Name: IL-22表达淋巴细胞使用记者小鼠的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习利用转基因报告基因小鼠模型在体内可视化IL-22表达淋巴细胞的方法。该技术可追踪细胞因子产生细胞，适用于免疫学研究和炎症性肠病模型分析。

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感谢 Kelli Czarra 和 Megan Karwan 提供的动物实验技术协助，Kathleen Noer 和 Roberta Matthai 提供的流式细胞术协助，以及 Donna Butcher 和 Miriam R. Anver 提供的病理学分析。本项目获得了 Ely 和 Edythe Broad 基金会资助（资助对象：Scott Durum），并全部或部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所联邦资金支持，合同编号为 HHSN261200800001E（MRA）。

所有动物均按照2011年癌症研究弗雷德里克国家实验室动物实验管理委员会制定的《实验动物护理和使用指南》中所述实验程序接受了适当的护理。
1. 通过BAC重组工程生成IL-22-tdTomato报告小鼠
注意：小鼠应处于无意识状态，且对有害刺激无任何反应。使用70%乙醇对术区进行消毒，并使用玻璃珠灭菌器对所有手术器械进行灭菌。
<ol>
	<li>使用碱性提取法纯化BAC DNA（RP23-401E11，克隆长度228391 bp）10,11用5 µg的RP23-401E11进行SpeI酶切，以鉴定BAC克隆，确认目的基因的正确大小。注：BAC DNA被切割为14个片段。</li>
	<li>将 TdTomato 报告基因插入 PLD53SC-A-GFP-B 穿梭载体的 Not I/Sal I 位点11 并用同一位置的 GFP 基因替换。然后，以 BAC RP23-401E11 为模板，扩增同源臂（A 和 B）至第一个翻译外显子 Il-22 （第1外显子）通过PCR扩增（95 °C预变性2 min；30个循环：95 °C 30 sec、55 °C 30 sec、72 °C 30 sec；最后72 °C延伸10 min）。在50 µl PCR反应体系中，加入50 ng（1 µl）BAC DNA、0.5 µl引物（10 µM）、40 µl高保真PCR SuperMix以及8 µl H₂O2O. 
	注意：A盒和B盒的引物序列如下：A盒上游：5'- TGGCGCGCCGGAGCTGTGAAGAAAG 和反向：5'- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC；B框正向：5'- GTTAATTAACTGCCCGTCAACA 和 反向：5'- TGGCCGGCCTGAGCACCTGCTT CATC10限制性内切酶（Asc I 和 Pac I）的识别位点已用下划线标出。</li>
	<li>将500 ng经Asc I消化的A片段与500 ng经Pac I消化的B片段连接至50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) 载体中，16 °C反应1小时。</li>
	<li>将纯化的PLD53SC-ATB载体转化至BAC感受态细胞中11 在含有氯霉素（20 µg/ml）和氨苄青霉素（30 µg/ml）的LB琼脂平板上于37 °C培养。从氯霉素/氨苄青霉素主平板上挑取两到三个共整合子菌落。</li>
	<li>将每个菌落接种至1 ml添加了20 µg/ml氯霉素的LB培养基中，于37 °C、225 rpm条件下培养1小时。取每种混合液100 µl涂布于含有氯霉素和4–4.5%蔗糖的LB琼脂平板（10 g蛋白胨140、5 g酵母提取物、12 g琼脂、1 L水；pH 7.5）上。于37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取大小不同的菌落，重新划线接种于两个含氯霉素的LB琼脂平板上。随后，将平板分别暴露于紫外光下或避光处理30秒，挑选对紫外光敏感的菌落进行后续分析。</li>
	<li>使用 tdTomato/IL-22 杂合引物（正向：5' ACT TgT gCg ATC TCT gAT ggT；反向：5' TgT AAT Cgg ggA TgT Cgg C）通过 PCR 鉴定修饰后的 BAC DNA。PCR 扩增条件如下：95 °C 预变性 2 分钟；30 个循环（95 °C 变性 30 秒，56 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。</li>
	<li>通过大提物质粒BAC DNA的直接测序，确认BAC修饰区域的序列12.</li>
	<li>将显微注射后的合子移植到假孕的 C57BL/6c 小鼠体内时，通过腹腔注射 0.25% 三溴乙醇麻醉受体小鼠。</li>
	<li>使用5 µl限制性内切酶Pi-SceI在100 µl反应体系中消化IL-22-tdTomato BAC质粒（10 µg）以线性化，随后将线性化的BAC DNA显微注射至C57BL/6雌性小鼠受精卵的原核期卵母细胞中13通过标准程序提取尾部组织活检的DNA，并进行Southern印迹分析以筛选转基因小鼠。</li>
</ol>
2. 脾脏、胸腺、淋巴结和派尔集合淋巴结的单细胞制备
注意：IL-22-tdTomato 报告基因小鼠饲养于国家癌症研究所（NCI，美国马里兰州弗雷德里克）。安乐死方法符合美国兽医协会（AVMA）最新的《安乐死指南》。所有小鼠均通过吸入 CO2 实施安乐死14。
<ol>
	<li>将 IL-22-tdTomato 小鼠置于 CO2 室内实施安乐死，然后将其放置于洁净垫上。用 70% 乙醇喷洒腹部皮肤进行消毒，剪开皮肤。取出左侧 flank 处的脾脏以及胸骨后方的胸腺。</li>
	<li>为获取肠系膜淋巴结（位于肠系膜组织中）和派伊尔结（散布于小肠回肠段的小型淋巴滤泡），首先使用尖端带细齿的解剖镊夹取靠近小肠壁的乳白色肠系膜淋巴结，随后将整个小肠和结肠从体内取出。沿肠道寻找延伸的椭圆形结构（即派伊尔结），并用剪刀剪下。将这些淋巴组织（淋巴结和派伊尔结）分别置于两片磨砂载玻片之间，在冰上的 PBS/1% 胎牛血清（FBS）缓冲液中研磨成单细胞悬液。</li>
	<li>使用与步骤 2.2 相同的方法剪碎脾脏或胸腺组织。将脾细胞悬液在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 8 分钟。每份脾脏样品的细胞沉淀中加入 1 ml ACK 裂解缓冲液。</li>
	<li>充分混匀，静置 1 分钟。向每个样品中加入 9 ml 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 8 分钟，以去除红细胞。 
	注意：切勿向胸腺细胞中添加 ACK 裂解缓冲液。</li>
	<li>将所得白细胞重悬于 5 ml PBS 中，并通过 100 µm 细胞滤网过滤。在 500 × g 条件下离心 8 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 ml RPMI 培养基或 FACS 缓冲液中，使用 0.4% 台盼蓝染液/PBS 溶液计数活细胞。</li>
</ol>
3. 从小肠中分离上皮内淋巴细胞和固有层细胞
<ol>
	<li>按照步骤2.1打开腹部皮肤，从十二指肠（靠近胃部）至回肠（接近阑尾）处剪取小肠，并剪取肛门上方的整个结肠。使用镊子去除多余的脂肪组织和肠系膜组织。立即将肠道组织置于预冷的PBS中。</li>
	<li>沿小肠远端区域寻找派伊尔结（Peyer's patches，即小的粗糙结节）。用镊子去除这些结节，并用剪刀将肠管纵向剪开。用10 ml预冷的PBS彻底冲洗肠道。</li>
	<li>将组织置于20 ml预消化缓冲液（含5 mM EDTA和1 mM二硫苏糖醇的Hank's平衡盐溶液（HBSS））中，在37 °C、缓慢旋转（50 rpm）的摇床中孵育30分钟。每次孵育后，通过剧烈涡旋（12,000 rpm，30秒）去除含有上皮内淋巴细胞（IELs）的上皮细胞层，并将所有组织通过100 µm细胞筛网过滤。</li>
	<li>向组织中加入20 ml新鲜EDTA溶液，在37 °C下进行第二次孵育，持续30分钟。将IEL组分通过100 µm细胞筛网过滤，并与前次收集的组分合并。将剩余的肠组织碎片置于冰上，留待步骤3.9处理。</li>
	<li>将合并的IEL组分在4 °C下以800 × g离心5分钟。用10 ml HBSS/5% FBS洗涤合并的IEL组分，并在800 × g、4 °C下再次离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于8 mL 44%胶体二氧化硅培养基中15，并在其上覆盖5 mL 67%胶体二氧化硅培养基。将44%/67.5%的细胞混合梯度在室温下以1,500 × g离心20分钟。</li>
	<li>从界面处收集IEL细胞。首先用1 ml移液器移除上清液的顶层（约5 ml）。然后，收集胶体二氧化硅培养基梯度界面处的IELs。</li>
	<li>加入10 ml RPMI培养基洗涤IELs，在800 × g、4 °C下离心5分钟。将IELs重悬于5 ml RPMI中，用于步骤3.15。</li>
	<li>为分离固有层淋巴细胞（LPLs），使用剪刀将步骤3.4中获得的肠组织碎片剪成约1 mm的小片，并用10 ml消化缓冲液（含0.05 g胶原酶、0.05 g DNase I和0.3 g分散酶II的RPMI/5% FBS）在37 °C下消化15–20分钟。</li>
	<li>将混合物通过70 µm细胞筛网过滤。滤过液中含有释放出的LPLs。</li>
	<li>重复步骤3.9–3.10以彻底消化肠组织碎片（通常需重复3次）。每次将含有LPLs的上清液合并收集。</li>
	<li>在室温下以1,500 × g离心5分钟收集细胞，将沉淀重悬于RPMI/5% FBS中，并通过40 µm细胞筛网过滤。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于10 ml 40:80胶体二氧化硅培养基梯度的40%组分中，并将其覆盖于15 ml离心管中5 ml 80%组分之上。</li>
	<li>在室温下以1,500 × g离心20分钟，进行密度梯度分离15。</li>
	<li>参照步骤3.7的方法收集LPLs。用10 ml PBS洗涤一次，将沉淀重悬于1 ml PBS/1% FBS缓冲液或RPMI培养基中。</li>
	<li>使用0.4%台盼蓝染液/PBS溶液对活细胞（包括IELs和LPLs）进行计数。</li>
</ol>
4. 结肠炎中IL-22-tdTomato的表达
<ol>
	<li>按照步骤 2.1–2.4 所述方法，将 IL-22-TdTomato 小鼠的脾脏制备成单细胞悬液，浓度为 1 × 107 个细胞/ml，溶于无菌 PBS 中。</li>
	<li>使用小鼠 CD4 细胞阴性分离法10 纯化 CD4+ T 细胞。在 PBS/1% FBS 缓冲液中加入抗 CD4-APC 抗体（克隆号 RM4-5，0.5 µl/1 × 106 个细胞）和抗 CD45RB-FITC 抗体（克隆号 16A，0.5 µl/1 × 106 个细胞），于 4 °C 孵育 30 分钟进行标记。</li>
	<li>在 500 × g 条件下、4 °C 离心 5 分钟。用 2 ml PBS/1% FBS 缓冲液洗涤细胞，再重悬于 1 ml PBS/1% FBS 染色缓冲液中。</li>
	<li>将标记后的 T 细胞上机进行流式细胞术分析16。在 T 细胞群中设门，分选 CD4+CD45RBhigh 双阳性细胞（检测波长为 488 nm 和 633 nm 激光）。</li>
	<li>将分选后的细胞在 500 × g 条件下、4 °C 离心 5 分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于无菌 PBS 缓冲液中，浓度为 1 × 106 个细胞/ml。每只 Rag1-/- 受体小鼠腹腔注射 0.5 × 106 个细胞。</li>
	<li>在不同时间点使用 CO2 处死受体小鼠。按照步骤 2.1 和 2.2 所述方法，收集肠系膜淋巴结以及小肠和大肠组织。将每个肠系膜淋巴结及剖开的肠道组织（纸/肠道/纸三明治结构）置于 4% 多聚甲醛（PFA；需在通风橱中操作）中过夜固定。随后用 18% 蔗糖溶液置换 PFA，浸泡 16–24 小时，然后冷冻组织以备切片。</li>
	<li>使用冷冻切片机对组织进行切片17,18,19。将组织切片在室温下平衡约 60 分钟，随后置于丙酮中室温处理 10 分钟。再于室温下干燥约 5 分钟。</li>
	<li>加入过量 FBS，用移液器吸除，然后加入抗 RFP 抗体，按 1:200 比例稀释于 0.1% BSA/1x PBS 中。于 37 °C 孵育 60 分钟。</li>
	<li>用 1x PBS 漂洗切片 10 分钟，然后加入相应的二抗（山羊抗兔 IgG 568），按 1:300 比例稀释于 1% BSA/1x PBS 中，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1x PBS 漂洗载玻片 10 分钟，擦干后加盖盖玻片。</li>
	<li>使用荧光显微镜在一致照明条件下观察所有样本（RFP：激发滤光片 540–580 nm），采用 40X 物镜进行成像。</li>
</ol>

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<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

IL-22 在固有免疫防御和组织重塑中发挥关键作用。产生 IL-22 的细胞已被鉴定 离体 通过细胞内染色。然而，追踪IL-22的表达仍然具有挑战性 原位，无论是在正常状态还是炎症条件下。本方案描述了一种建立IL-22报告小鼠模型的新方法，该模型可使我们定位报告基因表达细胞 体内将编码TdTomato的报告基因插入IL-22基因座中破坏信号序列的位点。该策略使报告基因滞留在产生细胞内，而IL-22则会被迅速分泌，从而实现对报告基因表达细胞的可视化。工程化的IL-22报告基因系统包含于一个大型BAC中，旨在保留调控元件，以确保报告基因的表达模式与IL-22保持一致。转基因小鼠的肠道组织显示，在小肠固有层中的CD4 T细胞和天然淋巴细胞中存在稳态下的报告基因表达。在诱导性结肠炎模型中，结肠中的CD4 T细胞表达该报告基因。
IL-22 在炎症性肠病中的作用尚不明确。IL-22 参与肠道黏膜防御和组织再生，能够诱导产生保护性因子20,<sup class="xref...

报告基因在特定细胞类型中的表达有助于识别在稳态和受扰动状态下组织中活跃表达目标基因的细胞。该方法还可用于分离这些仍保持活性的细胞，以研究它们的其他特性。报告小鼠已被广泛应用于阐明特定细胞因子、转录因子和调控元件的作用机制。以往的策略1,2,3主要依赖于将报告基因敲入小鼠染色体上的目标位点，这一过程耗时且成本较高。因此，亟需一种更为简便的报告小鼠构建方法。
细胞因子是一类广泛存在的小分子分泌型蛋白质/多肽，通过细胞间信号传导调节免疫反应。白细胞介素22（IL-22）是一种具有多种已报道功能的细胞因子，包括维持屏障功能、促进组织修复以及调节炎症反应4尽管IL-22最初被发现是T细胞的产物5，后续研究证实其在人类自然杀伤（NK）细胞中表达6 和小鼠7 以及其他类型的天然淋巴细胞中8尽管已对产生IL-22的细胞进行了广泛观察，但此前对IL-22的可视化仍需要 离体 刺激和通透化后使用抗体进行染色。因此，新型IL-22报告小鼠将是研究IL-22在稳态和致病过程中功能的非常有用的工具。
在此，我们开发了一种简化的转基因报告小鼠模型，用于观察产生IL-22的细胞 体内 和 体外. 采用BAC重组工程方法9我们将带有Poly A信号片段的tdTomato cDNA序列插入IL-22基因座并替换第一外显子。其他非翻译区、外显子及调控元件均未受影响，以尽可能模拟IL-22的天然调控模式。报告基因的插入位点破坏了信号序列，导致报告蛋白在产生细胞内积聚，而与之相反，IL-22本身会迅速被分泌出去。该新方法也可应用于其他分泌蛋白报告小鼠模型的构建。

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>RPCI23.C</td><td>需要基因ID：50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>宝生物工程（Takara Clontech）</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10855-001</td><td>1 L：10 g SELECT Peptone 140，5 g SELECT Yeast Extract，5 g 氯化钠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗小鼠CD3抗体</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD4抗体</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD45抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD45RB抗体</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠RFP抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14175145</td><td>KCl，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，NaCl，D-葡萄糖</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE医疗生命科学</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶II（Dispase II，II型）</td><td>罗氏</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70倒置荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>询价</td></tr><tr><td>尼康Eclipse 80i显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td>询价</td></tr><tr><td>Dynal振荡器</td><td>电子显微镜科学</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD生物科学</td><td></td><td>询价</td></tr><tr><td>LSRII SORP/流式细胞仪</td><td>贝克顿·迪金森公司&amp;nbsp;</td><td></td><td>询价</td></tr></tbody></table>

利用报告基因小鼠可视化表达 il-22 的淋巴细胞

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

报告基因小鼠已被广泛用于观察靶向基因表达的定位。本实验方案重点介绍建立新型转基因报告基因小鼠模型的策略。我们选择可视化白细胞介素（IL）22 基因的表达，因为该细胞因子在肠道中具有重要功能，可促进因炎症而受损组织的修复。与其他检测产物的方法相比，报告基因系统具有显著优势 体内对于IL-22，其他研究首先从组织中分离细胞，然后对细胞进行再次刺激 体外IL-22 通常为分泌性细胞因子，通过药物将其滞留在细胞内，并利用细胞内染色技术进行可视化检测。该方法可鉴定具有产生 IL-22 能力的细胞，但无法确定这些细胞在检测时是否正处于实际分泌状态。 体内报告基因设计包括将荧光蛋白（tdTomato）基因插入IL-22基因中，使得荧光蛋白无法被分泌，因而滞留在产生该蛋白的细胞内 体内荧光产物随后可在组织切片中或通过 离体 通过流式细胞术进行分析。报告基因的实际构建过程包括对含有IL-22基因的细菌人工染色体进行重组工程改造，随后将该工程化染色体导入小鼠基因组。通过流式细胞术分析，在不同小鼠组织（包括脾脏、胸腺、淋巴结、派伊尔集合淋巴结和肠道）中均观察到稳态下的IL-22报告基因表达。通过T细胞（CD4+CD45RBhigh）过继转移，并对报告基因表达进行可视化观察。阳性T细胞首先出现在肠系膜淋巴结中，随后逐渐积聚于远端小肠和结肠组织的固有层内。利用BAC构建的报告系统在模拟IL-22表达方面具有较高的保真度，且相较于基因敲入方法更为简便。

使用重组工程技术修饰携带小鼠 IL-22 基因的细菌人工染色体，构建了小鼠 IL-22 报告基因转基因 IL-22 位点 图1 展示了含有 sacBII 基因（一种正筛选标记）和氯霉素抗性基因的 pBACe3.6 载体的示意图11. 在将 tdTomato 引入第一外显子后，信号肽序列被破坏，如图所示 图2因此，tdTomato 报告基因被保留在表达 IL-22 的细胞内，从而可通过流式细胞术对其进行检测和分选。纯合小鼠由原始 founder 系繁育而来，并通过 PCR 筛选，无需回交即可获得具有稳定遗传背景的后代，这一点不同于常规的基因敲入策略。为验证 IL-22 报告基因的准确性， 体外-生成的脾细胞在Th22或中性条件下培养。 图3 证明 IL-22-tdtomato 在 Th22 细胞中表达良好 体外通过流式细胞术或荧光显微镜检测。 体内，如图所...

本文介绍了一种转基因报告小鼠模型，用于可视化小鼠不同组织中产生IL-22的细胞。该方法可用于追踪小鼠体内其他细胞因子或分泌蛋白的定位。

利用报告基因小鼠可视化表达 IL-22 的淋巴细胞

报告基因小鼠已被广泛用于观察靶向基因表达的定位。本方案重点介绍一种建立新型……的策略。

本小鼠基因改造实验的总体目标是鉴定、分离并表征产生IL-22的免疫细胞。免疫系统的细胞会释放一类称为细胞因子的介质，这些介质负责抵御细菌等外来病原体，并促进受损组织的修复。IL-22即为一种此类细胞因子，已被证实具有多种功能，涵盖组织修复到病理过程等多个方面。据报道，免疫系统中的多种不同细胞类型均能够产生IL-22。为了明确究竟哪些细胞真正产生IL-22，我们开发了一种新型的IL-22报告小鼠。这使我们能够在正常条件下以及炎症性肠病小鼠模型中，鉴定出体内真正产生IL-22的相关细胞。我们还使用报告细胞来纯化表达IL-22的细胞，以确定其其他特性。本文简要概述了报告小鼠的构建方法，并描述了相关分析方法。所述方法可应用于其他基因，用于鉴定表达细胞并纯化具有活性的表达细胞，以便进一步表征。该方法有助于解答免疫学领域中关于IL-22的生物学活性及其产生细胞特性的关键问题。与我共同演示该实验步骤的有来自达勒姆博士实验室的生物学家Julie Hixon、博士后Caroline Andrews以及科研人员Wenqing Li。将tdTomato报告基因插入穿梭载体，替换同一位置的GFP基因后，使用适当细菌人工染色体（BAC）模板，在50 µL PCR反应体系中扩增IL-22首个翻译外显子的A和B同源臂。然后将纯化的载体转化至含有氯霉素和氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上的BAC感受态细菌细胞中，在37摄氏度下培养。孵育结束后，挑取两到三个菌落接种于1毫升LB液体培养基中，加入氯霉素，在37摄氏度、225 rpm条件下培养1小时。随后，取每种混合液100微升涂布于添加了氯霉素和蔗糖的LB琼脂平板上，于37摄氏度过夜培养。第二天早上，将大菌落重新划线接种到含氯霉素的新LB琼脂平板上，小菌落接种到另一块LB琼脂平板上，将平板暴露于紫外光下30秒。随后挑选对紫外光敏感的菌落，使用tdTomato IL-22杂合引物通过PCR确认修饰后的BAC DNA的存在。去除脾脏和胸腺后，使用细齿解剖镊子采集靠近小肠壁的乳白色肠系膜淋巴结。接下来，完整取出小肠和结肠，并使用剪刀沿肠道分离出细长的椭圆形派伊尔结。当所有淋巴组织收集完毕后，在冰上将肠系膜淋巴结与派伊尔结置于含胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，用两片磨砂载玻片研磨成单细胞悬液。以相同方法制备脾脏和胸腺的单细胞悬液后，将脾细胞悬液离心，随后加入一毫升 ACK 裂解缓冲液进行脾脏红细胞裂解。一分钟后，加入九毫升磷酸盐缓冲液（PBS）恢复等渗状态，并再次离心细胞。将沉淀重悬于五毫升 PBS 中，通过 100 微米细胞滤网过滤。然后通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于五毫升 RPI 培养基中，用台盼蓝排斥法进行细胞计数。从十二指肠至回肠取下小肠，并连同整个结肠一起取出后，使用镊子去除肠组织上多余的脂肪和肠系膜组织，立即将肠组

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

IL-22表达淋巴细胞使用记者小鼠的可视化

本实验方案描述了经刺激后可主动分泌IL-17的小鼠TH17淋巴细胞的检测与分离方法。...

检测与分离可存活的小鼠IL-17分泌型T细胞

在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。...

利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。...

一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

本方案描述了如何建立一种报告系统，可用于识别和定量受体-配体相互作用。...

一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统

本文展示了从正常、炎症及恶性小鼠皮肤中 体内 定量白细胞迁移出的实验方法。我们对两种模型进行了直接比较：经皮 FITC 应用与 原位...

量化白细胞通过小鼠皮肤和肿瘤淋巴管的迁移

本方案描述了一种在不改变器官结构的情况下对引流淋巴结中不同细胞群体进行成像的技术。...

利用离体共聚焦显微镜观察淋巴结结构及细胞定位

本文介绍了一种简单的共聚焦成像方法，用于可视化小鼠次级淋巴器官中分泌细胞因子干扰素γ的细胞原位定位。该方案可拓展应用于多种组织中其他细胞因子的可视化研究。...

小鼠脾脏中原位干扰素γ产生的成像 单核细胞增生李斯特菌 感染

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

2型固有淋巴细胞（ILC2s）参与2型炎症反应，主要在应对蠕虫感染、过敏性疾病、代谢稳态以及组织修复中发挥作用。本研究展示了一种从小鼠鼻黏膜中分离ILC2s并检测其CD226表达水平的方法。...

从小鼠鼻黏膜中分离2型固有淋巴细胞以检测CD226的表达

表达IL-9的T细胞和ILC2细胞在……期间被诱导产生 N. brasiliensis 感染，但由于其频率较低且动力学特征不同，这些细胞在受感染肠道中的表征在很大程度上被忽视。本方案描述了从不同靶器官中分离这些细胞并鉴定其身份的方法。 通过...

一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略

我们描述了一种利用流式细胞术从小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中分离细胞并进行过继性细胞转移的方法。该方案旨在验证TILs在同基因型胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌的过继性细胞治疗开发提供依据。...

基于流式细胞术分离及在胰腺癌小鼠模型中对肿瘤浸润淋巴细胞进行治疗效果评估

学习利用转基因报告基因小鼠模型在体内可视化IL-22表达淋巴细胞的方法。该技术可追踪细胞因子产生细胞，适用于免疫学研究和炎症性肠病模型分析。

利用报告基因小鼠可视化表达 IL-22 的淋巴细胞

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