利用报告基因小鼠可视化表达 IL-22 的淋巴细胞

本小鼠基因改造实验的总体目标是鉴定、分离并表征产生IL-22的免疫细胞。免疫系统的细胞会释放一类称为细胞因子的介质，这些介质负责抵御细菌等外来病原体，并促进受损组织的修复。IL-22即为一种此类细胞因子，已被证实具有多种功能，涵盖组织修复到病理过程等多个方面。

据报道，免疫系统中的多种不同细胞类型均能够产生IL-22。为了明确究竟哪些细胞真正产生IL-22，我们开发了一种新型的IL-22报告小鼠。这使我们能够在正常条件下以及炎症性肠病小鼠模型中，鉴定出体内真正产生IL-22的相关细胞。

我们还使用报告细胞来纯化表达IL-22的细胞，以确定其其他特性。本文简要概述了报告小鼠的构建方法，并描述了相关分析方法。所述方法可应用于其他基因，用于鉴定表达细胞并纯化具有活性的表达细胞，以便进一步表征。

该方法有助于解答免疫学领域中关于IL-22的生物学活性及其产生细胞特性的关键问题。与我共同演示该实验步骤的有来自达勒姆博士实验室的生物学家Julie Hixon、博士后Caroline Andrews以及科研人员Wenqing Li。将tdTomato报告基因插入穿梭载体，替换同一位置的GFP基因后，使用适当细菌人工染色体（BAC）模板，在50 µL PCR反应体系中扩增IL-22首个翻译外显子的A和B同源臂。

然后将纯化的载体转化至含有氯霉素和氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上的BAC感受态细菌细胞中，在37摄氏度下培养。孵育结束后，挑取两到三个菌落接种于1毫升LB液体培养基中，加入氯霉素，在37摄氏度、225 rpm条件下培养1小时。随后，取每种混合液100微升涂布于添加了氯霉素和蔗糖的LB琼脂平板上，于37摄氏度过夜培养。

第二天早上，将大菌落重新划线接种到含氯霉素的新LB琼脂平板上，小菌落接种到另一块LB琼脂平板上，将平板暴露于紫外光下30秒。随后挑选对紫外光敏感的菌落，使用tdTomato IL-22杂合引物通过PCR确认修饰后的BAC DNA的存在。去除脾脏和胸腺后，使用细齿解剖镊子采集靠近小肠壁的乳白色肠系膜淋巴结。

接下来，完整取出小肠和结肠，并使用剪刀沿肠道分离出细长的椭圆形派伊尔结。当所有淋巴组织收集完毕后，在冰上将肠系膜淋巴结与派伊尔结置于含胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，用两片磨砂载玻片研磨成单细胞悬液。以相同方法制备脾脏和胸腺的单细胞悬液后，将脾细胞悬液离心，随后加入一毫升 ACK 裂解缓冲液进行脾脏红细胞裂解。

一分钟后，加入九毫升磷酸盐缓冲液（PBS）恢复等渗状态，并再次离心细胞。将沉淀重悬于五毫升 PBS 中，通过 100 微米细胞滤网过滤。然后通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于五毫升 RPI 培养基中，用台盼蓝排斥法进行细胞计数。

从十二指肠至回肠取下小肠，并连同整个结肠一起取出后，使用镊子去除肠组织上多余的脂肪和肠系膜组织，立即将肠组织置于冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。用镊子采集小肠远端区域的派尔集合淋巴结（Peyer's patches）。然后使用剪刀将肠组织纵向剪开，并用10毫升冰冷的PBS彻底冲洗组织。

将样品转移至20毫升预消化缓冲液中，在37摄氏度、50 rpm条件下于摇床中进行两次30分钟孵育，每次孵育开始时在12,000 rpm下涡旋震荡组织30秒，并在每次孵育结束时将所有组织碎片通过100微米细胞筛网，以收集上皮细胞层。接着，向细胞悬液中加入20毫升新鲜EDTA溶液，在37摄氏度下继续振荡孵育30分钟，孵育结束后按前述方法过滤并冷却肠上皮细胞。将剩余的肠组织碎片置于冰上，通过离心收集合并的肠上皮细胞，随后用10毫升含FBS的HBSS洗涤一次。

将洗涤后的沉淀重悬于8 mL的44%胶体二氧化硅培养基中，并在细胞悬液上层覆盖5 mL的67%胶体二氧化硅培养基。通过离心分离细胞，使用1 mL移液器移除上层5 mL细胞分离介质。然后收集界面处的细胞，并用10 mL RPMI培养基洗涤肠上皮细胞，将沉淀重悬于5 mL新鲜RPMI培养基中。

按照上述方法制备IL-22 td-Tomato小鼠的单细胞脾细胞悬液后，将细胞重悬于无菌PBS中，浓度为每毫升1 × 10⁷个细胞，并使用小鼠CD4细胞阴性分离法纯化CD4阳性T细胞。接着，在4°C条件下，用抗CD4和抗CD45RB抗体对T细胞孵育标记30分钟。

孵育结束后，通过离心收集细胞，随后用两毫升含FBS的PBS洗涤。将洗涤后的细胞沉淀重悬于一毫升新鲜的含FBS的PBS中，通过流式细胞术根据CD4与CD45RB的共表达情况分选标记的T细胞。当所有细胞分选完成后，再次通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于无菌PBS中，调整浓度至每毫升一乘以十的六次方个细胞，用于注射至RAG1基因敲除小鼠受体。

为了构建小鼠 IL-22 报告基因转基因，采用重组工程对携带 IL-22 基因座的细菌人工染色体进行修饰，该染色体还包含一个正向筛选标记和一个氯霉素抗性基因。将 tdTomato 插入第一外显子后，信号肽序列被破坏，从而使 tdTomato 报告蛋白滞留在表达 IL-22 的细胞内，进而可通过流式细胞术对其进行检测和分选。为了验证 IL-22 报告基因的准确性，可在 Th22 或中性条件下体外培养脾细胞，并通过流式细胞术和荧光显微镜观察 IL-22 tdTomato 的表达情况。

在体内，稳态条件下可在不同小鼠组织中检测到IL-22报告信号，大部分信号来自肠道固有层细胞，而在腋窝淋巴结、脾脏或胸腺中未检测到信号。在通过将报告基因标记的CD4阳性CD45RB高表达T细胞转移至RAG1基因敲除小鼠所建立的小鼠结肠炎模型中，首先在肠系膜淋巴结中观察到tdTomato报告信号，随后信号逐渐累积于远端小肠和结肠组织的固有层中。在进行该操作时，务必注意选择正确的BAC克隆。

完成该实验步骤后，可利用这种报告小鼠开展其他方法，例如建立肺部或皮肤感染模型，以进一步探究IL-22在宿主防御和组织修复中的作用。该技术一经建立，便为免疫学领域的研究人员探索在小鼠模型中表达水平较低的分泌蛋白功能铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建转基因报告小鼠，以及如何在体外和体内鉴定IL-22报告基因。