Name: 鼠标离体肾技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习小鼠离体灌注肾脏技术，通过中位开腹手术分离肾脏，在体外维持一小时功能，排除血压和激素等全身因素影响，用于研究急性肾损伤机制和孤立器官功能。

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作者谨向 Hans-Joachim Schurek 致以衷心感谢，感谢他提供的宝贵科学建议。作者还感谢 Monique Carrel 和 Michèle Heidemeyer 提供出色的技术支持，感谢 David Penton Ribas 和 Nourdine Faresse 对手稿的审阅，以及 Carsten Wagner 和 Jürg Biber 提供 NaPi-2a 抗体。本研究得到了瑞士国家能力研究中心“Kidney.CH”以及瑞士国家科学基金会项目资助（项目编号：310030_143929/1）的支持。

本手稿中涉及动物的所有操作均依照瑞士法律进行，并已获得瑞士苏黎世州兽医管理局的批准。
1. 缓冲液配制
<ol>
	<li>配制溶液 1 - 4 及抗利尿激素（ADH）溶液（表 1）。</li>
	<li>配制透析缓冲液（表 1）。 
	注意：该缓冲液用于灌流过程中的透析。之后，将红细胞用此缓冲液稀释以制备最终灌流液。</li>
	<li>红细胞制备。
	<ol>
		<li>取 250 ml 人红细胞浓缩液（从当地血库获得的检测样品），用透析缓冲液稀释至 500 ml。在 2,000 × g 条件下离心 8 分钟。小心去除上清缓冲液，避免移除任何红细胞。重复此步骤 3 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制白蛋白（牛血清白蛋白；BSA）缓冲液。
	<ol>
		<li>在 200 ml 透析缓冲液中，使用搅拌子溶解 44 g BSA。用滤纸过滤溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备灌流液。
	<ol>
		<li>将步骤 1.3.1 中的红细胞通过滤纸过滤至 BSA 缓冲液中。用透析缓冲液定容至总体积 800 ml。 
		注意：此即最终灌流液。此时血细胞比容应在 8% 至 12% 之间。灌流液可在 4 °C 下保存最多 12 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 启动透析和氧合
<ol>
	<li>开启环绕大缓冲液储液罐、小缓冲液储液罐以及湿润室（一个双层小室，用于后续放置肾脏，需预热至 37 °C 并保持 100% 湿度）的水浴，设置温度为 37 °C（图 2）。</li>
	<li>向大缓冲液储液罐中加入透析缓冲液，向小储液罐中加入灌注液。</li>
	<li>打开 5% CO2/95% O2 混合气体对透析缓冲液的通气。</li>
	<li>启动灌注液与透析缓冲液之间的连续透析。注意使用低通量透析管。继续进行第 3 步。</li>
</ol>
<img alt="细胞周期示意图，包含分子生物学研究中的各个阶段及转换过程。" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：灌流回路的示意图。 该示意图展示了灌流回路的主要组件及缓冲液流动方向。所有被深蓝色框包围的组件均通过水浴/恒温器维持在 37 °C。 1： 透析缓冲液体积至少为灌流缓冲液的 3 倍，并持续用 95% O2/5% CO2 气体鼓泡。 2： 透析缓冲液与灌流缓冲液在透析管中通过蠕动泵持续进行相互透析。 3： 由于该透析过程，灌流缓冲液被富集为含 9% O2/5% CO2 的环境，且电解质水平在整个灌流过程中保持恒定。 4： 蠕动泵将灌流缓冲液推向肾脏。 5： 憋压装置（windkessel）用于消除蠕动波并作为气泡捕获器。 6： 压力传感器（连接至 4.（蠕动泵）），可在允许自由交替流动的同时维持持续压力。 7： 在整个灌流过程中，肾脏始终置于湿润腔室内，以保持 100% 空气湿度及 37 °C 的肾脏温度。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 手术步骤第一部分（所有结扎位置的示意图见图3）
注意：所有缝合均使用 5-0 外科缝线进行。
<ol>
	<li>通过腹腔注射麻醉小鼠（每克体重10 µl，含20 mg/ml 氯胺酮和1 mg/ml 哌替啶溶于0.9% NaCl中）。通过检测后肢反射是否消失来确认麻醉深度足够。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定在湿润的培养皿中，用兽用眼膏保护眼睛。将1 ml 注射器置于脊柱下方以抬高腰血管。</li>
	<li>使用剪刀从耻骨嵴至胸骨做正中腹切口，依次切开皮肤和腹肌。</li>
	<li>取出肠管并将其置于小鼠腹部左侧外侧。</li>
	<li>游离膀胱周围的结缔组织，暴露双侧输尿管及尿道。</li>
	<li>在左侧输尿管上放置结扎线（结扎线 I），并收紧结扎。</li>
	<li>在尿道上放置结扎线（结扎线 II），并收紧结扎。</li>
	<li>在膀胱整体周围放置一个“套索”式结扎线（结扎线 III）。</li>
	<li>在膀胱上做1 mm的切口。</li>
	<li>用2 cm长的PE 50导管插入切口进行插管。</li>
	<li>将结扎线III在导管周围收紧固定。</li>
	<li>在结扎线远端切断左侧输尿管和尿道。此时膀胱仅通过右侧输尿管连接，可自由活动。</li>
	<li>清除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪。</li>
	<li>在腹主动脉中段位置放置一结扎线（结扎线 IV）。</li>
	<li>在膈肌下方、肠系膜上动脉与腹腔干之间，于主动脉上放置一结扎线（结扎线 V）。</li>
	<li>在肠系膜上动脉周围放置一结扎线（结扎线 VI）。</li>
	<li>在右肾动脉下方、左肾动脉上方的主动脉处放置一结扎线（结扎线 VII）。</li>
	<li>在尾静脉复合体（下腔静脉，cava）周围放置一结扎线（结扎线 VIII），然后进入第4步。</li>
</ol>
<img alt="心血管系统示意图，显示颅侧和尾侧血管、主动脉、腔静脉通路。" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：手术期间放置结扎线的示意图。剖腹术后腹腔打开的视图。肠管被移向左侧。L 和 R 分别表示左肾和右肾。黑线表示相应结扎线的位置。结扎线按文中所述顺序依次放置并收紧。X 标记为主动脉插管切口的位置。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 灌注管路的预充
<ol>
	<li>启动旋转泵，并用灌注液充满管路。注意排尽所有气泡。</li>
	<li>将风袋装置用灌注液填充至约一半高度。</li>
	<li>当所有管路充满且无流动时，将压力传感器校准至 0 mm Hg。在此期间，保持灌注针处于肾脏水平位置。</li>
	<li>保持恒定的最低流速（0.6 ml/min），然后进入第 5 步。</li>
</ol>
5. 手术步骤 第2部分
<ol>
	<li>在结扎线 IV 与左肾动脉分支之间放置一个夹子。</li>
	<li>在结扎线 IV 尾侧的主动脉上做一个小切口，注意不要切破背侧管壁。</li>
	<li>使用血管扩张器扩张主动脉上的开口。</li>
	<li>用一根针（长 2 cm，拉制的 PE 50 管）插管主动脉，将针尖推至夹子处。</li>
	<li>打开夹子。</li>
	<li>将针尖向头侧推进，直至到达右肾动脉与主动脉的连接处。</li>
	<li>结扎线 VII 扎紧。</li>
	<li>结扎线 IV 扎紧。</li>
	<li>用剪刀剪开胸腔，分离膈肌；通过一次剪切，切断主动脉、下腔静脉、心脏及自主神经。此步骤通过持续深度麻醉下的快速放血使动物安乐死。</li>
	<li>启动灌注泵的压力控制，维持平均压力在 80 至 100 mmHg 之间。</li>
	<li>结扎线 V 扎紧。</li>
	<li>结扎线 VI 扎紧。</li>
	<li>结扎线 VIII 扎紧。</li>
	<li>用剪刀将右肾从结缔组织及其周围的脂肪囊中游离出来。</li>
	<li>在结扎线 V 近端切断主动脉。</li>
	<li>在结扎线 VI 远端切断肠系膜上动脉。</li>
	<li>将支撑肾脏的血管束整体剪下，注意不要损伤血管本身。</li>
	<li>在肝脏与肾脏连接处切断肝脏。注意完全游离肾脏，但保留一小部分肝脏附着于其上，以维持下腔静脉通畅。</li>
	<li>将肾脏血管束从小鼠体内取出，将小鼠移出湿润腔室。</li>
	<li>在肝脏与肾脏连接处绕一圈“套索”状结扎线（结扎线 IX）。</li>
	<li>用静脉导管（2 cm PE 50）插管下腔静脉。</li>
	<li>扎紧结扎线 IX，静脉血应立即通过静脉导管流出。</li>
	<li>关闭湿润腔室。</li>
</ol>
6. 下游分析
<ol>
	<li>在接下来的一个小时内，持续监测血流和血管内压力15。收集静脉流出液，可用于分析肾脏肾素释放等指标7。收集尿液，用于分析电解质浓度和肾小球滤过率14。灌注1小时后，肾脏可速冻用于蛋白质印迹分析，或固定用于成像研究16。</li>
</ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
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<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益，也无其他事项需披露。

小鼠离体灌注肾是一种在可控环境中研究肾功能的工具 离体 1小时，填补了两者之间的空白 在体 在完整动物中进行的实验，可能因多种系统性因素的影响而存在缺陷，以及 体外 在分离的肾单位节段或培养细胞中进行的实验必然忽略了完整器官结构对功能的影响。据作者所知，目前尚无其他替代技术可用于完成此项特定任务。然而，对肾组织的生物化学研究则可通过使用肾组织切片以更为简便的方式开展17尽管目前该技术主要用于研究肾脏生理学，但许多新应用正在被探讨。例如，它可在灌注脱细胞和再细胞化过程中用于肾脏生物工程12此外，正在研究在移植前对肾脏进行长时间的常温灌注，并向灌注液中给予高剂量的抗排斥药物或基因组编辑药物；该研究甚至已进入临床环境8, 9, 10, 11小鼠离体灌注肾是一种理想工具，可用于上述应用，尤其适用于通过基因敲除模型阐明单个基因的功能。
成功实验的关键在于三个步骤。本文为感兴趣的实验室提供了重现该操作流程的方法。首先，缓冲液的配制必须确保肾脏在可重复的条件下获得长期存活所需的...

器官的离体灌注是生理学家数十年来持续研究的课题1。该技术使得在排除血压、激素或神经等全身性影响因素的情况下，对器官功能进行研究成为可能。Carl Eduard Loebell 被认为是最早于1849年描述成功实现离体肾脏灌注的人2。自那时起，灌注装置经历了显著的改进。Frey 和 Gruber 引入了用于氧合的人工肺以及用于连续灌注的脉动泵2。早期研究人员主要研究大型哺乳动物——特别是猪2和狗3——的肾脏，而 Weiss et al. 首次报道使用大鼠肾脏，成为小型哺乳动物器官灌注研究中的一个里程碑4。Schurek et al. 报道，若要实现充分的肾小管氧合，必须在灌注液中添加哺乳动物红细胞5。对于长期实验而言，同一研究团队随后引入的缓冲液连续透析技术至关重要6。2003年，Schweda et al. 首次报道了功能完整的小鼠离体灌注肾脏模型（MIPK）7，之后由 Rahgozar et al.18 和 Lindell et al.14 进一步优化。
尽管小鼠离体灌注肾（MIPK）技术上比大鼠离体灌注肾更具挑战性，但其优势在于能够广泛使用各类基因修饰小鼠。本文详细介绍了作者对离体小鼠肾脏进行1小时灌注的方法。该方法可实现对肾血流速率、血管阻力、激素释放、血气分析、尿液分析以及药物应用的连续评估。操作结束后，肾脏可用于分子与生化分析，或固定后用于显微镜检查，亦可移植至受体小鼠（图1）。
<img alt="使用半合成缓冲液、输入因素和测量输出的肾脏灌注示意图。" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：离体灌注肾脏可能的输入/输出概览。 BGA：血气分析。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
随着移植前长时间常温肾脏灌注技术的兴起（无论是否联合使用抗排斥药物或基因组编辑药物）8,9, 10, 11、脱细胞支架全肾生物工程构建12以及高剂量荧光染料在多光子成像中的应用13，该技术在未来几年内有望受到越来越多的关注。此外，该模型也非常适合用于研究特定基因在急性肾损伤过程中的作用14。
本文提供了一步一步的操作方案，以使其他实验室能够成功进行离体小鼠肾脏灌注。首先，详细说明了缓冲液的组成及配制方法。接着，详细描述了手术过程，并展示了关键操作步骤。第三，展示了代表成功制备的实验数据：包括肾血流量、血管阻力、肾小球滤过率以及电解质排泄分数——这些均为反映组织活性的功能性指标——同时还提供了灌注1小时后固定肾脏的不同肾单位节段的透射电子显微镜形态图像。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;灌注回路：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>湿润室 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>带篮和侧口的插管</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>恒温器 TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V 滚压泵 Reglo 模拟型</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>带夹套的缓冲液储液瓶，1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>带夹套的缓冲液储液瓶，0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器 APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys 传感器</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys 伺服控制器</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB 数据采集系统</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>低通量透析器 Diacap 聚砜膜</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>用于主动脉插管的PE管，内径1.19 mm × 外径1.70 mm</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸单钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-苹果酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>乳酸钠-L-盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>α-酮戊二酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>肌酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>抗利尿激素 dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记菊粉（FITC-Inulin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于红细胞过滤的滤器</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>血气分析：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 透射电镜（TEM）</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠离体灌注肾脏技术

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种用于维持小鼠肾脏在离体状态下 离体 灌流并保持功能状态1小时。这是研究离体器官生理学以及实现未来多种创新应用的前提，包括用于肾脏生物工程的灌流脱细胞化，或高剂量给予抗排斥药物或基因编辑药物以对肾脏进行移植前预处理。在灌流期间，可对肾脏进行操作，评估肾功能，并施用多种药物。操作结束后，肾脏可用于移植，或进行分子生物学、生物化学分析及显微镜检查。
本文描述了灌注液及进行该手术所需的技术 离体 小鼠肾脏灌注。文中提供了灌注装置的详细信息，并展示了肾脏制备物的活性数据：肾血流量、血管阻力和尿液数据作为功能学指标，不同肾单位节段的透射电镜图像作为形态学指标，以及不同肾单位节段转运蛋白的蛋白质印迹作为分子水平的检测结果。

采用所述方法，分离的小鼠肾脏可保持活性至少1小时。我们在持续灌注1小时后检测了组织活性，评估指标包括功能参数（肾血流量和血管阻力、静脉流出液血气分析、肾小球滤过率、尿钠排泄分数）、形态学参数（光镜和电镜下的组织学检查）以及分子生物学参数（细胞凋亡标志物和炎症因子mRNA表达水平）。+ 和 K+ 排泄功能和尿渗透压）以及形态学方法（透射电子显微镜，TEM）对四只野生型 C57Bl/6 小鼠的肾脏进行分析。此外，通过蛋白质印迹法检测不同肾小管节段顶膜标志蛋白的表达，比较同一动物的离体灌注肾脏与未灌注肾脏之间的差异. 在所有实验中，均采用恒压灌注，将灌注压力维持在约 100 mmHg图4）。在这些肾脏中，灌注液流速和血管阻力在55分钟内保持稳定，分别为15.6 ± 0.4 ml/min*g肾重和35 ± 1.0 mmHg*min/ml。图4 A)。灌注液流速降低或血管阻力增加是反映组织活力下降的敏感指标，应在整个灌注过程中密切监测。灌...

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种用于维持小鼠肾脏在离体状态下 离体 灌流并保持功能状态1小时。缓冲液和手术技术有详细描述。

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种在离体条件下维持小鼠肾脏灌注并保持其功能达1小时的技术。这是一种……

本方案的总体目标是在离体灌注的小鼠肾脏中分析其孤立的肾脏功能，排除血压、激素或自主神经系统的影响。该方法有助于回答肾脏病学领域的一些关键问题。深入了解离体器官功能，并作为研究急性肾损伤的精巧工具。IPK 的主要优势在于能够在无系统性影响的情况下研究器官功能。在对小鼠进行手术准备后，使用剪刀从耻骨联合至胸骨做一中等长度的腹正中切口。首先切开皮肤，然后切开腹肌。接着取出肠管并将其置于小鼠腹部左侧。现在，从结缔组织中游离膀胱，并暴露两侧输尿管及尿道。进行这些操作时，使用5-0缝线放置所有结扎线。首先应结扎左侧输尿管，用双外科结牢固结扎。接下来，采用相同技术在尿道周围结扎一道结扎线。然后，在整个膀胱周围放置套索结扎线，但暂不打结。在前三个缝线就位后，使用眼科剪在膀胱上做一个长度为1毫米的切口。沿此切口插入一段长约2厘米的PE-50导管制成的插管。随后收紧结扎膀胱的线结，固定插管。膀胱插管完成后，剪断左侧输尿管和远端结扎线以下的尿道。此时膀胱应仅与右侧输尿管相连，并可自由移动。接下来，清除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪。然后在暴露的腹主动脉中段以及膈肌下方、肠系膜上动脉与腹腔干之间的位置分别结扎。同样将这些结构分别松松地套上结扎线。接下来，在肠系膜上动脉周围放置一根结扎线。然后，在右肾动脉下方与左肾动脉上方之间的腹主动脉处放置第三根结扎线。这是第七根结扎线。最后，在尾静脉束周围放置一根结扎线。现在，在第七根结扎线与左肾动脉分支之间放置一个夹子。然后，在第七根结扎线尾侧的主动脉上做一个小切口，注意不要切破背侧管壁，并用血管扩张器扩大切口。将一根2厘米长的拉细PE-50导管插入切口，将导管尖端轻轻推入夹闭器中，随后打开夹闭器。接下来，将针头尖端向头侧推进，直至到达右肾动脉与主动脉的交汇处。此时结扎第七号结扎线，随后结扎腹主动脉中点处的结扎线。然后用剪刀剪开胸腔，分离膈肌。然后，通过一次切割，分离主动脉、静脉、心脏和植物性神经。现在，启动灌注泵的压力控制，将平均压力维持在80至100毫米汞柱之间。接着，结扎余下的三个未绑扎的主动脉和尾静脉束。用剪刀将右肾从周围结缔组织中游离，并从脂肪囊中释放出来。在肠系膜上动脉和腹腔干之间的结扎线近端切断主动脉。接着，在肠系膜上动脉的结扎线远端切断肠系膜上动脉。现在，去除肾脏的支撑血管束，注意不要切断血管本身。然后，在肝脏与肾脏连接处切断肝脏，但保留一小部分肝脏附着在肾脏上，以便维持下腔静脉的开放。下一步是将肾脏组织束从小鼠体内取出。现在，将肾脏保留在灌注室中，并移除小鼠。在肝脏与肾脏连接处，放置套索结扎线。随后，用静脉导管插管下腔静脉，并收紧套索结扎线。肾脏现在应稳定地置于盒中。静脉回流应通过静脉管路立即开始。尿液流出将在约三分钟后开始。输尿管的蠕动应立即开始，并至少保持稳定一小时。关闭盒子。此时制备已完成，应至少保持一小时的活性。在C57黑6小鼠上应用所述方法后，对四只肾脏进行持续灌注一小时，检测其组织活力。灌注过程中压力维持在100毫米汞柱的恒定水平。四只肾脏的灌注液流量和血管阻力均保持稳定。采用荧光素标记的菊粉清除率评估肾小球滤过率，其预期随时间延长而升高，但升高不显著。在灌注55分钟后测定钠和钾的排泄分数。与体内情况相比，这些参数均有所升高。55 分钟后，尿液的渗透压未超过静脉流出液的渗透压。随后将肾脏固定，并通过透射电镜评估其超微结构。近端小管 S1 段的肾小球结构基本未见改变。部分但并非全部靠近血管束的近端小管升支粗段（S2、S3段）显示出器官损伤的迹象。经进一步观察，远曲小管和集合管未见坏死迹象。总体而言，肾脏的表现与大鼠离体灌注肾脏的文献报道一致。按照此操作步骤，可对组织进行成像分析或蛋白质、RNA分析等后续实验，以获得更深入的研究结果。

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科研

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生物学

鼠标离体肾技术

由于缺血导致的急性肾损伤（AKI）的精确小鼠模型是研究急性肾损伤并可能发现治疗肾脏损伤方法的重要工具。悬挂重物系统提供了一种可立即、可靠地实现肾动脉闭塞和再灌注的工具，且不会引起肾充血。...

使用悬挂式负重系统进行孤立肾动脉阻断

在本视频中，我们描述了从小鼠腹膜后间隙取出肾脏的操作步骤。取出的肾脏可进一步进行显微解剖，以获得一个不含肾包膜及周围脂肪层的完整肾脏。...

从小鼠中提取完整肾脏：一种从小鼠模型中获取无肾包膜肾脏的技术

本视频介绍了从小鼠肾脏中分离完整肾小球的方法。所获得的带囊和去囊肾小球可进一步用于培养小鼠肾脏的壁层上皮细胞外生长物。...

肾小球分离：从小鼠肾脏获取完整肾小球的技术

我们描述了中度和重度缺血-再灌注诱导的肾损伤小鼠模型，其中小鼠分别接受单侧肾蒂夹闭后同时或延迟对侧肾切除术。这些模型均能稳定地导致肾功能障碍和损伤后纤维化，但损伤严重程度和存活率取决于小鼠品系、年龄及手术器械。...

小鼠急性肾损伤的缺血-再灌注模型及损伤后纤维化

为了进行后续应用，需要可靠且高效的肾脏免疫细胞分离技术。该技术要求对少量肾脏免疫细胞进行表面抗体标记。本文介绍了一种简明的肾脏免疫细胞分离方法，该方法似乎能够实现这一目标。...

可靠且高效的肾脏免疫细胞提取方法

本方案提供了一种经济有效的方法，用于分离和鉴定小鼠原代肾小管细胞，随后可对这些细胞进行传代培养，以评估肾脏生物学功能...

小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。...

肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。...

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

本文提供了详细的实验操作指南，使研究人员能够采用一种标准化的模型，在小鼠中实施可逆的单侧输尿管梗阻，从而在长期输尿管梗阻解除后，分析其结构与功能的长期变化结果。...

评估长期单侧输尿管梗阻解除后结构与功能长期转归的小鼠模型

本文介绍了一种缺血性慢性肾病模型，该模型采用单侧肾缺血再灌注损伤，并在样本采集前一日进行对侧肾切除术；该方案可在28天和42天时实现基于血清的功能评估，具有高存活率和可重复的慢性肾病病理特征，为机制研究和干预研究提供了多功能平台。...

由肾脏缺血/再灌注损伤诱导的小鼠急性至慢性肾病转化模型

采用激光散斑对比成像系统监测小鼠右肾切除后单侧肾缺血-再灌注过程中肾微血管血流的变化。...

小鼠肾缺血-再灌注损伤期间通过激光散斑对比成像监测微血管灌注

学习小鼠离体灌注肾脏技术，通过中位开腹手术分离肾脏，在体外维持一小时功能，排除血压和激素等全身因素影响，用于研究急性肾损伤机制和孤立器官功能。

小鼠离体灌注肾脏技术

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