将玻璃 FACS 管插入设备并将其连接到流式细胞仪。
在 GFP 通道中记录 Dronpa 荧光强度。这种光遗传学设备的设计包括一个腔室，该腔室可以连接到循环水源，以将样品温度保持在恒定值。虽然该设备发射了三种不同的波长，但当 37 摄氏度的水流过设备时，FACS 样品中的温度仅略有升高。
克隆 Dronpa-Linker-Dronpa 融合构建体并转导到 Ramos B 细胞中。当 500 纳米光源直接进入单体状态时，发射强度降低。然后，一旦光源切换到 400 纳米光，Dronpa 单体迅速变为二聚体状态，强度迅速增加。
使用该设备，胞质 Dronpa-Linker-Dronpa 融合蛋白能够多次进行光开关。切换到暗态的速度很慢，而切换到亮态几乎是瞬间发生的。Dronpa 在黑暗中的自发荧光恢复表明，有效地光切换到明亮形式需要特定的照明，并且只能缓慢地自发发生。
动力学分析表明，光开关速度总体上非常可重现，即使在黑暗中长时间孵育后，在没有光开关的情况下也只能恢复大约 10% 的荧光。按照此程序，可以进行任何流式细胞术分析，包括钙通量测量，以探索您选择的光遗传学工具的功能。开发完成后，这项技术将为光遗传学领域的研究人员探索细胞信号通路的布线铺平道路。
观看此视频后，您应该对如何为您的特定光遗传学工具建立光开关方案有很好的了解。不要忘记紫外线可能非常危险，执行此程序时应始终佩戴预防措施，例如防护眼镜。
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概述
本文介绍了一种用于实时研究光学控制物质的新型设备，该设备使用流式细胞术。通过将光遗传学工具与流式细胞术测量相结合，研究人员可以探索细胞信号传导中的关键问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞信号传导
- 光遗传学
- 流式细胞术
背景
- 光学控制物质对于研究信号传导途径很有价值。
- 流式细胞术允许分析细胞群体。
- 以前的方法没有结合这两种强大的技术。
- 本研究引入了一种能够实现这种集成的设备。
研究目的
- 在流式细胞术测量过程中刺激光学控制物质。
- 使用流式细胞术表征和分析光遗传学工具。
- 提供一种研究细胞信号传导的新方法。
使用的方法
- 将转导的Ramos B淋巴细胞以每毫升一百万个细胞的浓度悬浮。
- 将细胞转移到玻璃FACS管中。
- 用橡胶O形圈替换流式细胞术仪的黑色O形圈。
- 涂抹硅脂脂肪以确保更好的密封。
主要结果
- 该设备成功地将光遗传学刺激与流式细胞术集成。
- 允许实时分析细胞信号传导途径。
- 首次实现对光遗传学工具的表征。
- 解决了现有细胞信号传导研究方法的空白。
结论
- 这种新型设备代表了细胞信号传导研究的重大进展。
- 它为使用光学控制物质的研究开辟了新途径。
- 未来的研究可以利用这种方法来探索复杂的信号传导途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
