低细胞数量样品透射电镜分析的替代制样方法

本实验的总体目标是高效且可重复地制备细胞数量较少的样品，以进行透射电子显微镜（TEM）分析。该方法有助于揭示真实细胞的全部结构，以及在生物医学领域中更接近生理状态的细胞环境。该技术的主要优势在于，可从少量细胞中以可重复的方式获得定性和定量的结果。

首先，利用分选技术将 10,000 个造血干细胞（HSC）分选至一个含有 600 微升含 10% 胎牛血清的伊科夫改良杜尔贝科培养基（isocoves modified dulbecco medium）的 1.5 mL 微量离心管中。使用配备摆动桶转子的离心机，在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟，使分选后的 HSC 沉淀。

轻柔吸去培养基，仅保留 200 微升。为固定细胞，加入 0.2 mL 新鲜配制的 2 倍固定液，在室温下孵育 1 小时。随后加入 600 微升 0.1 摩尔的卡可基酸盐缓冲液洗涤细胞。

再次离心细胞，此次温度设为30摄氏度。离心后，除去上清液，仅保留200微升缓冲液，然后加入200微升含2毫克/毫升伊文思蓝的卡可基酸盐缓冲液，在室温下孵育20分钟以染色细胞。用600微升0.1摩尔卡可基酸盐缓冲液洗涤细胞三次。

然后用剩余的200微升缓冲液重悬细胞，再将细胞悬液转移至0.5 mL离心管中。此步骤中，管内应可见细胞沉淀。使用台式离心机，以1,000 × g离心10分钟。

然后轻轻移除上清液，避免扰动现已可见的微小细胞沉淀，管中保留 50 微升缓冲液。通过将 200 毫克低熔点琼脂糖加入 5 毫升 0.1 摩尔卡考基late缓冲液中，配制 4% 琼脂糖溶液（使用 15 mL 离心管）。将该离心管转移至盛有沸水的 100 mL 玻璃瓶中，使琼脂糖完全融化。

向细胞悬液管中加入 200 微升琼脂糖溶液。立即在 1,000 × g、30 摄氏度条件下离心 10 分钟。确认细胞已沉淀至管底的半固体琼脂糖中后，立即将管子转移至 4 摄氏度或冰上放置 20 分钟，使琼脂糖凝固。

使用27号针头，将含有细胞沉淀的凝固琼脂糖小心转移至含有0.1摩尔卡考基缓冲液的35 mL塑料培养皿中。用解剖刀将含有细胞沉淀的凝固琼脂糖修整成一块大小约为1至2毫米的组织块，然后将其转移至新的1.5 mL离心管中。

加入 600 微升 0.1 摩尔的卡可基酸盐缓冲液，使用移液器添加并移除缓冲液，洗涤琼脂糖细胞沉淀。去除琼脂糖细胞沉淀中的缓冲液后，在通风橱内穿戴防护服和手套的情况下，加入 1 毫升 1% 四氧化锇溶液。将细胞沉淀在 4 摄氏度下孵育 1 小时。

孵育结束后，将样品洗涤三次，转移至带盖的20 mL玻璃闪烁瓶中，随后用乙醇梯度进行脱水处理。

然后用乙醇中浓度递增的LX 112树脂对样品进行渗透处理，再在100%树脂中孵育两次，每次60分钟。使用镊子将样品小心转移至金字塔尖端形状的橡胶模具底部，并在样品上方加入纯树脂以充满模具。将样品在60摄氏度下孵育72小时，使树脂聚合。

树脂聚合后，通过扭转橡胶模具将其从模具中取出。在聚合的树脂锥体中应可见一小团黑色细胞。使用氰基丙烯酸酯将聚合后的树脂锥体粘附到切片用的载柱上。

将样品块安装到超薄切片机上后，使用剃须刀片和金刚石刀修整金字塔形样品块，将其修成一个短而宽的梯形，使样品块的顶部和底部相互平行，侧面角度均匀。然后使用金刚石刀在细胞沉淀物周围修块，去除细胞沉淀物琼脂糖块周围的塑料部分。用超薄切片机切出1 µm厚的切片，并用睫毛工具和金属环将切片从水槽转移至玻片上。

然后将切片置于37摄氏度的加热板上干燥。使用带有0.22微米滤器的注射器，向切片滴加一滴甲苯胺蓝溶液，并孵育3分钟。接着用蒸馏水漂洗切片，让切片自然干燥。

干燥后，在光学显微镜下检查切片以确定细胞的位置。接着使用金刚石刀切割超薄切片。然后用睫毛工具将2至3个切片从水槽转移至200目载网上，并放入玻璃培养皿中。

将带有网格的培养皿置于30摄氏度的加热板上，干燥30分钟。滴加1%醋酸铀溶液，室温孵育10分钟，对网格进行染色。随后，用蒸馏水冲洗六至八次。

在室温下用 Reynolds 柠檬酸铅染色 5 分钟，然后冲洗 6 至 8 次。将含有载网的玻璃培养皿转移至 37 摄氏度的加热板上，以干燥切片。最后，在 87 千伏电压下使用电子显微镜分析切片。

此处低倍镜下显示的是来自含有微小细胞沉淀块的半薄甲苯胺蓝染色切片，可确认存在细胞簇。此高倍镜图像显示了细胞完整的形态结构。该图代表了利用醋酸铀和柠檬酸铅染色的超薄切片在透射电子显微镜下观察到的细胞簇的整体视野。

此处展示了一个单个的造血干细胞（HSC），表明细胞的形态和超微结构保存良好。单个HSC的高倍放大电子显微照片显示了细胞内超微结构的详细情况。此外，高倍放大图像清晰呈现了线粒体等亚细胞器的结构和完整性，表明其保存状态良好。

一旦掌握，该技术可在五到六小时内完成；而对于高级的蓝色染色及琼脂糖包埋，随后进行常规透射电镜处理，若操作得当，则需要五到六天时间。因此，在观看本视频后，您将对如何从实际细胞制备样品用于透射电镜分析有一个全面的了解。