小鼠离体灌注肾脏技术

本方案的总体目标是在离体灌注小鼠肾脏中分析其孤立的肾脏功能，排除血压、激素或自主神经系统的影响。该方法有助于回答肾脏病学领域的一些关键问题。

深入了解离体器官功能，并作为研究急性肾损伤的精巧工具。IPK 的主要优势在于可在排除全身性影响的情况下研究器官功能。在对小鼠进行手术准备后，使用剪刀从耻骨联合至胸骨处进行中等长度的剖腹切口。

首先切开皮肤，然后切开腹肌。接着取出肠管并将其置于小鼠腹部左侧，位于腹部外侧。现在，将膀胱从结缔组织中游离出来，并暴露两侧输尿管及尿道。

进行这些操作时，使用5-0缝线放置所有结扎线。首先结扎左侧输尿管，用双外科结紧密结扎。

接下来，采用相同技术在尿道周围结扎一道结扎线。然后，在整个膀胱周围放置套索结扎线，但暂不打结。在前三个缝线就位后，使用眼科剪在膀胱上做一个长度为1毫米的切口。

在此切口处插入由两厘米PE-50导管制成的套管。随后结扎固定套管，收紧环绕膀胱的结扎线。膀胱插管完成后，从结扎线远端切断左侧输尿管和尿道。

此时膀胱应仅与右侧输尿管相连，并可自由移动。接下来，清除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪。然后，在暴露的腹主动脉中段以及膈肌下方、肠系膜上动脉与腹腔干之间的位置分别放置结扎线。

同样将这些结构分别松解。接下来，在肠系膜上动脉周围结扎一 ligature。现在，在右肾动脉下方、左肾动脉上方的腹主动脉处，放置第三根结扎线。

这是第七根结扎线。最后，在尾静脉束周围打一根结扎线。现在，在第七根结扎线与左肾动脉分叉之间放置一个夹子。

然后，在第七根结扎线尾侧的主动脉上做一个小切口，注意不要切到背侧管壁，并用血管扩张器将切口撑开。将一根2厘米长的拉细PE-50导管插入切口，将管尖轻轻推入夹子内，随后打开夹子。

接着，将针头向头侧推进，直至到达右肾动脉与主动脉的交汇处。现在结扎第七支血管，然后结扎腹主动脉中点处的血管。随后用剪刀解剖膈肌，打开胸腔。

然后，通过一次切割分离主动脉、腔静脉、心脏和自主神经。现在启动灌注泵的压力控制，并将平均压力维持在80至100毫米汞柱之间。接着，结扎主动脉和尾静脉束周围剩余的三个未绑扎的结扎线。

使用剪刀将右肾从周围的结缔组织中游离出来，并从脂肪囊中释放。在肠系膜上动脉与腹腔干之间的结扎线近端切断主动脉。接着，在肠系膜上动脉周围结扎线的远端切断肠系膜上动脉。

现在，去除肾脏的支撑血管束，注意不要切断血管本身。然后，在肝脏与肾脏连接处切断肝脏，但保留一小部分肝脏附着在肾脏上，以便维持下腔静脉的开放。下一步是将肾脏组织束从小鼠体内取出。

现在，将肾脏留在腔室内并移除小鼠。在肝脏与肾脏的连接处，放置一个套索结扎线。然后，用静脉导管插管下腔静脉，并收紧套索结扎线。

肾脏现在应在盒中稳定放置。静脉回流应通过静脉管路立即开始。尿液流出将在大约三分钟后开始。

输尿管的蠕动应立即开始，并至少稳定持续一小时。关闭盒子。此时制备已完成，且应至少保持活性一小时。

在C57黑6小鼠上应用所述方法后，对四只肾脏进行了持续灌注一小时后的组织活力检测。灌注压力维持在100毫米汞柱的恒定水平。四只肾脏的灌注液流量和血管阻力均保持稳定。

采用FITC标记的菊粉清除率评估肾小球滤过率，该值随时间延长而升高，但升高幅度不显著。在灌注55分钟后测定钠和钾的排泄分数。与体内情况相比，这些参数均有所升高。

55 分钟后，尿液的渗透压未超过静脉流出液的渗透压。随后将肾脏固定，并通过透射电子显微镜（TEM）评估其超微结构。近端小管 S1 段的肾小球形态基本保持正常。

部分但并非全部近端小管直部（S2、S3段）出现器官损伤迹象，这些节段位于髓袢升支粗段且不靠近血管束。经进一步检查，远端小管和集合管未见坏死迹象。总体而言，肾脏表现与大鼠离体灌注肾脏的已有报道相一致。

按照此操作步骤，可对组织进行成像分析等检测，随后进行蛋白质或RNA分析，以获得更深入的研究结果。