利用RNA测序来检测新剪接变异体在相关耐药体外癌症模型
December 9th, 2016
这里，我们描述旨在调查异常剪接的耐药性在实体瘤和血液恶性肿瘤的影响的协议。为了这个目标，我们通过RNA测序分析，家长和体外抗车型的转录配置文件，并建立了定量RT-PCR为基础的方法来验证候选基因。
该方案的总体目标是研究实体瘤和血液系统恶性肿瘤体外模型中异常剪接与耐药性特征的关系。该方法可以帮助回答分子药理学和化疗耐药领域的关键问题，例如在转录后水平上耐药的机制是什么？该技术的主要优点是它将成熟的细胞毒性筛选方案与强大的基于下一代测序的转录组学分析相结合。
这项技术可以更好地了解化疗失败的分子机制，并将改善耐药性的早期检测。这种方法可以深入了解细胞系模型中耐药性的全基因组决定因素。但它也可以应用于其他系统，例如主要患者样本和异种移植物。
演示此程序的是阿姆斯特丹癌症中心实验室的技术人员 Johan Fomirno。为了对白血病细胞进行 MTT 测定，请准备 96 孔平底实验板。将药物浓度的孔专用于对照细胞和不含细胞的对照培养基。
准备地塞米松或 DEX 的药物稀释范围。从每种 dex 稀释液中加入 30 μL 到 96 孔板的适当孔中。确保将每种浓度一式三份。
收获指数增长的白血病细胞，并以最佳接种浓度重新悬浮。向每个含有药物溶液或生长培养基的孔中加入 120 μL 细胞悬液，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 72 小时。孵育步骤后，使用重复移液器向每个孔中加入 15 μL MTT 试剂。
用平板摇床摇动板 5 分钟，最高每分钟摇动 900 次。将板放回 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中，再孵育 4 到 6 小时。孵育后，确保彻底重新悬浮甲臜晶体，因为吸光度值取决于化合物的适当溶解。
向每个孔中加入 150 微升酸化异丙醇，并与多通道移液器充分混合，以彻底重悬所有甲臜晶体。使用酶标仪，测定 540 和 720 纳米处的光密度或 OD，通过校正背景来确保准确测量 OD.To 对胰腺癌细胞进行 SRB 测定，准备 96 孔平底实验板。使用多通道移液器，将指数期生长的胰腺癌细胞在 96 孔平底板中以适当的密度在 100 微升培养基中一式三份接种。
加入 100 微升培养基至纯培养基孔，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育过夜，以确保细胞正确粘附到板上。使用多通道移液器，将每个稀释液中的 100 微升加入 96 孔板的适当孔中。确保每种浓度一式三份。
在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 72 小时。接下来，使用多通道移液器向孔中加入 25 微升冷 TCA 溶液。将板在 4 摄氏度下孵育至少 60 分钟，以沉淀并固定孔底部的蛋白质。
去除培养基清空板，并在纸巾上短暂干燥。用自来水清洗五次，然后清空板并在室温下干燥。使用重复移液管每孔加入 50 μL SRB 溶液，并在室温下染色 15 分钟。
然后，通过去除 SRB 污渍来清空板。用 1% 乙酸清洗板 4 次后，清空板并在室温下干燥。使用多通道移液器每孔添加 150 μL Tris 溶液，并在板振荡器上混合 3 分钟，最高至每分钟 900 次摇动。
读取 540 纳米处的光密度。以 300 倍 g 的离心速度离心样品 3 分钟。去除上清液后，使用市售的硅胶膜离心柱提取总 mRNA。
使用 UV-Vis 分光光度计测定总 RNA 的浓度和纯度。要制备测序文库，每个样品使用 2 μg 总 mRNA。根据制造商的说明遵循 mRNA 文库制备方案。
使用生物分析仪将文库合并到单个样品中，最终浓度为 10 nmol/L 后，使用具有单读长 100 碱基对模式的高通量测序系统。按照文本方案中的描述设计所有引物。对于第一链 cDNA 合成，通过在用无菌水稀释 1 至 5 的反应缓冲液中使用每微升 200 单位的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，构建 1 微克分离的 RNA 到 cDNA 的逆转录。
要进行 RT-PCR 反应，请在 PCR 反应混合物中加入 1 μL cDNA，并将试管放入热循环仪中。按照文本协议中的说明运行程序。PCR 后，将样品上样到 1% 琼脂糖凝胶中，并在电泳系统中以 100 伏特的 TBE 缓冲液运行凝胶约 30 分钟。
为避免交叉污染，请在进行 qRT-PCR 检测时使用过滤嘴。为了进行 qRT-PCR，为要检测的每个特定剪接变体以及看家基因准备花青绿 PCR 反应混合物。将预混液上样到白色 96 孔板上，并为每个样品准备副本。
在将板放入热循环仪中之前，向每种混合物中加入 5 微升用水稀释 10 倍的 cDNA。此处描述了通过白血病细胞的 MTT 测定和胰腺癌细胞的 SRB 测定测定的生长抑制曲线。地塞米松耐药和吉西他滨耐药细胞的曲线向右移动，表明与亲本敏感细胞相比生长抑制。
使用生物分析仪 DNA 芯片测定所有细胞系的 cDNA 文库的浓度和质量。电泳图显示大约 300 个碱基对处的荧光峰，这表明后续 RNA 测序程序的质量良好。候选基因 DDX5 的短读长可以可视化为鱼片图，其中连接线代表剪接连接。
DDX5 转录本显示与糖皮质激素耐药细胞系 CEM-C3 和 CEM-R5 相比，外显子 12 和 CEM 野生型和 CEM/R30dm 细胞的使用存在差异。通过对位于选择性剪接外显子上游和下游的引物对和产量的选定基因进行 RT-PCR 来验证 RNA 测序结果。此处显示了 DDX5 基因的差异剪接。
使用亚型特异性反向引物通过 qRT-PCR 测定对差异剪接转录物进行定量，证实了 DDX5 δ 外显子 12 剪接变体和特异性糖皮质激素耐药亚系的特异性下调。一旦掌握，这项技术可以在 3 到 4 周内完成。在尝试此过程时，请务必记住将 RNA 样品保存在冰上，以避免降解。
按照此过程，可以执行其他方法，如新剪接变体的异位过表达。这将回答其他问题，例如交替剪接谱对耐药性的功能影响。这项技术可以为分子药理学领域的研究铺平道路，以探索耐药性的全基因组决定因素。
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概述
本协议探讨了异常剪接与固体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的耐药性之间的关联。通过RNA-seq分析转录组谱，旨在加深对化疗耐药机制的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子药理学
- 化疗耐药性
- 转录组分析
背景
- 异常剪接可以影响耐药性。
- 了解转录后机制对于改善治疗结果至关重要。
- 本研究结合细胞毒性筛选和下一代测序。
- 洞见可以应用于各种系统，包括患者样本。
研究目的
- 调查分子水平上的耐药机制。
- 验证与耐药相关的候选基因。
- 改善耐药性的早期检测。
使用的方法
- 转录组分析的RNA测序（RNA-seq）。
- 基因验证的定量逆转录PCR（qRT-PCR）。
- 细胞毒性筛选协议。
- 固体肿瘤和血液系统恶性肿瘤体外模型的分析。
主要结果
- 确定了参与耐药的关键基因。
- 建立了验证转录组数据的可靠方法。
- 对耐药的全基因组决定因素的洞见。
- 对原发患者样本和异种移植的潜在应用。
结论
- 本协议增进了对化疗失败机制的理解。
- 它为未来的耐药研究提供了框架。
- 结合技术可以导致改进的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
RNA-sequencing of in vitro cancer models enables systematic detection of novel splice variants associated with drug resistance, addressing a critical bottleneck in oncology drug discovery. By integrating transcriptomic profiling with cytotoxicity assays, this workflow enhances predictive confidence in identifying post-transcriptional mechanisms that drive resistance. These insights inform early portfolio triage and support risk-adjusted advancement of therapeutic candidates targeting resistant disease phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of post-transcriptional mechanisms underlying drug resistance in cancer models.
- Supports functional target validation by linking splice variant expression to resistance phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate targets implicated in chemotherapy failure.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets with translational relevance.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vitro systems for quantitative assessment of drug response and resistance.
- Standardizes cytotoxicity and transcriptomic assays for reproducible detection of resistance-associated variants.
- Enables scalable screening of candidate genes and splice variants across multiple cancer models.
- Provides quantitative outputs for robust comparison of parental and resistant cell lines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns splice variant detection with disease-relevant resistance mechanisms observed in patient-derived samples.
- Supports continuity from discovery-stage findings to preclinical validation of resistance biomarkers.
- Informs risk-adjusted decisions for advancing compounds targeting splicing-mediated resistance.
- Enables exploration of genome-wide determinants of resistance for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through lead identification by combining cytotoxicity screening, RNA-seq, and qRT-PCR validation in cancer models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing-driven resistance mechanisms and clarifies functional pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for resistance phenotypes and splice variant expression.
- Analytics: Provides transcriptomic and qRT-PCR data for comparative analysis of drug-sensitive and resistant lines.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to patient samples and xenograft models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for resistance mechanism discovery across oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance mechanism identification and target validation.
- Operational Value: Standardizes multi-modal assays for reproducibility and scalability in discovery workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage attrition due to unanticipated resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of assets targeting splicing-mediated resistance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-seq, qRT-PCR, and bioinformatics analysis of splice variants.
- Demands access to high-throughput sequencing platforms and validated cytotoxicity assays.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and data analysis protocols.
- Adaptable to primary patient samples and xenograft models with appropriate optimization.
- Dependent on rigorous RNA quality control to ensure reliable transcriptomic outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Characterization of Drug Resistance Profiles through Cytotoxicity Assays
5:01
RNA Isolation and Library Preparation for RNA-sequencing
5:55
Validation of the Results by RT-PCR and qRT-PCR Assays
7:21
Results: Detection of Differential Splicing Events in Chemotherapy-resistant Cell Lines Compared to Parental Wild-type by Using RNA-sequencing
9:07
Conclusion
